張國平，顧秀玉，翟光華，閆美娜(南京醫(yī)科大學(xué)姑蘇學(xué)院&南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院&蘇州市立醫(yī)院北區(qū)檢驗科，江蘇蘇州215008)

卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤，高轉(zhuǎn)移率是卵巢癌致死的主要原因[1]。細胞骨架的破壞可以抑制卵巢癌細胞的遷移及侵襲，進而抑制轉(zhuǎn)移[2]。組蛋白去甲基化酶[lysine(K)-specific demethylase 2B, KDM2B]，又名 FBXL10、JHDM1B 或NDY1，是一類重要的組蛋白脫甲基酶，主要發(fā)揮組蛋白 H3上賴氨酸4的三甲基化(tri-methylation of lysine 4 on histone H3，H3K4me3)和組蛋白H3上賴氨酸36的二甲基化(dimethylation of histone H3 at K36，H3K36me2)的脫甲基酶活性。研究發(fā)現(xiàn)， KDM2B可以通過PI3K/AKT信號通路，調(diào)控結(jié)腸癌干細胞的干性[3]；KDM2B還可以調(diào)控前列腺癌細胞的骨架排列，促進其遷移及侵襲[4]。然而，KDM2B在卵巢癌細胞骨架排列中的作用機制尚不明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，KDM2B在卵巢癌組織中的表達水平升高，并可促進卵巢癌細胞遷移。本研究擬探討KDM2B在卵巢癌細胞骨架排列中的調(diào)控作用，并進一步分析KDM2B的調(diào)控機制。

1 資料與方法

1.1細胞系、儀器及試劑 人胚腎細胞293T由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床血液學(xué)檢驗教研室許文榮教授惠贈，人卵巢癌細胞系 HO8910由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室盧小東教授惠贈。實時熒光定量PCR儀(Light Cycler480 Ⅱ，瑞士Roche公司)，超微量核酸分析儀(杭州奧盛儀器公司)，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技公司)，共聚焦顯微鏡(德國蔡司公司)。KDM2B過表達慢病毒質(zhì)粒購自美國Addgene公司，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Gibco公司)，胰蛋白酶(美國Sigma公司)，RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)、實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR Pre-mix Ex TaqⅡ)購自日本TaKaRa公司，鬼筆環(huán)肽染色試劑盒、嘌呤霉素和聚凝胺試劑(上海翊圣生物科技公司)，RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑以及青、鏈霉素(上海碧云天公司)，兔抗人KDM2B多克隆抗體(美國Millipore公司)，兔抗人FAK多克隆抗體(美國CST公司)， 鼠抗人GAPDH單克隆抗體、羊抗兔IgG(H+L)抗體(武漢三鷹生物公司)，HRP偶聯(lián)的抗小鼠/兔IgG二抗(杭州聯(lián)科生物公司)。

1.2細胞培養(yǎng) HEK-293T細胞、人卵巢癌HO8910細胞用DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清+1%青、鏈霉素)培養(yǎng)，并置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。每2～3 d換液1次，待細胞融合度達80%時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，取生長狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)試驗。

1.3穩(wěn)定敲減和過表達KDM2B卵巢癌細胞系的建立 在美國Sigma Aldrich公司網(wǎng)站(https://www.sigmaaldrich.com)檢索人KDM2B shRNA序列：CCGGCGGCCTTTACAAGAAGACATTCTCGAGA

ATGTCTTCTTGTAAAGGCCGTTTTTGAATT，送廣州艾基生物公司構(gòu)建KDM2B shRNA慢病毒載體。將KDM2B shRNA慢病毒質(zhì)粒、KDM2B過表達的質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞。各質(zhì)粒的比例為目的質(zhì)?！胮sPAX2∶PMD2.0G=3∶2∶1。 按照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，收集病毒，感染細胞。分別將3組慢病毒原液(空載慢病毒、KDM2B shRNA病毒和KDM2B過表達病組)加入HO8910細胞，聚凝胺濃度為 8 μg/mL，感染24 h后換液， 48 h 后進行二次感染。待細胞融合度達70%時，用嘌呤霉素(1 mg/mL)篩選2周，獲得穩(wěn)定敲減和過表達KDM2B的HO8910卵巢癌細胞系。

1.4F-actin熒光染色法 實驗分為3組:HO8910對照組(慢病毒空載組)、HO8910-KDM2B敲減組和HO8910-KDM2B過表達組。將多聚賴氨酸處理的無菌細胞圓形爬片置于24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，2.5 g/L胰蛋白酶消化各組細胞成單個細胞懸液，鋪板，待細胞融合度達50%時，按照F-actin染色說明書進行細胞骨架蛋白染色，步驟：4%多聚甲醛溶液固定細胞，PBS清洗3次；0.5% Triton-X 100溶液透化處理細胞，PBS清洗3次；每組加200 μL TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液，濃度為5 μg/mL，PBS洗滌細胞3次；每孔加入200 μL DAPI溶液，對細胞核進行復(fù)染，PBS洗滌，封片。熒光共聚焦顯微鏡下觀察3組細胞骨架蛋白F-actin的表達及排列的變化。實驗重復(fù)3次。

1.5KDM2B敲減組轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序 采用10 cm細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)HO8910對照組及KDM2B敲減組細胞，待細胞融合度達80%時，加入TRizol試劑，由上?？党缮锕静捎肐llumina Hiseq 4000測序儀進行轉(zhuǎn)錄組測序，并對2組細胞差異表達基因進行Pathway富集分析。利用統(tǒng)計學(xué)算法(Fisher′s exact test)找出1組差異表達基因和KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg)中的哪些生物學(xué)通路功能條目聯(lián)系最大，分析結(jié)果中每個Pathway條目對應(yīng)1個統(tǒng)計值P-value(表示顯著性)，P-value越小表示該Pathway條目和輸入的差異表達基因聯(lián)系越大，即該組差異表達基因大部分具有該Pathway條目對應(yīng)的描述功能。

1.6免疫熒光染色試驗 試驗分組同上，待細胞融合度達50%時，參照文獻[5]進行免疫熒光染色，步驟：4%多聚甲醛固定細胞，PBS洗滌3次；加入Triton X-100C透化處理，PBS洗滌3次，每次5 min；3% BSA封閉1 h，加入兔抗人FAK多克隆抗體(1∶100稀釋)，4 ℃過夜；PBS洗滌3次，每次5 min，避光溫育FITC標(biāo)記的熒光二抗(1∶200稀釋)1 h；加入抗熒光猝滅劑，封片，熒光共聚焦顯微鏡下觀察3組細胞FAK蛋白熒光強度及細胞分布變化。實驗重復(fù)3次。

1.7western blot 試驗分組同1.4，各組細胞達80%融合度時，用預(yù)冷PBS緩沖液洗滌2次，每孔加入200 μL RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，刮下細胞，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸取蛋白質(zhì)上清， BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，加入5×loading buffer煮沸，進行SDS-PAGE電泳,每組蛋白質(zhì)樣本40 μg，電泳條件60 V 40 min，110 V 80 min，使用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，溫育加入兔抗人KDM2B多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶5 000稀釋);使用HRP偶聯(lián)的抗小鼠/兔IgG二抗(1∶5 000稀釋)室溫溫育2 h，將 PVDF 膜與曝光液充分混勻后，進行曝光，以檢測KDM2B蛋白的表達水平。采用ImageJ軟件進行蛋白質(zhì)條帶灰度值分析，以目標(biāo)蛋白灰度值/對應(yīng)內(nèi)參灰度值作為該組目標(biāo)蛋白的相對表達量，再將對照組設(shè)置為1進行標(biāo)準(zhǔn)化，實驗組蛋白質(zhì)表達量=(實驗組蛋白質(zhì)相對表達量/對照組蛋白質(zhì)相對表達量)。

1.8RNA提取、cDNA逆轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR 按照RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，采用Nano-Drop分光光度儀檢測核酸濃度，吸光度(A260 nm/A280 nm)在1.8～2.0的樣本用于逆轉(zhuǎn)錄實驗。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中GenBank提供的人KDM2B(Gene ID:84678)、ITGA6(Gene ID:3655)、ITGB1(Gene ID:3688)和β-actin(Gene ID:60)的基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件進行引物序列設(shè)計，并由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。 qPCR反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Premix ExTaq Ⅱ(2×)10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.4 μL。每組設(shè)3個復(fù)孔。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共39個循環(huán)。采用熒光定量PCR儀配套的LC480軟件采集65 ℃時的熒光信號并進行熔解曲線分析。實驗重復(fù)3次。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算基因相對定量的表達水平，公式：ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin,ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

表1 RT-PCR引物序列

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism5軟件對數(shù)據(jù)分析和作圖。兩組間數(shù)據(jù)比較采用兩樣本的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1KDM2B敲減及過表達組中KDM2BmRNA和蛋白質(zhì)的水平 RT-qPCR結(jié)果顯示，與對照組相比，KDM2B敲減組KDM2BmRNA水平下降(1.0±1.0 vs 0.48±0.05，t=20.10,P<0.01)，KDM2B過表達組KDM2BmRNA水平升高(1.0±1.0 vs 2.33±0.23，t=9.89，P<0.05)。western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，感染shKDM2B慢病毒的HO8910細胞中KDM2B蛋白的表達水平下降(圖1)，蛋白質(zhì)灰度掃描結(jié)果顯示，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(1.0±1.0 vs 0.53±0.05，t=17.22，P<0.01)；此外，KDM2B過表達組KDM2B蛋白的表達水平升高(圖1)，蛋白質(zhì)灰度掃描結(jié)果顯示兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(1.0±1.0 vs 2.37±0.28，t=8.563，P<0.05)。

圖1 western blot檢測HO8910卵巢癌細胞中KDM2B敲低及過表達后的水平

2.2F-actin免疫熒光染色檢測KDM2B敲減及過表達組中細胞骨架排列 F-actin免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達KDM2B后，F(xiàn)-actin表達明顯增多，細胞骨架排列更規(guī)則有序；而敲低KDM2B后，F(xiàn)-actin表達減少，排列受到破壞(圖2)。

2.3轉(zhuǎn)錄組測序法分析KDM2B敲減組基因富集的信號通路 Pathway分析結(jié)果顯示，差異表達的基因主要集中在FAK(Focal-adhesion)信號通路(圖3A)。采用RT-qPCR檢測FAK信號通路上游分子ITGA6、ITGB1mRNA的表達，結(jié)果顯示敲低KDM2B后，ITGA6(1.0±1.0 vs 0.51±0.03，t=28.29，P<0.05)及ITGB1(1.0±1.0 vs 0.53±0.10，t=8.266，P<0.05)mRNA水平降低，過表達KDM2B后，ITGA6(1.0±1.0 vs 1.9±0.36，t=5.129，P<0.05)及ITGB1(1.0±1.0 vs 2.39±0.48，t=4.958，P<0.05)mRNA水平升高。免疫熒光結(jié)果顯示,KDM2B促進了FAK蛋白的表達(圖 3B)。

注：F-actin熒光染色檢測KDM2B對卵巢癌細胞骨架排列的調(diào)控作用，藍色代表細胞核，紅色代表細胞骨架F-acin(×40)。

注：A，干擾KDM2B后，轉(zhuǎn)錄組測序細胞信號通路分析圖； B，免疫熒光試驗檢測KDM2B對FAK蛋白的分布及表達水平的調(diào)控作用，藍色代表細胞核，綠色代表FAK蛋白，放大倍數(shù)×40，標(biāo)尺20 μm。

2.4GEPIA腫瘤數(shù)據(jù)庫分析FAK在卵巢癌組織中的表達及其與KDM2B的相關(guān)性 利用GEPIA腫瘤數(shù)據(jù)庫分析卵巢癌組織中FAK的表達水平，結(jié)果顯示相對于正常對照組織，卵巢癌組織中FAK的表達上調(diào)(圖4)；相關(guān)性分析顯示，卵巢癌組織中，F(xiàn)AK與KDM2B存在正相關(guān)(r=0.37，P<0.01)。

圖4 GEPIA腫瘤數(shù)據(jù)庫卵巢癌大樣本中FAK的表達水平

3 討論

盡管分子靶向治療、免疫療法等技術(shù)快速發(fā)展，但是晚期卵巢癌患者的五年生存率仍低于30%[6]。腫瘤轉(zhuǎn)移是影響卵巢癌患者預(yù)后的一個重要因素。研究證實，腫瘤轉(zhuǎn)移早期需要依賴細胞骨架蛋白F-actin聚合形成特殊細胞突起來破壞基底膜，侵入組織、血管或淋巴管[7]。破壞細胞骨架排列已經(jīng)成為一種具有臨床應(yīng)用前景的抗腫瘤策略[8]。本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定敲低和過表達KDM2B的卵巢癌細胞系，并且證實KDM2B調(diào)控細胞骨架蛋白F-actin排列。進一步的試驗結(jié)果證實，高表達KDM2B后，F(xiàn)-actin表達增加，排列更加規(guī)則有序，成矛狀伸展，提示細胞具有更高的動力；而敲低KDM2B后，F(xiàn)-actin表達減少，排列受到破壞，沒有規(guī)則。已有的研究證實，KDM2B可以調(diào)控ERRα蛋白的穩(wěn)定性，進而促進乳腺癌細胞的增殖[9]；KDM2B還可以調(diào)控Hippo信號通路，促進胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)進展[10]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)KDM2B可以通過let-7b-EZH2軸促進卵巢癌的進展[11]。上述研究表明，KDM2B具有促進腫瘤進展的作用。本研究結(jié)果支持KDM2B可能通過調(diào)控細胞骨架排列來促進卵巢癌細胞遷移，侵襲，進而促進卵巢癌轉(zhuǎn)移。但KDM2B如何調(diào)控F-actin排列尚需深入研究。

本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在KDM2B敲低細胞組中發(fā)現(xiàn)差異表達的基因主要集中于FAK相關(guān)的信號通路。FAK是一種非受體酪氨酸激酶，可通過整合素和其他細胞表面受體介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)細胞的黏附、遷移、存活、增殖和分化等[12]。研究表明，F(xiàn)AK可以調(diào)控細胞骨架排列，促進細胞遷移[13]；抑制FAK信號通路，可以破壞F-actin的聚合，進而抑制腫瘤細胞遷移侵襲[14]。此外，F(xiàn)AK信號通路激活還可以導(dǎo)致卵巢癌細胞化療耐藥，細胞遷移、侵襲能力增強[15-16]。上述研究提示，KDM2B可能通過激活FAK信號通路來調(diào)控F-actin排列。筆者進一步的研究結(jié)果證實，KDM2B上調(diào)FAK通路上游分子ITGA6及ITGB1的表達，免疫熒光試驗證實KDM2B能促進FAK的表達。因此，筆者推測KDM2B通過活化ITGA6-ITGB1/FAK信號通路，促進卵巢癌細胞骨架重塑。

綜上所述，本研究初步探討了KDM2B在卵巢癌細胞骨架排列中的調(diào)控作用，證實KDM2B促進F-actin表達及重塑，并進一步證實KDM2B活化了ITGA6-ITGB1/FAK信號通路，據(jù)此推測，KDM2B在卵巢癌轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮重要角色。本研究亦存在一定局限性，首先，本研究僅在HO8910卵巢癌細胞系驗證了KDM2B對細胞骨架的調(diào)控作用，后續(xù)需要在其他卵巢癌細胞系驗證，以揭示KDM2B對卵巢癌細胞骨架調(diào)控作用的普遍性。其次，本研究并沒有深入探討KDM2B調(diào)控ITGA6-ITGB1/FAK/F-acin信號通路的具體分子機制。最后，本研究并未在動物實驗中驗證KDM2B對卵巢癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用。