黃莉莉，李勇，詹升華，曹磊， 呂心路(. 蘇州大學附屬兒童醫(yī)院檢驗科，江蘇蘇州5003； . 太倉市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇蘇州5400； 3. 蘇州大學附屬第一醫(yī)院 a.病理科，b.臨床免疫研究所，江蘇蘇州5006)

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，死亡率位居所有腫瘤的第二位[1]。效應T細胞的失活是腫瘤免疫逃逸的重要機制之一。研究發(fā)現(xiàn)，細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte associate protein-4，CTLA-4)、程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1，PD-1)、V結(jié)構(gòu)域Ig抑制因子(V-domain immunoglobulin suppressor of T cell activation，VISTA)等負性免疫檢查點可抑制T細胞活性，削弱T細胞抗腫瘤免疫能力。目前，CTLA-4、PD-1抑制劑已用于臨床腫瘤治療，但僅對部分患者有效。負性共刺激分子VISTA與PD-L1具有同源性，但可通過不同的信號通路抑制T細胞活性，具有作為腫瘤免疫抑制劑的潛力[2-3]。研究證實，在非小細胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌等腫瘤組織中VISTA呈高表達的腫瘤患者的預后較好[4]。目前，國內(nèi)關(guān)于VISTA在胃癌患者中的研究報道少見，本研究旨在探討VISTA在胃癌患者組織中的表達以及與IFN-γ的相關(guān)性，并分析二者與患者臨床病理參數(shù)及預后的關(guān)系，以期發(fā)掘VISTA在胃腸道腫瘤治療中的臨床價值。

1 材料與方法

1.1標本采集 組織標本采集：收集2011年1月至2012年12月于蘇州大學附屬第一醫(yī)院普外科進行胃癌切除手術(shù)且病理資料完整的268例胃癌患者的癌組織和癌旁組織(距離癌組織>5 cm)，經(jīng)石蠟包埋后用于制作腫瘤組織芯片。其中女58例，男210例，年齡(64.5±10.8)歲?；颊吲R床病理資料包括：性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、腫瘤浸潤深度、腫瘤分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移等。所有患者進行隨訪至2019年1月，共計198例患者的生存信息(失訪70例)。另收集2020年1月至12月于蘇州大學附屬第一醫(yī)院行胃癌切除手術(shù)的患者新鮮胃癌組織20例[女6例，男14例，年齡(60.5±11.4)歲]以及胃鏡摘取的淺表性胃炎組織20例[女4例，男16例，年齡(52.8±9.6)歲]，均置于液氮中保存。所有患者術(shù)前均未接受放、化療治療。且均經(jīng)臨床及病理組織學確診。血液標本采集：采集各患者清晨空腹外周靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，收集上層血清并進行分裝，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。本研究經(jīng)過蘇州大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(批準文號：2018181)，患者及家屬知情同意。

1.2主要儀器與試劑 熒光定量 PCR(qRT-PCR)檢測儀(美國Bio-Rad公司)，Dmetrix imaging system切片掃描儀(美國Tucson公司)。Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司)，熒光定量PCR檢測試劑(SYBR Premix Ex Taq Ⅱ kit，大連寶生物公司)，兔抗人VISTA多克隆抗體、兔抗人PanCK 多克隆抗體(美國Abcam公司)，兔抗人IFN-γ多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，小鼠抗人CD8、CD68、CD31、α-SMA即用型單克隆抗體(北京中杉金橋公司)，HRP標記的鼠兔通用即用型IgG二抗(上?；蚬?，IFN-γ ELISA檢測試劑盒(上海聯(lián)科生物公司)。

1.3組織芯片(TMA)的制作與獲取 取上述268例胃癌患者的組織蠟塊，經(jīng)1位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)生進行腫瘤組織和間質(zhì)組織的選點后自制組織芯片。選擇組織核心(1 mm×1 mm)置于在模塊中進行包裝，形成1個包含134個組織核心的芯片，對該芯片重新進行石蠟包埋并切割成4 μm的切片進行后續(xù)研究。

1.4免疫組化染色 將包埋制作好的組織芯片蠟塊切成3～5 μm 薄片，黏附至防脫片；65 ℃烘片1 h，置于二甲苯中浸泡10 min，重復1 次；經(jīng)無水乙醇清洗10 min，重復1次，經(jīng)90%、80%、70%梯度乙醇清洗，ddH2O 洗滌5 min；加入檸檬酸緩沖液(pH 6.0)1 L置于高壓鍋煮沸，玻片置入高壓鍋煮沸3 min，自然冷卻；ddH2O洗滌3次，每次5 min；室溫下3% H2O2溶液浸泡15 min；PBS沖洗3次，每次5 min；加入1.5% BSA封閉液濕盒內(nèi)37 ℃封閉1 h；PBS沖洗3次，每次5 min；加相應的一抗(其中兔抗人VISTA多克隆抗體，小鼠抗人CD8、CD68、CD31、α-SMA即用型單克隆抗體，兔抗人IFN-γ多克隆抗體均為1∶100稀釋；兔抗人PanCK 多克隆抗體1∶50稀釋)，濕盒內(nèi)4 ℃過夜； PBS沖洗3次，每次5 min；加入HRP標記的鼠兔通用即用型IgG二抗(1∶100稀釋)，室溫溫育1 h；PBS沖洗3次，每次5 min；DAB染液顯色；ddH2O 漂洗5 min，蘇木精復染后自來水沖洗玻片；65 ℃烤箱烘干，中性樹膠封固。以鼠IgG和兔IgG作為陰性對照，扁桃體組織作為免疫細胞標志的陽性對照組織。由2位病理醫(yī)生采用雙盲法獨立評估患者切片染色情況。免疫組化評分由染色強度和陽性細胞百分比綜合評價而成。染色強度評分標準：0分，無染色；1分，比背景略黃；2分，黃褐色；3分，棕色。陽性細胞評分標準：0分，0%～5%；1分，6%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，>75%。免疫組化總分計算公式：陽性細胞評分×染色強度評分。最終免疫組化評分得分在0～12分之間，并分為4個等級：0分為陰性(-)；1～5分為弱陽性(+)；6～8分為陽性(++)；9～12分為強陽性(+++)。根據(jù)免疫組化染色評分結(jié)果將患者分為高、低表達組，其中6分以下為低表達組，6分及以上為高表達組。

1.5RNA提取及qRT-PCR檢測 取上述20例置于液氮凍存的胃癌切除手術(shù)的癌組織和癌旁組織以及20例胃炎組織，經(jīng)研磨后，用Trizol法提取各組織RNA，NanoDrop 2000 超微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度，取吸光度(A260 nm/A280 nm)值為1.8～2.0的樣本。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置于-20 ℃保存。根據(jù)GenBank中VISTA基因以及內(nèi)參β-actin基因(序列號分別為：NM_022153.2，NM_001101) 序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，并送蘇州金唯智生物技術(shù)公司合成。VISTA上游引物序列：5′-ACG

CCGTATTCCCTGTATGTC-3′，下游引物序列：5′-TT

GTAGAAGGTCACATCGTGC-3′， 退火溫度60 ℃，產(chǎn)物片段大小101 bp。β-actin上游引物序列：5′-CAT

GTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物序列：5′-CT

CCTTAATGTCACGCACGAT-3′， 退火溫度60 ℃，產(chǎn)物片段大小250 bp。熒光定量PCR反應體系為20 μL，包括ddH2O 7 μL，2×PCR mixture 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。于60 ℃時采集熒光信號，并用熒光定量 PCR檢測儀自帶的分析軟件進行熔解曲線分析。每個樣本檢測3個復孔。以β-actin作為內(nèi)參基因進行校正后分析。VISTA基因的表達水平采用相對定量法(2-△Ct)計算，公式：△Ct=CtVISTA-Ctβ-actin。

1.6ELISA法檢測 收集上述各研究對象的血清標本，采用雙抗體夾心法，按照IFN-γ ELISA檢測試劑盒說明書進行檢測。依據(jù)標準品的濃度和對應的吸光度(A)值繪制標準曲線，計算IFN-γ的濃度。IFN-γ參考范圍：10～400 ng/L。

2 結(jié)果

2.1胃癌患者癌組織中VISTA的定位及表達 胃癌組織芯片的免疫組化染色結(jié)果表明，268例胃癌患者中VISTA呈高表達者94例(35.1%)，VISTA呈低表達者174例(64.9%)，二者差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=11.235，P<0.001)。VISTA在胃癌癌巢組織和癌周組織中均有表達，VISTA在腫瘤浸潤免疫細胞(122/268，45.5%)和間質(zhì)細胞(148/268，55.2%)中呈高表達，而在腫瘤細胞中的表達水平較低(14/268，5.2%)。見圖1。

注：VISTA在浸潤免疫細胞(CD8、CD11c陽性)、間質(zhì)細胞(CD31、α-SMA陽性)以及腫瘤細胞(PanCK陽性)中的共表達情況。

2.2VISTA在胃癌、癌旁以及胃炎組織中的表達差異 qRT-PCR法結(jié)果表明，VISTAmRNA在胃癌組織、癌旁組織以及胃炎組織中的相對表達量分別為1.000±0.198、1.313±0.175以及0.771±0.132，3組間差異有統(tǒng)計學意義(F=2.533，P=0.089 2)。組間兩兩比較結(jié)果表明，與癌旁組織相比，胃癌組織中的VISTAmRNA的表達水平稍低，但差異無統(tǒng)計學意義(t=1.176，P=0.246 8)；與胃炎組織相比，胃癌組織中VISTAmRNA的表達水平較高，但差異無統(tǒng)計學意義(t=0.958 5，P=0.343 9)；與胃炎組織相比，癌旁組織中的VISTAmRNA的表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.469，P=0.018 2)。免疫組化染色結(jié)果顯示，VISTA在癌巢、癌周以及胃炎組織細胞膜上表達，VISTA在癌巢、癌周以及胃炎組織的表達評分分別為1.424±0.386、1.409±0.426以及0.887±0.313分。癌巢、癌周組織中VISTA的表達均顯著高于胃炎組織(t=2.377，P=0.022 4；t=2.256，P=0.029 1)。

2.3VISTA與IFN-γ表達水平的相關(guān)性 免疫組化染色結(jié)果顯示，IFN-γ在組織間質(zhì)細胞區(qū)域散在或成簇表達，主要定位于細胞漿，268例胃癌組織中VISTA與IFN-γ的表達水平呈顯著正相關(guān)(r=0.295，P=0.000)。同時，采用ELISA法分析20例胃癌及20例胃炎患者血清中IFN-γ表達情況，發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清IFN-γ水平為37.604±12.601 pg/L，胃炎患者血清IFN-γ水平為47.020±15.466 pg/L，2組間的差異有統(tǒng)計學意義(t=0.211 1，P=0.041 4)?；颊哐錓FN-γ與VISTAmRNA的表達水平呈正相關(guān)(r=0.449 6，P=0.003 6)。

2.4VISTA表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 VISTA的表達水平與患者年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、是否遠處轉(zhuǎn)移及是否死亡之間無顯著的相關(guān)性，而與患者性別、腫瘤分期以及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在顯著相關(guān)性(表1)。

表1 VISTA表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性

2.5VISTA表達與胃癌患者預后關(guān)系 198例有回訪資料的胃癌患者生存時間為4～72(中位數(shù)44)個月。胃癌組織中VISTA高表達患者的中位生存期為61個月，低表達患者的中位生存期為41個月，經(jīng)Log-Rank檢驗分析，2組生存率之間的差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.413，P=0.065，圖2)。

圖2 VISTA高、低表達組的總生存率比較

2.6影響胃癌患者總生存率的危險因素分析 單因素分析表明，VISTA表達量、腫瘤大小、浸潤深度、腫瘤分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者總生存率的危險因素。多因素分析結(jié)果顯示，除腫瘤分期外，VISTA表達、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移均不是影響胃癌患者總生存率的獨立危險因素(表2)。

表2 與生存率相關(guān)的風險因素的單變量和多變量Cox回歸分析

3 討論

近年來隨著腫瘤免疫和腫瘤微環(huán)境研究的不斷深入，腫瘤免疫調(diào)控分子——免疫檢查點成為腫瘤免疫干預的重要靶點，針對PD-1/PD-L1的多種單抗在臨床抗腫瘤應用中顯示出卓越的療效，使得負性B7 家族免疫檢查點分子在腫瘤免疫治療中的前景受到空前關(guān)注。VISTA是一種新的免疫檢查點分子，主要表達于髓樣細胞、淋巴細胞和腫瘤細胞，參與抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)[5-6]。本研究利用胃癌組織芯片檢測發(fā)現(xiàn)VISTA主要表達于免疫細胞及間質(zhì)細胞，較少表達于腫瘤細胞(5.2%)，這與黑色素瘤、胃癌、前列腺癌、急性髓系白血病等疾病中的研究結(jié)果較為一致[5-8]。由于炎癥組織和多種腫瘤組織均可上調(diào)VISTA的表達[9-10]。為進一步探索VISTA在胃癌診斷中的價值，本研究比較了胃炎與胃癌組織中VISTA的表達，結(jié)果顯示VISTAmRNA水平和免疫組化評分不完全一致，推測原因可能是mRNA反映的是整個組織的總體表達，而免疫組化染色則是反映定位到組織中特定細胞的表達。VISTA在癌組織與炎癥組織中的差異表達提示VISTA具有成為胃癌與胃炎鑒別診斷指標的潛能。IFN-γ主要產(chǎn)生于活化的 T 細胞，在 NK 細胞和 NKT 細胞中也可少量分泌，其表達水平反映了機體免疫細胞活化程度[11-12]。為了分析VISTA表達與腫瘤微環(huán)境中浸潤免疫細胞活化程度的相關(guān)性，筆者比較了胃癌患者血清及腫瘤組織中VISTA與IFN-γ表達水平的相關(guān)性。在本研究中，VISTA的蛋白質(zhì)水平和mRNA水平與IFN-γ的表達均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，提示VISTA的表達與腫瘤浸潤的細胞毒性T細胞活性相關(guān)，這與Zhang等[13]的研究一致。據(jù)此推測，表達VISTA的外源性免疫細胞可能被動員至胃癌組織中參與腫瘤免疫進程。

腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤及活化程度是影響患者生存率極為重要的因素。本研究中198例胃癌患者的隨訪資料顯示，VISTA高表達患者的總體生存率(中位生存期為61個月)顯著高于低表達患者(中位生存期為41個月)，且高表達患者分期更低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更少，這與近年發(fā)表的一項meta分析結(jié)果以及胰腺癌的研究結(jié)果類似[7,14]。提示VISTA表達陽性的免疫細胞能夠提升患者的生存能力。此外，單因素分析結(jié)果表明，VISTA低表達(P=0.035)是影響胃癌總生存率的危險因素，但VISTA表達水平的高低與胃癌患者的預后無顯著相關(guān)性。以上結(jié)果提示VISTA低表達可作為胃癌患者風險因素的預后標志物，但可能需要聯(lián)合腫瘤微環(huán)境中的其他指標進行綜合分析才能更好地預測患者預后。

本研究分析了VISTA在胃癌患者組織中的表達情況，為VISTA應用于胃癌的臨床診療提供了新的研究思路。本研究的不足之處在于沒有進一步分析腫瘤微環(huán)境細胞的表達與VISTA表達之間的相關(guān)性，從而綜合評估VISTA與免疫微環(huán)境的相互作用。