張子亮，黃凱華，吳曉曙，吳志浩，王貫通，孫強(南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院骨科，南京 210001)

脊髓損傷是一種常見的、高致殘率的中樞性神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病，臨床主要表現(xiàn)為感覺及四肢運動功能障礙伴自主神經(jīng)功能紊亂，對患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴重的影響[1]。研究發(fā)現(xiàn)，急性脊髓損傷后神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏及炎癥反應(yīng)是影響神經(jīng)功能恢復(fù)及神經(jīng)再生的重要因素[2]。此外，凋亡也常發(fā)生在脊髓損傷過程中，研究證實，B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)/Bcl-2相關(guān)的X基因(Bax)作為主要的凋亡基因家族成員，可以調(diào)控神經(jīng)細胞的凋亡[3]。然而，國內(nèi)關(guān)于急性脊髓損傷患者血清神經(jīng)營養(yǎng)因子、炎癥因子及凋亡相關(guān)分子表達水平動態(tài)變化的報道少見。因此，本研究擬采用ELISA法檢測脊髓損傷患者在損傷1、3和7 d后血清腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived nurotrophic factor, BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(neurotrophin-3,NT-3)、NT-4、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及血清Bcl-2、Bax的表達水平，分析其在急性脊髓損傷過程中變化水平及臨床意義，以期為該病的臨床診治提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年4月至2019年6月南京市第一醫(yī)院脊柱骨病外科就診的48例脊髓損傷患者作為研究對象，男 31 例，女 17 例，年齡(48.12±4.58)歲。納入標準：(1)符合美國脊髓損傷協(xié)會的Frankel分級標準[4-5]；(2)近期未使用鎮(zhèn)痛消炎及抗菌藥物者；(3)影像學資料顯示，相應(yīng)關(guān)節(jié)存在一定程度損傷；(4)患者及家屬知情同意。排除標準：(1)合并免疫系統(tǒng)、癌癥及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；(2)合并嚴重感染及過敏性疾病者；(3)合并肢體殘疾及神經(jīng)系統(tǒng)疾患者；(4)合并有肝炎、梅毒等嚴重傳染性疾病者；(5)依從性差，中途退出者。根據(jù)神經(jīng)功能分級將其分為完全損傷組(n=21，完全性脊髓損傷)和不完全損傷組(n=27，不完全性脊髓損傷)。完全損傷組患者男14例，女7例，年齡(48.36±4.51)歲，其中胸腰椎骨折12例，頸椎骨折9例，跌落傷9例，重物砸傷5例，車禍傷3例，高處墜落4例；不完全損傷組患者男17例，女10例，年齡(48.12±4.60)歲，其中胸腰椎骨折16例，頸椎骨折11例，跌落傷12例，重物砸傷6例，車禍傷4例，高處墜落5例。2組患者在年齡(P=0.857)、性別(P=0.790 )、骨折部位(P=0.882)及損傷原因(P=0.950)等一般資料間的差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。另取同期體檢健康者30例作為健康人對照組，其中男18例，女12例，年齡(47.92±4.65)歲。

1.2主要儀器及試劑 ID-Centrifuge 12 S Ⅱ型臺式離心機(北京東方珠峰生物技術(shù)開發(fā)公司)，全自動酶標儀(煙臺澳斯邦生物工程公司)。血清BDNF、NT-3、NT-4、IL-6、TNF-α及Bcl-2、Bax酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)試劑盒 (上海信裕生物技術(shù)公司)。

1.3樣本采集 所有受試者均在脊髓損傷后24 h內(nèi)入院，并立即對于患者均給予營養(yǎng)神經(jīng)、脫水、激素等基礎(chǔ)性治療，根據(jù)患者致壓物部分及脊柱骨折類型等因素，對嚴重神經(jīng)功能缺損患者進行相應(yīng)的高壓氧治療。在脊髓損傷治療后 1、3及7 d時采用EDTA-K2抗凝管采集各患者(體檢健康者于體檢時采集)空腹外周靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，分離血清，置于-80 ℃保存。

1.4方法 取上述血清樣本，采用ELISA法，按照BDNF、NT-3、NT-4、IL-6、TNF-α及Bcl-2、Bax酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)試劑盒說明書進行檢測。使用全自動酶標儀在450 nm波長下測定血清樣本中各指標的吸光度A值，在EXCEL軟件中根據(jù)A值繪制標準曲線，并計算各指標在血清中的具體濃度。

2 結(jié)果

2.1脊髓損傷后各組患者血清BDNF、NT-3、NT-4的表達水平 3組受試者在脊髓損傷后1、3、7 d時的血清BDNF、NT-3和NT-4水平呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；進一步進行組間兩兩比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)完全損傷組在脊髓損傷后1、3、7 d時血清BDNF、NT-3和NT-4水平均顯著高于不完全髓損組，見表1。

表1 脊髓損傷后各組患者血清BDNF、NT-3、NT-4的表達

2.2脊髓損傷后各組患者血清炎癥因子的表達水平 與健康人對照組相比，各組受試者血清IL-6和TNF-α水平在脊髓損傷1 d后明顯升高，且在脊髓損傷3 d后達到峰值。與健康人對照組相比，完全損傷組、不完全損傷組患者血清IL-6水平逐漸下降(P<0.05)，見表2。

表2 各組患者脊髓損傷后血清IL-6和TNF-α水平變化(ng/mL)

2.3脊髓損傷后各組患者血清凋亡因子的表達水平 與健康人對照組相比，完全損傷組、不完全損傷組患者在脊髓損傷1、3、7 d后血清Bcl-2水平逐漸降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。而完全損傷組、不完全損傷組患者在脊髓損傷1、3、7 d后血清Bax水平逐漸升高，差異具統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組患者脊髓損傷后血清Bcl-2和Bax水平變化(ng/mL)

3 討論

BDNF是體內(nèi)含量最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，有學者發(fā)現(xiàn)，BDNF在腦缺血和阿茲海默癥患者中的表達水平顯著升高，并且可以有效改善神經(jīng)元損傷的程度[4]。本研究通過動態(tài)檢測脊髓損傷患者血清BDNF的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表達水平較健康人對照組呈現(xiàn)明顯升高的趨勢。此外，NT-3和NT-4也被證實在患者脊髓損傷后具有促進神經(jīng)元分化、神經(jīng)干細胞增殖以及體內(nèi)脊髓軸突長距離生長的作用。筆者通過ELISA法檢測證實，NT-3和NT-4在脊髓損傷恢復(fù)過程中的作用顯著，且與脊髓損傷程度存在一定的相關(guān)性。而黃建華等[5]的研究亦證實，未接受治療且在脊髓損傷48 h內(nèi)患者血清NT-3和NT-4的表達水平顯著升高，與本研究結(jié)果類似。提示在脊髓損傷后盡早采取神經(jīng)營養(yǎng)治療措施以改善患者脊髓損傷的預(yù)后。

脊髓損傷后的神經(jīng)炎癥水平是反映神經(jīng)損傷及神經(jīng)功能紊亂程度的重要因素。研究表明，持續(xù)性的強神經(jīng)炎癥刺激會對脊髓組織造成大范圍繼發(fā)性損傷[6]。本研究動態(tài)檢測了脊髓損傷1周內(nèi)受試者血清中炎癥因子的水平變化，發(fā)現(xiàn)損傷組血清TNF-α和IL-6水平明顯高于健康人對照組，提示炎癥是脊髓損傷后重要的病理過程。Bax和Bcl-2均屬于Bcl-2家族成員，兩者可對細胞凋亡進行調(diào)控，其中Bcl-2可以通過與Bax形成異源二聚體以進行凋亡抑制，從而實現(xiàn)對Bcl-2蛋白抑制凋亡的對抗效果[7]。筆者對患者脊髓損傷后1周內(nèi)的血清Bax和Bcl-2進行檢測，發(fā)現(xiàn)血清Bcl-2水平顯著高于健康人對照組，而血清Bax水平顯著低于健康人對照組。此外，除不完全損傷組血清Bax的表達水平在1周內(nèi)各個時間點高于完全損傷組外，其他各項指標均為完全損傷組更高，提示上述神經(jīng)營養(yǎng)因子、炎癥因子以及凋亡因子可能作為脊髓損傷程度的評價指標。

然而，本研究只將治療后的脊髓損傷受試者和健康人對照組進行比較，并未納入未治療組進行進一步的對比；其次，筆者在1周內(nèi)只選取了3個時間點進行對比，各指標的動態(tài)變化可能并不能夠完全反映患者脊髓損傷的實際情況。后續(xù)的研究中，我們將納入未治療的受試者并更加細化的時間點進行采樣。綜上所述，急性脊髓損傷患者血清神經(jīng)營養(yǎng)因子、炎癥因子及Bcl-2水平均明顯升高，Bax水平顯著降低，其水平變化可作為臨床判定脊髓損傷程度的參考指標，但需根據(jù)患者病情進一步分析。