鄭緒雅，張琳，張俊峰(.鄭州大學第五附屬醫(yī)院檢驗科，鄭州450052；2.鄭州大學醫(yī)學科學院，鄭州450052)

非瓣膜性心房顫動(non-valvular atrial fibrillation，NVAF)簡稱非瓣膜性房顫，主要是指沒有風濕性二尖瓣狹窄、機械或生物瓣膜置換、二尖瓣修復等情況下發(fā)生的心律失常，是臨床上常見的房顫類型。房顫患者經(jīng)過規(guī)律抗凝治療后，其腦卒中風險顯著降低[1]。達比加群酯(dabigatran etexilate)是一種新型口服抗凝藥，但其本身是小分子的前體藥物，不具備藥理活性作用，可作為藥物外排泵P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的底物，在腸道吸收后經(jīng)羧酸酯酶1(carboxylesterases，CES1)水解，轉化為活性代謝產(chǎn)物達比加群(dabigatran)，并與凝血酶的特異性位點結合，抑制凝血酶活性、阻止纖維蛋白形成以發(fā)揮抗凝作用[2]。然而，由于藥代動力學存在個體間差異，服用達比加群酯治療的非瓣膜性房顫患者有時會發(fā)生出血或血栓等不良臨床事件。Sychev等[3]研究發(fā)現(xiàn)ABCB1SNP rs1045642與達比加群峰濃度相關，攜帶次要等位基因的患者具有更高的血藥濃度峰值和出血風險。但也有研究表明SNP rs1045642多態(tài)性與達比加群酯藥代動力學無關[4-5]。有文獻報道稱CES1SNP rs2244613的次要等位基因會降低患者血藥濃度谷值[6-7]，出血風險也隨之下降。Shi等[8]認為SNP rs2244613與血藥濃度和臨床結果均無關。由此可見，關于基因多態(tài)性位點對達比加群酯抗凝有效性和安全性的影響目前仍然沒有統(tǒng)一的說法，而之前的相關研究主要是針對歐洲人群。因此，本研究通過檢測我國非瓣膜性房顫患者ABCB1和CES1基因多態(tài)性的分布，初步探討非瓣膜性房顫患者基因多態(tài)性與達比加群酯治療效果的關系，以期為臨床上達比加群酯的個體化用藥提供理論指導和參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2020年5月至2021年6月在鄭州大學第五附屬醫(yī)院心內(nèi)科治療的非瓣膜性房顫患者80例作為研究對象，其中男43例,女37例，年齡(64.5±8.6)歲。納入標準:年齡≥18歲，連續(xù)服用達比加群酯(每次110 mg，每天2次)≥3 d，CHA2DS2-VASC評分≥2分、HAS-BLED評分≤3分的非瓣膜性房顫患者,其中CHA2DS2-VASC評分內(nèi)容為充血性心力衰竭/左心室功能障礙(C)1分，高血壓(H)1分，年齡(A)≥75歲2分，糖尿病(D)1分，腦卒中/TIA/血栓栓塞病史(S)2分，血管疾病(V)1分，年齡65～74歲(A)1分，女性(SC)1分，分值越高卒中風險越大;HAS-BLED評分內(nèi)容為高血壓(H)1分，肝腎功能異常(A)1分，腦卒中(S)1或2分，出血(B)1分，INR值易波動(L)1分，老年(E)1分(如年齡>65歲)，藥物或嗜酒(D)1分，分值越高出血風險越大。符合非瓣膜性房顫診斷標準:經(jīng)過心電圖證實為房顫，經(jīng)過超聲心動圖檢查排除瓣膜性心臟病，并且觀察48 h以上房顫不可自行終止。排除標準：(1)存在人工心臟瓣膜或血流動力學意義重大的瓣膜疾?。?2)經(jīng)食道超聲心動圖檢查發(fā)現(xiàn)心房或心房附件有血栓；(3)嚴重肝腎功能損害；(4)有明顯出血風險的合并癥，如消化性潰瘍和血小板減少癥，或臨床活動性出血；(5)同時使用任何抗凝劑、抗血小板藥物或強P-gp抑制劑，如酮康唑、伊曲康唑、環(huán)孢霉素和決耐達??；(6)不遵守達比加群酯的規(guī)定用法，如改變服用劑量或給藥間隔。本研究獲得本院醫(yī)學倫理委員會批準(批準號為Y2021027)，并獲得了研究對象的書面知情同意。

1.2標本采集與處理 至少連續(xù)服用達比加群酯3 d后用枸櫞酸鈉抗凝采血管采集患者外周靜脈血以檢測血漿濃度和凝血指標。用乙二胺四乙酸鹽抗凝采血管采集患者外周靜脈血來提取DNA，以分析基因多態(tài)性。

1.3主要儀器與試劑 ACL TOP 700凝血分析儀(西班牙Werfen公司)，ABI 7500核酸擴增儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)，DNA提取試劑盒(批號DP348，北京天根公司)，TaqMan?SNP基因型分析試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司);凝血四項配套試劑、Hemoclot凝血酶抑制因子(法國Hyphen-BioMed公司)。

1.4血漿濃度測定與凝血指標檢測 用前一次給藥后10～16 h采集的血液樣本檢測達比加群血漿谷濃度水平，給藥后1～3 h的標本檢測血漿峰濃度水平。3 000×g離心15 min收集血漿標本，通過發(fā)色底物顯色分析方法定量測定達比加群血漿濃度[9]。-20 ℃下保存的血漿樣本可以在2個月內(nèi)完成達比加群濃度的測定。在取樣后2 h內(nèi)進行凝血功能檢測，主要包括活化部分凝血活酶時間(APTT)與凝血酶時間(TT)等凝血指標。凝血試驗在全自動凝血分析儀上進行。每項測試運行2次，并用測試結果平均值進行后續(xù)分析。

1.5基因型檢測 用DNA提取試劑盒從全血標本中提取DNA，按照TaqMan?SNP基因型分析試劑盒說明書配制PCR反應體系。在ABI 7500核酸擴增儀上進行核酸擴增以檢測ABCB1SNP rs1045642與CES1SNP rs2244613的基因多態(tài)性，反應程序:95 ℃溫育3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，以同樣的方式重復50個循環(huán)。對CES1SNP rs2244613進行基因型檢測的PCR反應程序：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，然后56 ℃退火1 min,39個循環(huán)。

1.6觀察臨床不良事件 在治療期間觀察并記錄臨床不良事件的發(fā)生率，分析不同基因型的患者服用達比加群酯后的抗凝有效性和安全性，不良臨床事件包括治療后出現(xiàn)的血栓性疾病(心肌梗死、卒中)、死亡等。出血事件包括輕微出血(皮膚瘀斑、鼻出血、牙齦出血、尿潛血等)、少量出血(咯血、嘔血、肉眼血尿、血便)、大量出血(出血量達300 mL伴Hb下降20 g/L或者關鍵器官發(fā)生出血，如顱內(nèi)、椎管內(nèi)、腹膜后等)、致死性出血(Hb至少下降50 g/L，需要輸血4個單位及以上的出血或者必須外科手術治療的出血)。

2 結果

2.1一般臨床資料 收集研究對象的基線資料，其人口統(tǒng)計學和臨床特征見表1。

表1 患者的一般臨床資料

2.2基因型分布及等位基因頻率 80例非瓣膜性房顫患者基因型分布見表2。ABCB1SNP rs1045642檢測出CC、CT、TT 3種基因型，CES1SNP rs2244613檢測出AA、AC、CC 3種基因型，所有位點均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表2 非瓣膜性房顫患者ABCB1與CES1基因型分布以及等位基因頻率

2.3ABCB1和CES1多態(tài)性對達比加群血漿濃度的影響 見表3。對于ABCB1SNP rs1045642，達比加群峰濃度的最高值為273.73 ng/mL，峰濃度的最低值為104.26 ng/mL，不同基因型組間峰濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.124)；達比加群谷濃度的最高值為38.99 ng/mL，谷濃度的最低值為2.88 ng/mL，不同基因型組間谷濃度差異無統(tǒng)計學意義(P=0.053)。對于CES1SNP rs2244613，達比加群峰濃度的最高值為214.36 ng/mL，峰濃度的最低值為107.22 ng/mL，不同基因型組的峰濃度差異無統(tǒng)計學意義(P=0.097)；達比加群谷濃度AA基因型患者最高，AC基因型患者次之，CC基因型患者人群最低(P<0.001)，達比加群谷濃度的最高值為50.41 ng/mL，谷濃度的最低值為6.90 ng/mL。

表3 不同基因型的非瓣膜性房顫患者服用達比加群酯后的血藥濃度(ng/mL)

2.4ABCB1和CES1多態(tài)性對凝血指標的影響 由于峰濃度水平的TT會超過檢測上線，所以只在谷濃度水平下測定TT。如表4所示，研究的所有基因型均未影響峰濃度水平的APTT值。對于ABCB1SNP rs1045642位點，3種基因型與谷濃度水平APTT無關(P=0.348)，與TT也無關(P=0.271)。對于CES1SNP rs2244613位點，3種基因型具有不同的谷濃度水平APTT值與TT值。AA基因型患者人群具有最高的谷濃度時期APTT值，最高值為42.21 s。CC基因型患者人群具有最低的谷濃度時期APTT值，最低值為27.31 s。繼續(xù)分析發(fā)現(xiàn)與AA基因型或AC基因型患者相比，CC基因型患者的谷濃度水平的APTT更低(P=0.046)。谷濃度水平的TT最高值為141.32 s，谷濃度水平的TT最低值為31.62 s。進一步分析發(fā)現(xiàn)，與AA基因型或AC基因型患者相比，CC基因型患者的谷濃度水平的TT更低(P=0.043)。

表4 不同基因型的非瓣膜房顫患者服用達比加群酯后不同時期的凝血指標變化(s)

2.5ABCB1和CES1多態(tài)性對出血發(fā)生率的影響 不同基因型患者出血情況見表5。在本研究中，80例患者中沒有出現(xiàn)心肌梗死、短暫性腦缺血或腦卒中等血栓事件，其中有20例發(fā)生了不同程度的出血，無大出血病例，出血類型主要是輕微出血和少量出血。比較ABCB1與CES1不同基因型的患者出血情況，ABCB1SNP rs1045642位點，當患者為CC型時，出血發(fā)生率為11.4%，當患者為TT基因型時，出血率為12.5%，每一個次要等位基因T與降低出血風險趨勢相關，但是組間比較差異無統(tǒng)計學意義[CC vs CT vs TT:11.4%(4/35) vs 13.5%(5/37)vs 12.5%(1/8)，P=0.452]。CES1SNP rs2244613與臨床出血事件的發(fā)生有著顯著的相關性，CC基因型的患者出血發(fā)生率最低為10.0%，CT基因型的患者出血發(fā)生率為16.6%，TT基因型的患者出血發(fā)生率最高為20.6%，并且組間差異有統(tǒng)計學意義[AA vs AC vs CC：20.6%(7/34) vs 16.6%(6/36) vs 10.0%(1/10)，P=0.035]。

表5 非瓣膜性房顫患者單核苷酸多態(tài)性與達比加群酯治療后出血事件的關系

3 討論

達比加群酯是2008年經(jīng)歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)第一個被批準上市的新型口服抗凝藥，此后在2013年獲得我國食品藥品管理局批準上市。達比加群酯治療窗口寬、不需頻繁監(jiān)測凝血指標、體內(nèi)代謝過程不易受食物影響，與傳統(tǒng)的口服抗凝劑華法林相比，可以在一定程度上增強抗凝效果。遺傳因素可影響達比加群酯的藥代動力學與藥效學。ABCB1SNP rs1045642與CES1SNP rs2244613基因多態(tài)性研究較為廣泛。

人ABCB1基因位于7號染色體，其表達產(chǎn)物主要為P-gp蛋白又稱ATP結合盒轉運蛋白B1(ATP-binding cassette transporter B1)，是一種依賴三磷酸腺苷(ATP)的外排轉運蛋白[10]。P-gp蛋白主要分布在具有排泄功能的人體組織中，例如腸、肝、腎上皮細胞膜以及內(nèi)皮細胞，它具有血-組織屏障的作用，保護機體組織(如大腦、胎兒和睪丸)免受有毒外來物質(zhì)的傷害，限制藥物從腸腔吸收[10]。本研究檢測結果顯示，納入研究的非瓣膜性房顫患者在SNP rs1045642位點上有2個等位基因和3組基因型，次要等為基因頻率(T)為33.1%。不同基因型之間的達比加群血漿濃度與臨床出血事件的發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義，提示ABCB1SNP rs1045642對達比加群酯抗凝效果沒有產(chǎn)生太大的影響，此位點基因多態(tài)性不是臨床出血結果的決定性因素。這與Gouin-Thibault等[4]研究得出的結論較為一致。此外，在本研究中ABCB1SNP rs1045642的基因型與凝血指標APTT、TT均無顯著性相關。這與國內(nèi)學者薄雅坤等[11]的研究結果相反，其將患者rs1045642位點基因型分為CC基因型組、TT基因型組和CT基因型組，比較分析不同基因型的患者經(jīng)過達比加群酯治療后血藥濃度與凝血指標的差異。隨后發(fā)現(xiàn)TT基因型相比于CC基因型具有更高的血藥峰濃度和出血風險，并且TT基因型組患者凝血指標APTT與TT值明顯高于CC基因型組。上述研究結果出現(xiàn)明顯差異的原因可能是本研究納入的樣本數(shù)量太少，也可能因為濃度測量方法和凝血試驗試劑的不同導致實驗結論不一致。

人CES1基因位于16號染色體，編碼產(chǎn)物羧酸酯酶1主要功能是促進達比加群酯轉化代謝為有活性的達比加群，廣泛分布于肝臟、單核巨噬細胞和肺泡上皮細胞。CES1基因的遺傳變異可以調(diào)節(jié)或者改變達比加群酯的藥代動力學[12]。CES1SNP rs2244613位點的基因多態(tài)性可改變羧酸酯酶1的活性。羧酸酯酶1在體內(nèi)的活性和功能存在個體性差異，進而影響達比加群酯在體內(nèi)轉化成具有藥理活性的達比加群，因此抗凝效果具有個體性差異。在本研究中，非瓣膜性房顫患者CES1SNP rs2244613基因多態(tài)性可分為3種基因型，次要等為基因(C)的頻率為35.0%。比較不同基因型的達比加群血漿濃度時發(fā)現(xiàn)CES1SNP rs2244613多態(tài)性與谷濃度呈顯著相關，AA基因型患者的谷濃度水平最高、AC基因型患者次之、CC基因型患者最低。與之相關的是，CC基因型患者臨床出血發(fā)生率明顯低于AA基因型患者、AC基因型患者。這些結果可以表明次要等位基因(C)能夠降低谷濃度、減少出血風險，CES1SNP rs2244613基因多態(tài)性可以影響非瓣膜性房顫患者服用達比加群酯的抗凝效果。Paré等[13]在RY-LY試驗中也得到相似的結論，其研究指出與未攜帶次要等位基因的患者相比，攜帶1個次要等位基因(C)的患者谷值下降約15%，攜帶2個次要等位基因的患者血藥濃度較未攜帶者血藥濃度谷值下降約28%，并且此位點遺傳效應大于劑量效應，是臨床結局的決定因素。此外，本研究還同時分析CES1SNP rs2244613基因多態(tài)性與凝血指標的關系，結果顯示CC基因型患者谷濃度水平的APTT與TT均低于AA基因型，說明次要等位基因(C)影響谷濃度水平的凝血指標。Liu等[14]也認為rs2244613影響谷濃度TT，等位基因(A)顯著延長TT值。據(jù)報道達比加群血藥濃度與APTT、TT呈正相關[15-16]，推測CC基因型患者的APTT和TT顯著低于AA基因型患者可能是因為CC基因型患者血藥濃度顯著低于AA型患者，即患者ABCB1基因多態(tài)性通過改變達比加群酯藥代動力學來影響凝血功能，進而影響出血或血栓事件的發(fā)生。這也提示AA基因型患者可以通過APTT或TT來監(jiān)測血藥濃度，及時調(diào)整服用劑量減少臨床不良事件發(fā)生率。

綜上所述，ABCB1基因多態(tài)性可能對達比加群酯抗凝治療效果無明顯影響，遺傳因素的作用有待進一步認識。CES1SNP rs2244613上的次要等位基因(C)可以降低血藥濃度谷值與APTT和TT，并且降低輕微出血風險。通過分析患者的CES1SNP rs2244613基因多態(tài)性可能有助于指導臨床調(diào)整抗凝治療方案以及達比加群酯的合理安全用藥，對降低不良事件的發(fā)生大有裨益，從而推進臨床的個體化治療發(fā)展。