李鑫，徐衛(wèi)平，臧瑩，錢佳燕，黃子慧(南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院.檢驗科，.瘰疬科，南京 210014)

結(jié)核性潰瘍是指結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)、牛分枝桿菌、卡介苗等經(jīng)各種傳播路徑侵犯機體局部組織[1]，引起病灶周圍軟組織、皮下及皮膚的壞死，最終液化破潰所形成的創(chuàng)面，為肺外結(jié)核的一種，是臨床常見的一種特異性感染性創(chuàng)面[2]。其在臨床上與某些慢性難愈性創(chuàng)面表現(xiàn)極為相似，難以鑒別，目前尚未發(fā)現(xiàn)診斷結(jié)核性潰瘍具有較高特異性、靈敏度及快捷方便的檢測指標及檢測手段[3]。

分枝桿菌主要感染機體的免疫防御細胞，在機體內(nèi)復制與傳播，而免疫防御細胞的募集在很大程度上取決于趨化因子的釋放。其中趨化因子(C-X-C基序)配體9(C-X-C motif chemokine 9，CXCL9)、趨化因子(C-X-C基序)配體10(C-X-C motif chemokine 10，CXCL10)主要對單核細胞和淋巴細胞等具有趨向作用。已有研究表明，CXCL9、CXCL10與結(jié)核相關(guān)疾病的發(fā)生相關(guān)，是結(jié)核特異性反應(yīng)介導炎癥的重要介質(zhì)[4-7]，在治療反應(yīng)、基因調(diào)控和疾病轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著重要作用[8]。本研究基于定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR)技術(shù)快速檢測結(jié)核性潰瘍、非結(jié)核性潰瘍患者及健康人體內(nèi)血漿CXCL9、CXCL10的表達情況，評價CXCL9、CXCL10在結(jié)核性潰瘍患者中的診斷效能。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2018年—2020年南京中醫(yī)藥大學附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院瘰疬科結(jié)核性潰瘍患者108例，男41例，女67例，年齡(43.45±17.23)歲，納入結(jié)核性潰瘍組。結(jié)核性潰瘍診斷參照《現(xiàn)代結(jié)核病學》[9]和《常見疾病的診斷與療效判定(標準)》[10]的有關(guān)標準：膿腫破潰后膿液稀薄，夾有敗絮樣物，瘡口潛行，久不愈合；組織病理證實為結(jié)核病，或膿液涂片找到抗酸桿菌；可有肺結(jié)核病史或接觸史；伴有低熱、盜汗、神疲、乏力、消瘦等全身癥狀。另收集同期非結(jié)核性潰瘍患者27例，包括壓力性潰瘍5例，下肢靜脈性潰瘍6例，糖尿病足6例，皮膚和軟組織感染6例和燒傷患者4例，男12例，女15例，年齡(46.31±14.23)歲，納入疾病對照組，既往無結(jié)核病病史及接觸史。發(fā)病部位均在軀干、四肢，潰瘍面積4～16 cm2，竇道長度2～4 cm。收集同期健康人36例(來自醫(yī)院體檢中心)，男16例，女20例，年齡(41.28±11.47)歲，納入健康人對照組，既往無結(jié)核病病史及接觸史，皮膚表面無潰瘍創(chuàng)面。以上入組對象皆符合排除標準：(1)合并有造血系統(tǒng)、肝、腎及心腦血管等嚴重原發(fā)性疾病及繼發(fā)疾病者；(2)妊娠或哺乳期婦女；(3)精神病患者；(4)免疫功能受損者(有癥狀的HIV感染、已確診或疑似的HIV感染、白血病、淋巴瘤或全身性惡性疾病等)；(5)活動性肺結(jié)核患者。3組間年齡、性別分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究通過南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會倫理審查(文件批號：201901001)，所有納入患者均為自愿參與并簽署書面知情同意書。

1.2樣本采集 采集2 mL全血樣本放入EDTA抗凝管中，在2 h內(nèi)4 ℃、2 500 r/min離心5 min，取上層血漿樣本放入1.5 mL EP管中并置于4 ℃保存。

1.3主要儀器與試劑 LightCycler 480實時熒光定量PCR儀(羅氏公司)；2720 thermal cycler普通PCR儀(Life technologies公司)。TRIzolTMLS試劑(Thermo Fisher Scientific公司，批號10296010)；PrimeScriptTMPT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa公司，批號RR036A)；ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix (Without ROX)試劑盒(南京諾唯贊公司，批號Q321-02)。

1.4方法

1.4.1RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 血漿總RNA的提取采用TRIzolTMLS試劑，按試劑說明書進行。使用核酸測定儀檢測各樣本RNA濃度，配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液10 μL，包括5×PrimeScript RT Master Mix(Pertect Real Time)2 μL，RNA樣本<500 ng，加RNase Free dH2O至10 μL，輕柔混勻后在普通PCR儀進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃。

1.4.2PCR引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank公布的人CXCL9基因(登錄號：BC063122.1，基因序列如SEQ ID NO.1所示)和人CXCL10基因(登錄號：BC010954.1，基因序列如SEQ ID NO.2所示)的編碼序列，用Primer Premier軟件設(shè)計RT-qPCR擴增引物，以U6為內(nèi)參基因，由上海生工生物工程公司合成。引物序列見表1。

表1 定量PCR檢測引物

1.4.3定量PCR檢測 反應(yīng)體系：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Without ROX)5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，模板cDNA 0.1 μL，dd H2O 4.1 μL。以CXCL9為引物時，反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s、56 ℃ 24 s、72 ℃ 15 s，35個循環(huán)；50 ℃延伸30 s獲得熒光。以CXCL10為引物時，反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，55 ℃ 24 s，72 ℃ 15 s，35個循環(huán)；50 ℃延伸30 s獲得熒光。每個樣品一式2份進行測試。由于內(nèi)參U6很穩(wěn)定，在以上2個條件下無區(qū)別，故根據(jù)同孔板研究對象設(shè)置。通過2-△Ct法分析各組中CXCL9、CXCL10的相對表達水平。實驗組△Ct=實驗組的Ct值-內(nèi)參基因U6的Ct值。

2 結(jié)果

2.1血漿中CXCL9和CXCL10mRNA的相對表達水平 與對照組(0.40±0.01，1.18±0.29)相比，疾病組患者的CXCL9、CXCL10mRNA表達水平明顯升高(1.43±0.36，12.53±6.18)，差異有統(tǒng)計學意義(t分別為5.954、5.421，P均<0.000 1)。

2.2ROC曲線分析 CXCL9、CXCL10 診斷結(jié)核性潰瘍的AUC為0.938和0.915，見圖1。當CXCL9、CXCL10的cut off值分別為0.220、4.232時，2個趨化因子組合對結(jié)核性潰瘍的敏感性、特異性分別為92.6%、77.8%。見表2。

表2 CXCL9和CXCL10診斷結(jié)核性潰瘍的效能

圖1 CXCL9(A)和CXCL10(B)的ROC曲線分析

3 討論

本次研究非結(jié)核性潰瘍患者包括壓力性潰瘍、下肢靜脈性潰瘍、糖尿病足、皮膚和軟組織感染和燒傷患者。在臨床上，可根據(jù)患者的病史和臨床表現(xiàn)予以鑒別診斷。但是，在疾病晚期、機體免疫低下、傷口暴露情況下，易感結(jié)核桿菌，往往臨床診斷困難，延誤治療。故本次研究將非結(jié)核性潰瘍患者作為對照組之一。經(jīng)數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，結(jié)核性潰瘍患者血漿中CXCL9、CXCL10呈高表達狀態(tài)，說明機體內(nèi)CXCL9與CXCL10的表達受MTB影響。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，兩組基因的AUC值均大于0.9，表明輔助診斷結(jié)核性潰瘍效果佳。以cut off值為臨界值，單獨使用CXCL9檢測或CXCL10檢測均可診斷結(jié)核性潰瘍疾病，但采用CXCL9和CXCL10聯(lián)合檢測的靈敏度更高，判斷檢測效果更好。由于實驗條件的限制，此次研究樣本量較少，未深入驗證相關(guān)趨化因子在治療反應(yīng)、基因調(diào)控和疾病轉(zhuǎn)歸等方面的表現(xiàn)及作用，有待進一步補充病例研究。