許小雨，宋御繁，孫克娜，陳英劍,胡成進(jìn)(1.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，山東濰坊61053；.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六〇醫(yī)院檢驗(yàn)科，濟(jì)南50031)

乳腺癌是導(dǎo)致世界女性癌癥死亡最主要的原因，乳腺癌常用的檢查方法有活檢、乳房X線檢查、CT檢查、超聲檢查和磁共振成像(MRI)等，然而上述方法昂貴、耗時(shí)，不適合大規(guī)?；颊叩脑缙诤Y查[1]。由美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)認(rèn)證的生物學(xué)標(biāo)志物——CA153已應(yīng)用于臨床，但其特異性和敏感性?xún)H為65.7%和76.7%[2]，且其僅可用于監(jiān)測(cè)乳腺癌的療效、預(yù)后評(píng)估以及復(fù)發(fā)判斷。目前臨床上主要通過(guò)免疫組化染色法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞雌激素受體(ER)，孕酮受體(PR)和人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體(HER2)蛋白質(zhì)的表達(dá)，并根據(jù)結(jié)果將乳腺癌區(qū)分為不同的乳腺癌亞型，但此種方法成本高、操作繁瑣且需進(jìn)行染色處理，實(shí)際操作中存在很多因素影響免疫組化染色結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。因此，臨床上需要尋找到新的方法以提高乳腺癌診斷陽(yáng)性率，并為臨床個(gè)體化治療提供決策依據(jù)。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)是一種蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有效工具，在腫瘤精準(zhǔn)診療中具有重要作用。本研究旨在采用MALDI-TOF-MS技術(shù)建立一種具有高敏感性和高特異性，以及適用于臨床乳腺癌診斷的預(yù)測(cè)模型，應(yīng)用該技術(shù)將乳腺癌患者從體檢健康者及良性疾病者中鑒別出，并進(jìn)一步區(qū)分三陰性乳腺癌(TNBC)和非三陰性乳腺癌(NTNBC)患者。

1 材料及方法

1.1一般資料 收集2020年8月至2021年3月聯(lián)勤保障部隊(duì)某醫(yī)院經(jīng)病理組織學(xué)活檢確診的乳腺癌患者(61例)和纖維腺瘤患者(60例)，病理分型為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌47例、浸潤(rùn)性小葉癌 1例、導(dǎo)管內(nèi)原位癌8例及浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌伴高級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌5例。乳腺癌分子分型分為T(mén)NBC 10例， NTNBC 51例。乳腺癌患者年齡32～77歲，中位年齡53歲；乳腺纖維腺瘤患者年齡33～74歲，中位年齡55歲。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者初次經(jīng)病理組織學(xué)活檢確診為乳腺癌或纖維腺瘤；(2)既往未經(jīng)其他手術(shù)、抗癌藥物及放化療治療；(3)具有完整的臨床病理學(xué)診斷資料；(4)無(wú)其他惡性腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)非乳腺癌及纖維腺瘤患者;(2)接受過(guò)抗癌治療者;(3)合并其他惡性腫瘤者;(4)感染性疾病患者。以同期44名體檢健康者作為健康人對(duì)照組，年齡35～79歲，中位年齡55歲。本研究經(jīng)解放軍第九六〇醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)[(2021)科研倫理審第(60)號(hào)]，各研究對(duì)象均知情同意。

1.2儀器和試劑 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)(MALDI-TOF，德國(guó)Bruker公司)，低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。弱陽(yáng)離子交換磁珠(WCX-MB)試劑盒、蛋白質(zhì)/多肽校準(zhǔn)品(德國(guó)Bruker公司)，α-氰基-4羥基肉桂酸(HCCA)、三氟乙酸(TFA)、乙腈(ACN)、無(wú)水乙醇(美國(guó)Sigma公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集及預(yù)處理 在各受試者治療前采集清晨空腹靜脈血5 mL貯于含有惰性分離膠的真空采血管中，于室溫條件下靜置30 min，置于離心機(jī)中以3 000 r/min離心5 min，取血清分裝至0.5 mL的Ep管中，隨后置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2血清標(biāo)本分組 將所有的樣本按照3∶1的比例進(jìn)行隨機(jī)分組，訓(xùn)練組78例(乳腺癌患者45例，體檢健康者33例)，驗(yàn)證組27例(乳腺癌患者16例，體檢健康者11例)。訓(xùn)練組用以建立診斷預(yù)測(cè)模型，驗(yàn)證組用以評(píng)估模型診斷效能。

1.3.3血清預(yù)處理 從-80 ℃冰箱取出血清標(biāo)本，置于-20 ℃凍融8 h，再置于4 ℃凍融6 h，將復(fù)融的血清以10 000 r/min離心3 min。進(jìn)行以下操作：每5 μL血清標(biāo)本與10 μL弱陽(yáng)離子交換磁珠(WCX-MB)和10 μL結(jié)合緩沖液(BB)混合于200 μL試管中?；旌虾?，將樣品管放入磁力分離器中，1 min后棄除試管中的上清液。樣本與磁珠結(jié)合后，用100 μL的洗滌緩沖液(WB)洗滌3次，加入5 μL的磁珠洗脫緩沖液(EB)與磁珠結(jié)合。懸浮液樣本從上清液中完全分離后轉(zhuǎn)移至新的10 μL試管中。每個(gè)試管中加入5 μL穩(wěn)定緩沖液(SB)，用于質(zhì)譜分析。

1.3.4儀器校準(zhǔn)與質(zhì)量控制 檢測(cè)前使用蛋白質(zhì)/多肽校準(zhǔn)品混合液進(jìn)行儀器校準(zhǔn)，隨機(jī)選取30例體檢健康者血清標(biāo)本，取5 μL混勻，用于評(píng)價(jià)質(zhì)譜儀的穩(wěn)定性。弱陽(yáng)離子磁珠(WCX-MB)提取混合血清中的蛋白質(zhì)/多肽，檢測(cè)時(shí)每15個(gè)樣本進(jìn)行1次點(diǎn)靶，質(zhì)譜上樣檢測(cè)獲得質(zhì)譜峰，計(jì)算每批質(zhì)譜多肽峰的變異系數(shù)(CV)。

1.3.5血清處理標(biāo)本質(zhì)譜檢測(cè) 取提取的蛋白質(zhì)/多肽樣本1 μL點(diǎn)樣于AnchorChip 384靶板上，樣本一式三份點(diǎn)靶，自然干燥后取1 μL新鮮配置的6 mg/mL基質(zhì)(6 mg HCCA,50%ACN，2%TFA)覆蓋于樣本點(diǎn)上，自然晾干后置于質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。在正離子線性模式下，1 ～10 kDa分子質(zhì)量范圍內(nèi)采集峰的m/z值和強(qiáng)度。采用的離子源1為19.64 kV，離子源2為18.34 Kv，基質(zhì)抑制為m/z 700 Da。在激光能量為75%下采集譜圖，每個(gè)樣本點(diǎn)累積轟擊1 200次。

1.3.6峰譜圖處理 使用ClinProTools軟件及FlexAnalysis軟件對(duì)采集的原始質(zhì)譜圖進(jìn)行平滑、去噪、基線去除和歸一化處理，并確定分子質(zhì)量為1～10 kDa的峰，剔除信噪比(S/N)<5的峰。

1.3.7建立及驗(yàn)證乳腺癌診斷預(yù)測(cè)模型 采用ClinProTools軟件中包含的3種模型算法：遺傳(GA)算法、監(jiān)督神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(SNN)算法及快速分類(lèi)(QC)算法對(duì)乳腺癌建立診斷預(yù)測(cè)模型，并使用驗(yàn)證血清組血清標(biāo)本對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，得出模型的敏感性、特異性及準(zhǔn)確性，從中選出最佳診斷預(yù)測(cè)模型。

2 結(jié)果

2.1質(zhì)量控制結(jié)果分析 本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)時(shí)每15個(gè)樣本點(diǎn)1次靶，檢測(cè)后得到9個(gè)質(zhì)控樣本質(zhì)譜峰，計(jì)算1～10 kDa范圍內(nèi)9個(gè)峰的平均CV為19.56%(11.67%～29.78%)。表明此CV在正常范圍內(nèi)，此系統(tǒng)檢測(cè)一致性較好，符合要求。

2.2乳腺癌診斷預(yù)測(cè)模型的建立與驗(yàn)證結(jié)果分析 應(yīng)用ClinProTools軟件對(duì)乳腺癌組與對(duì)照組進(jìn)行分析，建立了診斷預(yù)測(cè)模型，并使用驗(yàn)證組進(jìn)行驗(yàn)證(表1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GA算法建立的模型診斷效能最佳。選取差異最顯著的2個(gè)峰：m/z 5 920.36、m/z 4 220.9分別為X、Y軸進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示乳腺癌組與對(duì)照組可明顯區(qū)分(圖1)，在GA算法模型下使用驗(yàn)證組血清驗(yàn)證，16例乳腺癌患者中正確判斷15例，誤判1例；11例對(duì)照者中正確判斷10例，誤判1例。GA模型的預(yù)測(cè)診斷特異性為90.9%，敏感性為93.8%，準(zhǔn)確性為92.6%。

表1 3種診斷預(yù)測(cè)模型的效能(%)

注：紅色叉號(hào)為訓(xùn)練組乳腺癌患者；綠色圓圈為訓(xùn)練組對(duì)照者，A中黑點(diǎn)為驗(yàn)證組乳腺癌患者；B中黑點(diǎn)為驗(yàn)證組對(duì)照者。

2.3血清蛋白質(zhì)/肽指紋圖譜分析

2.3.1乳腺癌組與對(duì)照組圖譜分析 通過(guò)ClinProTools軟件分析后，得到乳腺癌組與對(duì)照組的血清蛋白質(zhì)/肽指紋圖譜(圖2)，證實(shí)兩組間圖譜存在明顯差異。在分析范圍為1～10 kDa內(nèi)發(fā)現(xiàn)差異峰 106個(gè)(P<0.05)，篩選出差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 001)且AUCROC值>0.80的差異峰26個(gè)。峰m/z 4 220.9、5 920.36、2 960.40、2 110.95在乳腺癌組中表達(dá)下調(diào)，其余22個(gè)峰均表達(dá)上調(diào)。此外，m/z 4 220.9、5 920.36的2個(gè)峰差異最為顯著，其AUCROC值分別為0.93和0.85，且乳腺癌組m/z 4 220.9、5 920.36的峰強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組(圖3)。

注：紅色為乳腺癌組；綠色為對(duì)照組。

注：A、a分別為m/z 4 220.9的疊加峰譜圖及ROC曲線；B、b分別為m/z 5 920.36的疊加峰譜圖及ROC曲線。紅色為乳腺癌組；綠色為對(duì)照組。

2.3.2乳腺纖維腺瘤組與對(duì)照組圖譜分析 經(jīng)ClinProTools軟件分析，纖維腺瘤組和對(duì)照組兩譜圖在質(zhì)量范圍1～10 kDa之間，存在明顯差異，其中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的差異峰有40個(gè)。包括10個(gè)峰表達(dá)上調(diào)，30個(gè)峰表達(dá)下調(diào)。此外，m/z 4 220.9、5 920.36的2個(gè)峰差異最為顯著，其AUCROC值分別為0.85和0.96，且纖維腺瘤組m/z 4 220.9、5 920.36的峰強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組。以m/z 5 920.36、4 220.9分別為X、Y軸進(jìn)行聚類(lèi)分析，纖維腺瘤組與對(duì)照組可以準(zhǔn)確地區(qū)分，見(jiàn)圖4。

注：紅色叉號(hào)為纖維腺瘤組；綠色圓圈為對(duì)照組。

2.3.3乳腺癌組與纖維腺瘤組圖譜分析 經(jīng)ClinProTools軟件分析，乳腺癌組與纖維腺瘤組圖譜存在明顯差異，在1～10 kDa范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的差異峰78個(gè)，其中5個(gè)峰表達(dá)下調(diào)，其余73個(gè)峰表達(dá)上調(diào)。此外，m/z 4 220.9、5 920.36的2個(gè)峰差異最為顯著，其AUCROC值分別為0.90和0.99，且乳腺癌組m/z 4 220.9、5 920.36的峰強(qiáng)度明顯低于纖維腺瘤組。以m/z 5 920.36、4 220.9分別為X、Y軸進(jìn)行聚類(lèi)分析，可準(zhǔn)確區(qū)分乳腺癌組與纖維腺瘤組(圖5)。

注：紅色叉號(hào)為乳腺癌組；綠色圓圈為纖維腺瘤組。

2.3.4TNBC組與NTNBC組圖譜分析 經(jīng)ClinProTools軟件分析，TNBC組與NTNBC組圖譜存在顯著差異，在1～10 kDa范圍內(nèi)篩選出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的差異峰40 個(gè)，其中6個(gè)峰表達(dá)上調(diào)，34個(gè)峰表達(dá)下調(diào)。此外，m/z 4 220.9、5 920.36的2個(gè)峰差異最為顯著，其AUCROC值分別為0.66和1，且TNBC組m/z 4 220.9、5 920.36的峰強(qiáng)度明顯高于NTNBC組。以m/z 5 920.36、4 220.9分別為X、Y軸進(jìn)行聚類(lèi)分析，可以準(zhǔn)確區(qū)分TNBC和NTNBC患者(圖6)。

注：紅色叉號(hào)為T(mén)NBC組；綠色圓圈為NTNBC組。

3 討論

質(zhì)譜技術(shù)作為一種新型蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，具有高靈敏度、高分辨率、高準(zhǔn)確性、高通量等優(yōu)勢(shì)，能為疾病的臨床診療提供快速、精準(zhǔn)的分子生物學(xué)信息，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域受到越來(lái)越多的關(guān)注。既往大量學(xué)者使用MALDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)胃癌、肺腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、食管鱗癌進(jìn)行多肽峰的鑒定[3-4]。本研究基于WCX-MB純化技術(shù)，應(yīng)用MALDI-TOF-MS對(duì)乳腺癌組與對(duì)照組血清樣本進(jìn)行分析，采用3種算法(GA、SNN、QC)分別建立乳腺癌診斷預(yù)測(cè)模型并進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GA算法建立的模型診斷效能最佳。GA算法是一種優(yōu)化算法，它通過(guò)遺傳和進(jìn)化機(jī)理，從給出的原始解群中，不斷進(jìn)化產(chǎn)生新的解，直至產(chǎn)生最優(yōu)解。本研究應(yīng)用此理論進(jìn)行取舍，直至得到最佳峰群建立模型。經(jīng)驗(yàn)證組驗(yàn)證其特異性、敏感性和準(zhǔn)確性分別為90.9%、93.8%和92.6%，可有效區(qū)分乳腺癌患者與體檢健康者。對(duì)纖維腺瘤組和對(duì)照組、乳腺癌組和纖維腺瘤組以及TNBC組和NTNBC組分別進(jìn)行聚類(lèi)分析結(jié)果表明，差異最顯著的2個(gè)質(zhì)譜峰m/z 4 220.9、5 920.36在纖維腺瘤組中的峰強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組；在乳腺癌組中的峰強(qiáng)度顯著低于纖維腺瘤組；在TNBC組中的峰強(qiáng)度顯著高于NTNBC組。

綜上所述，應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)建立的乳腺癌診斷預(yù)測(cè)模型具有高敏感性、高特異性、高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)。該技術(shù)能夠準(zhǔn)確區(qū)分良惡性乳腺癌和體檢健康者，可用于乳腺癌的早期診斷和高危人群篩查，同時(shí)可以更直觀地區(qū)分TNBC和NTNBC，為臨床精準(zhǔn)治療提供更為可靠的依據(jù)。在乳腺癌分型上，與傳統(tǒng)免疫組化染色法相比，MALDI-TOF-MS技術(shù)具有高通量、操作簡(jiǎn)單以及可排除人為主觀因素影響的優(yōu)點(diǎn)。本次研究篩選出的2個(gè)差異峰m/z 4 220.9、5 920.36有望成為乳腺癌潛在的腫瘤標(biāo)志物。由于本次實(shí)驗(yàn)所收集的樣本量較少，研究結(jié)果存在偏倚的可能性，因此，后續(xù)研究中我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，納入更多早期乳腺癌患者，細(xì)化分組，豐富實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。對(duì)于此次獲得的差異蛋白質(zhì)/多肽，后續(xù)將使用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行蛋白質(zhì)分子鑒定，研究其功能并闡明其在乳腺癌發(fā)生發(fā)病機(jī)制中的作用。