陳慧，陳光輝，孫麗麗，黃培堅，黃秋芳(南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院檢驗科，廣東中山510515)

膿毒癥(neonatal sepsis)是指細(xì)菌、病毒及真菌等入侵機(jī)體血液循環(huán)，產(chǎn)生毒素導(dǎo)致全身嚴(yán)重感染和器官損傷的臨床綜合征，是造成新生兒死亡的重要原因[1-2]。新生兒膿毒癥可進(jìn)展成新生兒急性呼吸窘迫綜合征、難治性新生兒呼吸衰竭、膿毒癥休克，甚至導(dǎo)致死亡[3-4]。盡管有創(chuàng)/無創(chuàng)呼吸支持技術(shù)和肺泡表面活性物質(zhì)的臨床應(yīng)用在一定程度上提高了新生兒膿毒癥的存活率，但新生兒膿毒癥的發(fā)生率和發(fā)生后遺癥的概率仍然較高，主要是由于新生兒肺部對感染敏感性增強(qiáng)、免疫功能不全[5-6]。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)旨在尋找協(xié)同表達(dá)的基因模塊(module)，并探索基因網(wǎng)絡(luò)與關(guān)注的表型之間的關(guān)系及關(guān)鍵基因(hub基因)[7]。本研究通過WGCNA分析膿毒癥有、無休克患兒基因模塊，確定hub基因，為新生兒膿毒癥診斷提供潛在的分子標(biāo)志物。

1 材料和方法

1.1數(shù)據(jù)下載 從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載與膿毒癥患兒相關(guān)的表達(dá)矩陣。篩選標(biāo)準(zhǔn)：(1)具有對照和膿毒癥患兒樣本；(2)樣本總個數(shù)≥50。最終選取膿毒癥患兒相關(guān)基因表達(dá)矩陣(gene set enrichment，GSE)119217用于本研究，其中對照12例，膿毒癥無休克患兒81例，膿毒癥休克患兒41例，共134例，樣本類型為外周血。對于該芯片數(shù)據(jù)，首先根據(jù)芯片對應(yīng)的平臺信息進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換，然后使用具有原始數(shù)據(jù)讀取、數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)預(yù)處理、對多種實驗設(shè)計進(jìn)行差異分析等功能的limma程序包進(jìn)行校正。

1.2WGCNA分析 WGCNA通過基因在樣本中表達(dá)的相似性確定基因模塊后，提供相應(yīng)的函數(shù)關(guān)聯(lián)基因模塊與臨床信息，進(jìn)而識別有臨床意義的基因模塊。與臨床特征有顯著意義(gene significance，GS)和作為模塊成員(module membership，MM)的基因定義為模塊基因。選擇與臨床特征相關(guān)程度最高的基因模塊，根據(jù)模塊成員相關(guān)值(correlation with module membership，cor.MM)>0.8和基因顯著意義相關(guān)值(correlation with gene significance，cor.GS)>0.45篩選模塊基因。拓?fù)渲丿B矩陣(topology overlap matrix，TOM)根據(jù)軟閾值構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

1.3差異表達(dá)基因分析 將樣本數(shù)據(jù)分為：對照組和膿毒癥無休克組，對照組和膿毒癥休克組。使用R包的limma篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed gene，DEG)。DEG的篩選閾值均設(shè)定為log2Fold Change>2和P<0.05。

1.4DEG富集分析 2個分組間DEG分別用R包clusterProfiler進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析，設(shè)置條件均為P<0.05。

1.5hub基因篩選 模塊基因和差異基因取交集，即為hub基因。采用R語言對hub基因進(jìn)行表達(dá)量分析。

1.6hub基因檢測 取南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院收集的健康兒血液樣本、膿毒癥休克患兒血液樣本和膿毒癥無休克患兒血液樣本外周靜脈血，3 000 r/min離心10 min，取上層血清液進(jìn)行實時定量熒光PCR(qRT-PCR)實驗(Bio-Rad，#CFX96)，具體步驟為：Trizol法提取總RNA，稀釋后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒[PrimeScript RT Master Mix(Takara, #RR036A)]逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，其反應(yīng)體系包括RTace 0.5 μL，RT 5×Buffer 4 μL，RNase抑制劑0.5 μL，稀釋后的RNA 12 μL，逆轉(zhuǎn)錄引物RT prime 1 μL，dNTP 2 mL，逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 60 min，72 ℃ 10 min，4 ℃保存；將hub基因的核苷酸序列導(dǎo)入Primer express 2.0生物軟件，結(jié)合引物的設(shè)計原則進(jìn)行設(shè)計。引物均由上海生工生物工程公司合成，并使用生物染料法熒光定量試劑盒 [SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Takara，#RR420A)]進(jìn)行擴(kuò)增，其反應(yīng)體系包括cDNA 2 μL，realtime PCR Master Mix 12.5 μL，F(xiàn)orward引物0. 5 μL，Reverse引物0.5 μL， ddH2O 9.5 μL， PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃變性3 min，60 ℃退火，40個擴(kuò)增循環(huán)(95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30s熒光信號收集)。采用相對定量的比較Ct法，即2-△△Ct法檢測hub基因相對水平，以GAPDH的表達(dá)作為內(nèi)參。 qRT-PCR 引物如表1所示。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1WGCNA分析 對樣本進(jìn)行聚類分析，查看是否有離群樣本，設(shè)置cut-off值為80，去除4個離群樣本。樣本聚類信息結(jié)合樣本特征，得到聚類特征熱圖(圖1A)。使用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龃_定軟閥值為5。根據(jù)軟閾值構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(圖1B)，分析樣本特征與模塊的關(guān)系。根據(jù)樣本特征，挑選與膿毒癥無休克患兒顯著相關(guān)的棕色模塊，進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)值(Correlation，cor)=0.53，P<0.001，圖1C;根據(jù)樣本特征，挑選與膿毒癥休克患兒顯著相關(guān)的黃色模塊，進(jìn)行相關(guān)性分析，cor=0.55，P<0.001，見圖1D。

注：A，聚類特征熱圖；B，共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果；C，棕色(brown)模塊；D，黃色(yellow)模塊。

2.2DEG分析 對照樣本與膿毒癥無休克患兒樣本存在41個DEG，包括35個上調(diào)DEG和6個下調(diào)DEG(圖2A和圖2B)。對照樣本與膿毒癥休克患兒樣本存在109個DEG，包括73個上調(diào)DEG和36個下調(diào)DEG (圖3A和圖3B)。

注：A，DEG熱圖；B，DEG火山圖。

A，DEG熱圖；B，DEG火山圖。

2.3DEG富集分析 用R程序包的ClusterProfiler進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)膿毒癥無休克患兒DEG與膿毒癥休克患兒DEG主要富集于中性粒細(xì)胞脫粒，中性粒細(xì)胞活化參與的免疫反應(yīng)(圖4A和圖4C)，參與調(diào)控NOD樣受體信號通路和哮喘(圖4B和圖4D)。

注：A，對照樣本和膿毒癥無休克樣本DEG GO富集分析；B，對照樣本和膿毒癥休克樣本DEG GO富集分析；C，對照樣本和膿毒癥無休克樣本DEG KEGG富集分析；D，對照樣本和膿毒癥休克樣本DEG KEGG富集分析。

2.4膿毒癥無休克患兒樣本hub基因分析 51個棕色模塊基因與41個DEG取交集得到8個hub基因(AIM2、CARD17、CMPK2、IFI44、IFI44L、LAP3、RTP4和SERPING1),均在膿毒癥無休克患兒血液樣本中高表達(dá)(表2)；qRT-PCR結(jié)果表明8個hub基因在膿毒癥無休克患兒血液樣本中水平升高(表3)。

表2 hub基因在對照樣本和膿毒癥無休克患兒樣本中的水平

表3 qRT-PCR檢測hub基因在對照樣本和膿毒癥無休克患兒樣本中的水平

2.5膿毒癥休克患兒樣本hub基因分析 74個黃色模塊基因與109個DEG取交集得到2個hub基因(AHSP和HBD),均在膿毒癥休克患兒血液樣本中高表達(dá)(表4)；qRT-PCR結(jié)果表明AHSP和HBD基因在膿毒癥休克患兒血液樣本中水平升高(表5)。

表4 hub基因在對照樣本和膿毒癥休克患兒樣本中的水平

表5 qRT-PCR檢測hub基因在對照樣本和膿毒癥休克患兒樣本中的水平

3 討論

膿毒癥是導(dǎo)致新生兒死亡的常見疾病，如未得到快速且正確的治療，新生兒膿毒癥可進(jìn)展至多器官衰竭，增加死亡風(fēng)險[8]。因此尋找新生兒膿毒癥診斷標(biāo)記物具有重要的臨床意義。在本研究中，我們證實膿毒癥無休克患兒8個hub基因(AIM2、CARD17、CMPK2、IFI44、IFI44L、LAP3、RTP4和SERPING1)和膿毒癥休克患兒2個hub基因(AHSP和HBD)可能參與新生兒膿毒癥發(fā)展。

黑素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，通過招募凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)，誘導(dǎo)炎性小體組裝，加重炎癥反應(yīng)[9-10]。通過分析關(guān)節(jié)炎患兒嗜中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)AIM2水平上調(diào)，與免疫失調(diào)相關(guān)[11]。筆者分析發(fā)現(xiàn)膿毒癥無休克患兒樣本DEG調(diào)控炎性小體相關(guān)的NOD樣受體信號，且AIM2水平在膿毒癥無休克患兒血液樣本中顯著升高。干擾素誘導(dǎo)蛋白44(interferon-inducible 44，IFI44)和干擾素誘導(dǎo)樣蛋白44(interferon-inducible 44 like，IFI44L)參與機(jī)體抗病毒感染過程，急性呼吸窘迫綜合征患者的全血轉(zhuǎn)錄組中IFI44水平升高[12]，在感染性休克患者外周血單核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組中IFI44、IFI44L等基因水平異常[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFI44和IFI44L水平在膿毒癥無休克患兒血液樣本中升高。血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)COVID-19患者C1抑制蛋白(SERPING1)表達(dá)增加[14]。Leite等[15]利用生物信息學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者α-血紅蛋白穩(wěn)定蛋白 (α-hemoglobin stabilizing Protein，AHSP)和人β-防御素 (human β-defensin，HBD)水平升高。與該研究相似，本次實驗證實膿毒癥休克患兒血液樣本中AHSP和HBD基因水平顯著升高。

此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)新生兒膿毒癥的差異基因主要富集于中性粒細(xì)胞脫粒，中性粒細(xì)胞活化以及中性粒細(xì)胞激活等反應(yīng)，調(diào)控NOD樣受體信號等通路。已有研究證實中性粒細(xì)胞活化和脫粒介導(dǎo)的免疫功能障礙是導(dǎo)致新生兒膿毒癥發(fā)生的重要原因[16-18]。最后本研究確定了與膿毒癥無休克患兒臨床特征相關(guān)聯(lián)的51個棕色模塊基因和與膿毒癥休克患兒臨床特征相關(guān)聯(lián)的74個黃色模塊基因，與本分析方法類似，Cheng等[19]利用膿毒癥患者的全血RNA表達(dá)譜中鑒定出23個膿毒癥差異表達(dá)模塊基因。這些結(jié)果突出臨床相關(guān)模塊基因在新生兒膿毒癥進(jìn)展中的重要性。

綜上所述，通過WGCNA和生物信息學(xué)分析新生兒膿毒癥相關(guān)的模塊基因與差異基因，確定8個膿毒癥無休克患兒hub基因和2個膿毒癥休克患兒hub基因均高表達(dá)，為新生兒膿毒癥診斷提供潛在的標(biāo)志物，但其調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。