胡明超，王強，吳嘉旭，俞文淵(南京醫(yī)科大學附屬江蘇盛澤醫(yī)院普外科&南京醫(yī)科大學康達學院盛澤臨床醫(yī)學院，江蘇蘇州 215228)

截止目前為止，大腸癌(colorectal cancer, CRC)仍然維持著高發(fā)生率以及高死亡率[1]。血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)和糖類抗原19-9(carbohydrate antigen19-9，CA19-9)是預測和評估大腸癌預后的常用生物學標志物[2]。然而，CEA和CA19-9作為診斷和監(jiān)測大腸癌生物學標志物的敏感性和特異性仍然較低[3]。因此，尋找具有高度敏感性和特異性的生物學標志物，用于改善腫瘤的診療并進行預后評估仍然是目前研究的重點。腺瘤性結腸息肉病基因(adenomatous polyposis coli,APC)已在結腸癌、肝癌等多種惡性腫瘤中得到了廣泛的研究[4-5]。APC2是其同源基因，位于染色體19p13.3上[6]，并被證實在多種人類癌癥進展中發(fā)揮重要作用，包括視網(wǎng)膜母細胞瘤(RB)腫瘤、淋巴細胞白血病和卵巢癌等[7-8]。然而，目前國內仍缺乏關于APC2基因與大腸癌的相關研究。本研究基于癌癥基因圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫挖掘APC2基因在結腸癌中的表達及預后評估作用，以期為進一步闡明APC2基因在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源 從TCGA公開數(shù)據(jù)庫(https://cancergenome.nih.gov,訪問日期：2021年3月8日)下載所有結腸腺癌(colon adenocarcinoma, COAD)癌組織和癌旁組織APC2mRNA的轉錄組表達數(shù)據(jù)以及相對應的每例患者的臨床病理及預后資料[9-10]，具體包括患者年齡、性別、腫瘤浸潤深度分期(T)、淋巴結分期(N)、轉移分期(M)、TNM分期和患者總生存期(overall survival, OS)。

1.2相關資料整理 下載的TCGA數(shù)據(jù)中包含APC2基因表達量的COAD癌組織455例以及癌旁組織41例，對其進行正態(tài)性檢驗并分析二者之間是否存在表達差異。以腫瘤組織中APC2基因表達量的中位數(shù)(0.79)為截斷值，分為APC2基因表達組(228例)和低表達組(227例)，以此分別評估APC2基因的表達情況在COAD中的預后價值。

1.3蛋白質相互作用網(wǎng)絡構建 利用String在線工具(https://string-db.org/)進行APC2基因編碼蛋白質的相互作用網(wǎng)絡(protein-protein interaction, PPI)分析，并設定組織來源為”Homo sapiens”，然后進行PPI網(wǎng)絡構建。

2 結果

2.1APC2基因在COAD癌組織以及癌旁組織中的差異表達 TCGA數(shù)據(jù)庫中下載的455例COAD患者癌組織APC2基因的表達量(0.87±0.42)顯著低于41例癌旁組織(1.11±0.22)，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.58，P<0.05)。此外，從公共網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫GEPIA (Gene Expression Profiling Interactive Analysis, http://gepia.cancer-pku.cn)下載APC2基因在COAD中表達量的箱式圖，證實APC2基因在COAD癌組織中的表達量低于癌旁組織，見圖1。

圖1 APC2基因在COAD癌組織和癌旁組織中表達量的箱式圖

2.2APC2基因對COAD的診斷價值 以APC2基因在TCGA數(shù)據(jù)庫中COAD癌組織和癌旁組織中的表達量繪制ROC曲線，結果發(fā)現(xiàn)APC2基因對COAD具有良好的診斷價值(AUCROC=0.739 1，95%CI:0.685 5～0.792 6，P<0.000 1)，見圖2。

圖2 APC2基因對COAD的ROC曲線分析結果

2.3APC2基因表達與COAD患者臨床病理參數(shù)的相關性 對下載的455例COAD患者的TCGA數(shù)據(jù)集內容進行整合與統(tǒng)計學分析，結果證實APC2基因低表達的COAD患者具有更少數(shù)量的淋巴轉移，更優(yōu)的TNM分期以及更高的生存率(P<0.05)，而APC2基因的表達量與患者的性別、年齡、腫瘤侵犯深度、遠處轉移均無關，見表1。

表1 APC2基因表達與COAD患者臨床病理參數(shù)的關系[n(%)]

2.4APC2基因表達與COAD患者預后的關系 將TCGA數(shù)據(jù)庫中455例COAD患者的APC2基因表達情況及生存情況匯總，其中1例高表達患者的部分數(shù)據(jù)缺失，排除該病例后最終納入277例高表達的患者以及277例低表達的患者。如圖3所示，APC2基因的表達和COAD患者的總體生存率密切相關，APC2低表達患者的生存時間中位數(shù)明顯高于APC2高表達者(9.76年 vs 5.15年，log-rankP=0.005)。

圖3 APC2的表達和COAD患者總生存期的關系

2.5APC2相關蛋白的相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡 利用String在線分析分析得到與APC2基因編碼相應蛋白質相互作用的蛋白質網(wǎng)絡，如圖4所示，其中PPI富集P<10-16，節(jié)點數(shù)為12個，在蛋白質網(wǎng)絡中與APC2相互作用的細胞分裂周期基因16(cell division cycle gene,CDC16)、細胞分裂周期基因23(cell division cycle gene,CDC23)、細胞分裂周期基因27(cell division cycle gene,CDC27)、后期啟動復合體亞基15(anaphase promoting complex subunit,ANAPC15)，主要參與生物學過程中的有絲分裂調節(jié)，蛋白質連接的泛素化，蛋白質復合物依賴的分解代謝等過程，見表2。

圖4 APC2相關蛋白質的相互作用網(wǎng)絡

表2 與APC2表達相關的生物過程功能富集

3 討論

隨著腫瘤分子生物學的發(fā)展，CRC的靶向治療也進入了快速發(fā)展的階段，通過對代謝組學、蛋白質組學、轉錄組學等技術獲得腫瘤組織中的異常表達，并進一步以此為依據(jù)開發(fā)具有特異性的靶向藥物對CRC的治療具有重要意義。在本研究中，總共納入TCGA數(shù)據(jù)庫中455例COAD患者腫瘤組織APC2基因的表達情況以及對應的臨床病理資料，首先筆者團隊對APC2基因在COAD組織中的差異化表達進行了分析，發(fā)現(xiàn)APC2基因在COAD組織中的表達量相對正常組織呈現(xiàn)下調的狀態(tài)，而后使用GEPIA數(shù)據(jù)庫進行檢索也得到了同樣的結果，表明APC2基因低表達促進了結腸癌的發(fā)生。同樣，Xu等[11]的研究結果證實，抑制APC2基因的表達可以抑制肺癌細胞的增殖；Wu等[12]在骨肉瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，對APC2基因進行過表達可以抑制腫瘤細胞的增殖和遷移能力。上述研究結果與本研究結果均證實了APC2基因的腫瘤抑制作用。筆者又根據(jù)APC2在COAD癌組織以及癌旁組織中的表達量繪制ROC曲線，結果證實，APC2基因用于區(qū)分腫瘤組織和癌旁組織具有較高的診斷價值。此外，在APC2基因表達與COAD患者臨床病理參數(shù)以及預后分析中發(fā)現(xiàn)，低表達APC2基因的COAD患者淋巴轉移數(shù)量更少，TNM分期較早以及生存時間更長，這一發(fā)現(xiàn)與Sun等[13]的臨床研究結果剛好相反，其研究證實，APC2作為抑癌基因在結腸癌組織中高表達時，患者具有更好的預后。存在相悖結論的原因可能為Sun等[13]開展的為單中心研究，納入的患者數(shù)量有限。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)在PPI網(wǎng)絡中CDC16、CDC23、CDC27、ANAPC15均與APC2蛋白發(fā)生相互作用，分析原因其可能通過有絲分裂調節(jié)，蛋白質連接的泛素化，蛋白質復合物依賴的分解代謝等生物學過程進而影響結腸癌的發(fā)生和發(fā)展，但具體機制仍待進一步深入研究后闡明。

本研究的不足之處在于數(shù)據(jù)僅來源于TCGA數(shù)據(jù)庫中的COAD患者的RNA-Seq數(shù)據(jù)，并且部分患者的臨床信息存在少量缺失，在一定程度上影響最終的統(tǒng)計學結果。在今后研究中我們將對APC2基因進行更深入的研究，并且同時進行體內和體外實驗的驗證，力求納入更多的臨床樣本進行多方驗證，并且進一步探索APC2基因促進COAD發(fā)生和發(fā)展機制，從而為結腸癌的診斷和靶向治療提供具有高敏感性的生物學標志物。