黃華毅 扈麗麗 陳劉生 趙丹陽 黃詠槐

(廣東省林業(yè)科學(xué)研究院/廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510520)

楊樹是我國防風(fēng)固沙、水土保持、農(nóng)田保護(hù)和維護(hù)生態(tài)平衡的主要樹種之一，具有速生豐產(chǎn)的特點(diǎn)。近年來，楊樹腐爛病等病害的發(fā)生呈逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害了楊樹的健康，阻礙了楊樹產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。楊樹腐爛病是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的枝干性病害，其病原菌是金黃殼囊孢菌Cytospora chrysosperma，有性型為Valsa sordida(Nits.)，在我國東北、西北、華北等地區(qū)都有分布，發(fā)病時(shí)枝干塌陷腐爛，形成環(huán)斑，嚴(yán)重時(shí)造成整株死亡。楊樹腐爛病的發(fā)病地區(qū)發(fā)病率一般能達(dá)到50%，有些調(diào)查甚至能達(dá)到90%，特別是在春季，可以造成大面積的楊樹林死亡，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。

目前，楊樹腐爛病的防治還是以物理防治、化學(xué)防治，同時(shí)結(jié)合抗病品種的選育為主?；瘜W(xué)防治具有見效快、防治效果好的特點(diǎn)，結(jié)合物理防治能進(jìn)一步提高防治效果[3]。使用化學(xué)藥劑對(duì)環(huán)境污染大，病原菌易產(chǎn)生抗藥性，施藥不當(dāng)還容易引起楊樹產(chǎn)生藥害，而利用自然界存在的微生物資源有效抑制病原菌的生長從而防治植物病害，是目前替代或減少化學(xué)農(nóng)藥使用的重要手段之一，具有環(huán)境友好和安全性高的優(yōu)點(diǎn)[4]。以往研究表明，很多類型的微生物資源能有效抑制楊樹腐爛病病原菌金黃殼囊孢菌的生長，具有進(jìn)一步開發(fā)利用的潛力，如鱗柄白鵝膏Amania virosa、細(xì)鱗環(huán)柄菇Leoiota clypeolaria、絨白乳菇Lactarius vellereus、長枝木霉Trichoderma longibrachiatum、綠木霉Trichoderma virens、吡咯伯克霍爾德氏菌Burkholderia pyrrocinia、解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens、蘇云金芽孢桿菌B.pumilus、短小芽孢桿菌B.pumilus、萎縮芽孢桿菌B.atrophaeus、枯草芽孢桿菌B.subtilis等[5-12]。

拮抗菌株SY-15 是從楊樹根際土壤中分離獲得的一株拮抗細(xì)菌，前期研究表明該菌株與金黃殼囊孢菌對(duì)峙培養(yǎng)后表現(xiàn)出了較強(qiáng)的拮抗活性。本研究基于傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)的手段對(duì)拮抗菌株SY-15 進(jìn)行了鑒定，并進(jìn)一步分析了其對(duì)多種植物病原真菌的抑菌活性，為該菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用和楊樹腐爛病的生物防治奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試拮抗菌株SY-15 分離自健康楊樹根際土壤，供試植物病原真菌：金黃殼囊孢菌、迂回殼囊孢菌C.ambiens和黑腐皮殼菌C.mali均由北京林業(yè)大學(xué)提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基用于細(xì)菌菌株的平板培養(yǎng)和斜面保存；LB 液體培養(yǎng)基：用于細(xì)菌菌株菌液的制備；優(yōu)化培養(yǎng)基（葡萄糖22.64 g·mL-1，蛋白胨11.93 g·mL-1， 大豆粉5.00 g·mL-1，KH2PO41.00 g·mL-1，MgSO4·7H2O 0.50 g·mL-1，NH4Cl 3.00 g·mL-1，Na2HPO41.00 g·mL-1，酵母浸粉1.86 g·mL-1，pH 7.0～7.2）[11]：用于芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 拮抗菌株SY-15 的鑒定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13-14]的方法對(duì)菌株的形態(tài)學(xué)指標(biāo)和生理生化特性進(jìn)行鑒定，包括革蘭氏染色、接觸酶、淀粉水解、厭氧生長、明膠液化等指標(biāo)。

1.2.3 16S rDNA 基因序列測(cè)定和比對(duì)分析 采用菌落PCR 法擴(kuò)增16S rDNA[15]：挑取單菌落至裝有200 μL 雙蒸水的EP 管中，100 °C 煮沸10 min后，12 000 r·min-1、2 min 離心取上清液，即為菌株的基因組DNA。以提取的菌株基因組DNA 為模板，利用引物63f：5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′，1387r：5′-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3′[16]，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20 μL，含有10×TaqE 緩沖液2 μL、dNTP 1.6 μL、正反向引物各1 μL、DNA Taq 聚合酶0.1 μL、DNA 模板1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增條件：94 °C 4 min；94 °C 1 min，55 °C 1 min，72 °C 1.5 min，35 個(gè)循環(huán)；72 °C 10 min。引物合成和測(cè)序由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

采用BLAST 方法在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索和同源性比較，采用ClustalX 1.8 進(jìn)行序列匹配分析，通過MEGA 5.0 軟件，采用Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育，用Bootstrap(重復(fù)抽樣1 000 次)分析評(píng)估樹的穩(wěn)定性。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

1.3.1 拮抗菌株SY-15 無菌培養(yǎng)濾液抑菌活性測(cè)定 挑取活化后的SY-15 單菌落，接種至盛有100 mL LB 培養(yǎng)液的三角瓶中（規(guī)格250 mL），于28 °C、200 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)24 h 得到種子液。按1%（v·v-1）的量將種子液接入裝有100 mL 優(yōu)化培養(yǎng)基的三角瓶（規(guī)格500 mL）中，于28 °C、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)5 d。4 °C、10 000 r·min-1的條件下離心30 min 后收集上清液，再用0.22 μm 微孔濾膜過濾，得到無菌培養(yǎng)濾液。

無菌培養(yǎng)濾液對(duì)病原真菌的抑菌活性的測(cè)定采用帶藥平板法[17]。將SY-15 的無菌培養(yǎng)濾液以1 ∶10(v·v-1)的比例與加熱冷卻至40～50 °C 的PDA 混合，倒平板，在不同的平板中央分別接入直徑6 mm的病原真菌菌餅，28 °C 倒置培養(yǎng)，每隔12 h 測(cè)量病原菌菌落直徑，直至對(duì)照組菌落直徑長至培養(yǎng)皿直徑的3/4 以上為止。以不加無菌培養(yǎng)濾液的平板作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，采用十字交叉法測(cè)量病原菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。抑菌率的計(jì)算采用如下公式：抑菌率(%)=[(對(duì)照組擴(kuò)展直徑—處理組擴(kuò)展直徑)/對(duì)照組擴(kuò)展直徑]×100。

1.3.2 拮抗菌株SY-15 產(chǎn)真菌細(xì)胞壁裂解酶特性測(cè)定 將活化后的SY-15 單菌落分別接種至脫脂牛奶培養(yǎng)基、茯苓粉培養(yǎng)基、膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基、羧甲基纖維素培養(yǎng)基和脂酶檢測(cè)培養(yǎng)基平板中央，然后將平板倒置培養(yǎng)于30 °C 恒溫培養(yǎng)箱中，連續(xù)觀察7 d。觀察脫脂牛奶培養(yǎng)基、茯苓粉培養(yǎng)基和膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基平板中央菌落周圍有無透明圈出現(xiàn)，出現(xiàn)透明圈則說明菌株能產(chǎn)生蛋白酶、β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶，反之，則說明不能產(chǎn)生[9,13]；將濃度為1 mg·mL-1的剛果紅染液對(duì)羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板進(jìn)行染色，靜置染色15 min 后，用移液槍緩慢吸去剛果紅染液，再利用適量的濃度為1 mol·L-1的NaCl 溶液洗滌平板，洗滌15 min 后靜置5 min，最后觀察羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板中拮抗菌菌株周圍是否出現(xiàn)透明圈，出現(xiàn)則說明有纖維素酶產(chǎn)生，反之，則說明沒有纖維素酶產(chǎn)生[18]；觀察脂酶檢測(cè)培養(yǎng)基平板中生長的拮抗菌菌落周圍是否出現(xiàn)模糊的暈圈，出現(xiàn)則說明有脂酶產(chǎn)生，反之，則說明無脂酶產(chǎn)生[13]。

1.3.3 拮抗菌株SY-15 揮發(fā)性氣體抑菌活性測(cè)定 采用二分皿法測(cè)定揮發(fā)性氣體的抑菌活性[17]。每隔12 h 測(cè)量病原菌菌落直徑，直至對(duì)照組菌落直徑長至培養(yǎng)皿半徑的3/4 以上為止，計(jì)算相對(duì)抑菌率。相對(duì)抑菌率的計(jì)算采用如下公式：相對(duì)抑菌率(%)=[(對(duì)照組擴(kuò)展直徑—處理組擴(kuò)展直徑)/對(duì)照組擴(kuò)展直徑]×100。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 和SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株SY-15 的鑒定

拮抗菌株SY-15 在LB 平板上呈灰色或灰白色，不透明，菌落圓形、光滑，邊緣隆起、完整，不產(chǎn)色素。菌體為桿狀，大小約(1.02～2.70)μm×(3.55～7.66) μm，有芽孢，具鞭毛，革蘭氏陽性菌。兼性厭氧型，能夠利用葡萄糖、D-木糖和檸檬酸鹽，能水解葡萄糖產(chǎn)氣，明膠液化，硝酸鹽還原、硫化氫反應(yīng)、氧化酶反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、Voges-Proskauer 反應(yīng)、卵磷脂酶活性、淀粉水解均呈陽性，而吲哚反應(yīng)、甲基紅反應(yīng)和苯丙氨酸脫氨酶活性均呈陰性。菌株能在溫度范圍10～45 °C，pH范圍4～8 和NaCl 濃度范圍0.2%～5%之間生長（表1）。菌株SY-15 的16S rDNA PCR 擴(kuò)增得到一段大小為1 307 bp 的基因片段，系統(tǒng)發(fā)育分析（圖1）結(jié)果顯示，菌株SY-15 與Bacillus subtilisJK0316S（KF135455.1）接近。綜合菌株SY-15 的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rDNA 序列分析結(jié)果，最終將菌株SY-15 鑒定為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。

圖1 菌株SY-15 16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Phylogenetic tree of strain SY-15 based on 16S rDNA sequence analysis

表1 菌株SY-15 的培養(yǎng)條件和生理生化特性Table 1 Culture conditions and physiology-biochemical characteristics of strain SY-15

2.2 拮抗菌株SY-15 無菌培養(yǎng)濾液的抑菌活性

拮抗菌株SY-15 無菌培養(yǎng)濾液對(duì)3 種植物病原真菌的抑菌活性測(cè)定結(jié)果顯示，SY-15 的無菌培養(yǎng)濾液均能明顯抑制金黃殼囊孢菌、迂回殼囊孢菌和黑腐皮殼菌菌絲的生長（圖2A）。在處理12 h時(shí)，拮抗菌株SY-15 的無菌培養(yǎng)濾液表現(xiàn)出的抑菌活性最強(qiáng)，隨著處理時(shí)間的延長，無菌培養(yǎng)濾液對(duì)金黃殼囊孢菌的抑菌活性較為穩(wěn)定，對(duì)迂回殼囊孢菌和黑腐皮殼菌的抑菌活性呈現(xiàn)先減弱后保持穩(wěn)定的特點(diǎn)，最后在處理60 h 時(shí)，SY-15 的無菌培養(yǎng)濾液對(duì)金黃殼囊孢菌、迂回殼囊孢菌和黑腐皮殼菌的抑菌率分別達(dá)到88.89%、60.39%和53.02%（圖3）。

圖2 拮抗菌株SY-15 的無菌培養(yǎng)濾液（A）和揮發(fā)性氣體（B）在不同處理時(shí)間對(duì)植物病原真菌的抑菌活性Figure 2 Antifungal activities of sterile culture filtrate （A） and volatiles （B） of strain SY-15 in different treatment times against fungal phytopathogens

圖3 拮抗菌株SY-15 的無菌培養(yǎng)濾液對(duì)植物病原真菌的抑菌活性（60 h）Figure 3 Anifungal activities of sterile culture filtrate of strain SY-15 against fungal phytopathogens （60 hours）

2.3 拮抗菌株SY-15 產(chǎn)細(xì)胞壁裂解酶特性

5 種細(xì)胞裂解酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，只有蛋白酶（圖4A）和纖維素酶（圖4B）的檢測(cè)平板中菌體周圍產(chǎn)生透明圈，而其他裂解酶檢測(cè)的平板中菌體周圍未見透明圈或暈圈出現(xiàn)，分別說明了拮抗菌株SY-15 能產(chǎn)生纖維素酶和蛋白酶，而不能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶和脂酶。

圖4 拮抗菌株SY-15 產(chǎn)生蛋白酶（A）和纖維素酶（B）Figure 4 Production of protease（A） and cellulase（B） by strain SY-15

2.4 拮抗菌株SY-15 揮發(fā)性氣體的抑菌活性

拮抗菌株SY-15 揮發(fā)性氣體對(duì)3 種植物病原真菌的抑菌活性測(cè)定結(jié)果顯示，SY-15 的揮發(fā)性氣體均能明顯抑制金黃殼囊孢菌、迂回殼囊孢菌和黑腐皮殼菌菌絲的生長（圖2B）。拮抗菌株SY-15的揮發(fā)性氣體能完全抑制金黃殼囊孢菌的菌絲生長，在不同處理時(shí)間對(duì)迂回殼囊孢菌的抑菌活性較為穩(wěn)定，而對(duì)黑腐皮殼菌的抑菌活性呈現(xiàn)先升后降的變化，最終在處理36 h 時(shí)，SY-15 的揮發(fā)性氣體對(duì)金黃殼囊孢菌、迂回殼囊孢菌和黑腐皮殼菌的抑菌率分別達(dá)到100%、76.98%和63.41%（圖5）。

圖5 拮抗菌株SY-15 的揮發(fā)性氣體對(duì)植物病原真菌的抑菌活性（36 h）Figure 5 Anifungal activities of volatiles of strain SY-15 against fungal phytopathogens（36 hours）

3 結(jié)論與討論

芽孢桿菌屬是目前研究和應(yīng)用最為廣泛的生物防治菌株資源之一，其資源廣泛分布于自然界的各種環(huán)境中，生長速度快、營養(yǎng)需求簡(jiǎn)單、抗逆性強(qiáng)、易于在植物體表面定殖與繁殖、抑菌譜廣、對(duì)人畜無害、不污染環(huán)境，且制劑生產(chǎn)的工藝簡(jiǎn)單、制劑穩(wěn)定、儲(chǔ)存時(shí)間長、施用方便，不僅符合人們對(duì)環(huán)境和健康的需求，而且為農(nóng)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了保障[4]。目前已有多種類型的芽孢桿菌被發(fā)現(xiàn)能有效抑制楊樹腐爛病病原菌金黃殼囊孢菌的生長。徐明等[10]通過篩選獲得了4 株能抑制金黃殼囊孢菌生長的芽孢桿菌，分別為1 株枯草芽孢桿菌，2 株解淀粉芽孢桿菌和1 株蘇云金芽孢桿菌。金海強(qiáng)等[19]研究報(bào)道了一株解淀粉芽孢桿菌Y-S-Y12 對(duì)金黃殼囊孢菌具有高效抑菌活性。REN 等[8]篩選獲得了一株楊樹內(nèi)生拮抗細(xì)菌短小芽孢桿菌JK-SX001 能有效抑制金黃殼囊孢菌的生長。前期對(duì)峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明拮抗菌株SY-15 能有效抑制金黃殼囊孢菌的生長，本研究基于形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和16S rDNA 序列分析將菌株鑒定為SY-15 為枯草芽孢桿菌。

大量的研究報(bào)道表明芽孢桿菌屬的拮抗菌具有很好的抑菌廣譜性，同時(shí)通過產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)來抑制或殺死病原菌是芽孢桿菌表現(xiàn)出抑菌活性的重要機(jī)制之一，包括通過核糖體途徑合成的蛋白類抑菌物質(zhì)，通過非核糖體途徑合成的脂肽類物質(zhì)和揮發(fā)性氣體，其中蛋白類物質(zhì)中還包含了一些細(xì)胞壁裂解酶類，已報(bào)道主要有幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶和β-1,3-葡聚糖酶，這些細(xì)胞壁裂解酶的作用機(jī)制是通過裂解病原菌細(xì)胞壁，導(dǎo)致病原菌細(xì)胞裂解，從而導(dǎo)致病原菌細(xì)胞死亡[4]。田愛霞[20]研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌B.cereusTJB-8 能有效抑制金黃殼囊孢菌、細(xì)極鏈格孢菌Alternaria tenuissima、膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum、禾谷鐮刀菌F.graminearum和立枯絲核菌Rhizoctonia solani，其能產(chǎn)生具有抑菌活性的蛋白類物質(zhì)、脂肽類物質(zhì)和揮發(fā)性氣體，能產(chǎn)生β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶。黃華毅等[21]報(bào)道發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌STO-12 產(chǎn)生的蛋白類物質(zhì)、脂肽類物質(zhì)和揮發(fā)性氣體對(duì)細(xì)極鏈格孢菌、膠孢炭疽菌和楊樹腐爛病菌的生長均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該菌株能產(chǎn)生纖維素酶和蛋白酶。HUANG 等[12]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌ZSH-1 的無菌培養(yǎng)濾液、蛋白類物質(zhì)、脂肽類物質(zhì)和揮發(fā)性氣體對(duì)7 種植物病原真菌（膠孢炭疽菌、尖孢鐮刀菌、細(xì)極鏈格孢菌、金黃殼囊孢菌、葡萄座腔菌、毛霉和犁頭霉）均具有不同的抑菌活性，同時(shí)其能產(chǎn)生纖維素酶、β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶。本研究結(jié)果表明枯草芽孢桿菌SY-15 的無菌培養(yǎng)濾液均能明顯抑制金黃殼囊孢菌、迂回殼囊孢菌和黑腐皮殼菌菌絲的生長，說明該菌株能產(chǎn)生非揮發(fā)性氣體的抑菌活性物質(zhì)來抑制多種植物病原真菌的生長，這些抑菌活性物質(zhì)很有可能也是蛋白類和脂肽類物質(zhì)，同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)SY-15 能產(chǎn)生纖維素酶和蛋白酶，進(jìn)一步說明了SY-15 能產(chǎn)生蛋白類的細(xì)胞壁裂解酶。此外，通過二分皿法也證明了菌株SY-15 能產(chǎn)生具有抑菌活性的揮發(fā)性氣體，其能有效抑制金黃殼囊孢菌、迂回殼囊孢菌和黑腐皮殼菌的生長，其中對(duì)金黃殼囊孢菌的抑菌活性達(dá)到100%。

本研究對(duì)拮抗菌株SY-15 的種類進(jìn)行了鑒定，并進(jìn)一步分析了其抑菌活性，研究結(jié)果表明，基于形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和16S rDNA 序列分析，最終將拮抗菌株SY-15 鑒定為枯草芽孢桿菌。拮抗菌株SY-15 的無菌培養(yǎng)濾液和揮發(fā)性氣體均能有效抑制金黃殼囊孢菌、迂回殼囊孢菌和黑腐皮殼菌的菌絲生長。此外，還發(fā)現(xiàn)菌株SY-15能產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶。研究結(jié)果顯示出了拮抗菌株SY-15 的較高研究和應(yīng)用價(jià)值，是一株潛在的防治楊樹腐爛病及其他植物病害的生防菌株資源。本研究雖然初步分析了枯草芽孢桿菌SY-15的抑菌活性和抑菌活性物質(zhì)，但對(duì)于其具體的抑菌機(jī)理及抑菌活性物質(zhì)種類目前還不清楚，有待后續(xù)開展深入的研究。