李鑫，楊德全，葛菲菲，沈海瀟，劉健，鞠厚斌，王建，趙洪進(jìn)

(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103)

貓杯狀病毒(feline calicivirus，F(xiàn)CV)是貓科動(dòng)物中廣泛傳播的病原之一，易感貓常因接觸病貓或其分泌物、排泄物及被污染的籠具等而發(fā)病，臨床出現(xiàn)口腔潰瘍、鼻-結(jié)膜炎、跛行、流產(chǎn)和肺炎等癥狀，嚴(yán)重的甚至可導(dǎo)致死亡。此外，有研究表明，F(xiàn)CV在臨床健康貓中帶毒率也較高，臨床健康貓呈持續(xù)感染狀態(tài)，這就有利于病毒在貓群中的傳播，導(dǎo)致病毒發(fā)生變異，產(chǎn)生致死性毒株[1]。由于貓杯狀病毒變異程度高，不同毒株間差異較大，現(xiàn)有的疫苗免疫保護(hù)效果并不理想。

FCV核酸類型為單股正鏈RNA，含有3個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frames，ORFs)，即ORF1、ORF2和ORF3。ORF1編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2編碼衣殼蛋白，為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白；ORF3編碼一個(gè)較小的結(jié)構(gòu)蛋白。ORF2可分為A～F 6個(gè)區(qū)域，其中A區(qū)經(jīng)蛋白酶切割形成成熟的衣殼蛋白，E區(qū)含有主要B細(xì)胞表位[2]。

FCV對(duì)貓腎細(xì)胞(CRFK，F(xiàn)81)、犬腎細(xì)胞(MDCK)等多種細(xì)胞敏感[1,3-4]，病毒在細(xì)胞上可獲得較高的病毒滴度。本研究從發(fā)病寵物貓的鼻拭子中，用F81細(xì)胞分離獲得1株FCV，并進(jìn)行了全基因組擴(kuò)增和序列測(cè)定，對(duì)其ORF2基因進(jìn)行比較與分析，為研究FCV的分子生物學(xué)和將來(lái)疫苗株的研發(fā)提供了參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

貓鼻拭子樣品采集自上海某寵物醫(yī)院的發(fā)病寵物貓。該病貓為雌性貍花貓，2月齡，未進(jìn)行疫苗免疫，主要癥狀為口炎。

1.2 細(xì)胞和主要試劑

F81細(xì)胞，購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司；RNA提取試劑盒，購(gòu)自Magen公司；貓杯狀病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自書扁科技(上海)有限公司；AMV 反轉(zhuǎn)錄酶等試劑，購(gòu)自寶生物(大連)工程公司；引物由上海派森諾生物科技股份有限公司合成。

1.3 病毒分離

將鼻拭子樣品經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾除菌后，接種于F81單層細(xì)胞，培養(yǎng)箱中孵育1 h，補(bǔ)液后將細(xì)胞瓶置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時(shí)，收獲細(xì)胞液，并進(jìn)行熒光RT-PCR鑒定。

1.4 電鏡觀察

將收獲的細(xì)胞液凍融3次后，10 000 r/min離心1 h，除去細(xì)胞碎片，隨后上清液與終濃度為10%的聚乙二醇8000(PEG8000)混合過(guò)夜。在4 ℃下12 000 r/min離心2 h后，用Tris緩沖鹽溶液(TBS)重懸。經(jīng)2%磷鎢酸負(fù)染后，進(jìn)行透射電鏡觀察[5]。

1.5 病毒RNA提取及RT-PCR擴(kuò)增

根據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取病毒RNA，并進(jìn)行全基因序列的擴(kuò)增。引物參考GenBank中已知的FCV全基因序列以及參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行設(shè)計(jì)(表1)。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送上海派森諾生物科技股份有限公司測(cè)序。

表1 全基因擴(kuò)增引物序列

1.6 全基因測(cè)序及ORF2基因分析

將測(cè)回的序列在NCBI(BLAST，http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)上進(jìn)行檢索確認(rèn)，用Lasergene 7.1軟件中的Seqman進(jìn)行拼接，并登錄至GenBank(登錄號(hào)：MT239579)。將所測(cè)FCV的ORF2基因序列分別與 GenBank中收錄的國(guó)內(nèi)外參考序列進(jìn)行比對(duì)，用 Megalign、MEGA 6.0等軟件繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離

正常的F81細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞間緊密排列，接種鼻拭子樣品后，24 h出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、變圓、脫落，呈葡萄串樣病變。取上清，經(jīng)貓杯狀病毒熒光RT-PCR試劑盒鑒定為FCV陽(yáng)性。將該分離株命名為SH1。繼續(xù)在細(xì)胞上傳代2次，均在24 h左右出現(xiàn)細(xì)胞病變。各代次的病毒滴度分別為10-8.8、10-8.0和10-9.3TCID50/mL。

2.2 電鏡觀察

FCV-SH1株的F81細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)病毒粒子呈球形，無(wú)囊膜，大小35～40 nm(圖1)，符合FCV的形態(tài)特征。

圖1 分離株的電鏡觀察

2.3 病毒全基因組擴(kuò)增

用表1中3對(duì)引物對(duì)FCV-SH1進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，可以觀察到約2 400、2 900和2 400 bp左右的3個(gè)條帶(圖2)，與預(yù)期相符。

2.4 ORF2基因同源性分析

FCV-SH1株ORF2序列與GenBank中登錄的29株國(guó)內(nèi)外參考毒株的ORF2序列進(jìn)行了同源性比較與分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)CV-SH1株與其他各毒株的核苷酸同源性為74.1%～79.7%，與中國(guó)HRB-SS株的同源性最高，與中國(guó)SH株同源性最低；氨基酸同源性為84.5%～90.9%，與美國(guó)Urbana株同源性最高，與中國(guó)FB-NJ-13同源性最低。與疫苗株F9、F4、225和2024的核苷酸同源性為76.8%～77.7%，氨基酸同源性為86.5%～88.3%。

M. DL15000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. P1/P2引物擴(kuò)增產(chǎn)物；2. P3/P4引物擴(kuò)增產(chǎn)物；3. P5/P6引物擴(kuò)增產(chǎn)物

2.5 ORF2基因的遺傳演化及部分位點(diǎn)分析

本研究將分離株與29株國(guó)內(nèi)外流行株的衣殼蛋白基因(ORF2)進(jìn)行了序列分析，并繪制了核苷酸和氨基酸遺傳進(jìn)化樹(shù)(圖3)。結(jié)果顯示，30株FCV毒株可以分為2個(gè)大分支，即基因群Ⅰ和Ⅱ，核苷酸和氨基酸序列遺傳進(jìn)化樹(shù)是一致的，分離株屬于基因群Ⅰ。從核苷酸序列進(jìn)化樹(shù)(圖3A)可以看出，分離株與中國(guó)HRB-SS株和新西蘭KCD株同屬一個(gè)小分支；在氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)(圖3B)中，分離株與美國(guó)Urbana株在同一小分支上。分離株所屬大分支上為來(lái)自國(guó)內(nèi)和其他國(guó)家的不同分離株，說(shuō)明FCV的分布可能無(wú)明顯的地域性差異。

ORF2可分為A～F 6個(gè)區(qū)域，分析其中B～F區(qū)370～580氨基酸發(fā)現(xiàn)，基因群Ⅰ和Ⅱ主要存在3個(gè)氨基酸殘基的差異，即377、539和557位氨基酸。如表2所示，基因群Ⅰ分別為天冬酰胺(Asn，N)、丙氨酸(Ala，A)、甘氨酸(Gly，G)，而基因群Ⅱ分別為賴氨酸(Lys，K)、纈氨酸(Val，V)、絲氨酸(Ser，S)。

▲本試驗(yàn)分離株FCV-SH1；●疫苗株

表2 貓杯狀病毒ORF2基因群Ⅰ和Ⅱ的氨基酸序列分析

3 討論

FCV主要引起家貓出現(xiàn)急性或慢性上呼吸道疾病，而且有許多貓是無(wú)癥狀的攜帶者[1]，使得病毒在貓群中廣泛傳播。1998年以來(lái)，美國(guó)及歐洲報(bào)道了多例與FCV感染相關(guān)的嚴(yán)重全身性疾病(virulent systemic disease，VSD)[6-10]。VSD FCV毒株能導(dǎo)致受感染的貓面部和四肢浮腫、高燒、黃疸、胰腺炎和出血等，死亡率高達(dá)60%，即使是接種了疫苗的貓也有可能會(huì)發(fā)生感染[7]，這使本病的防控面臨很大的挑戰(zhàn)。

ORF2基因編碼衣殼蛋白，ORF2序列的比較分析可用于闡明不同F(xiàn)CV毒株之間的進(jìn)化關(guān)系[11-12]。本研究選取了29株來(lái)自美國(guó)、英國(guó)、德國(guó)、日本、韓國(guó)等國(guó)家的毒株，與分離株進(jìn)行了ORF2基因的同源性、遺傳演化關(guān)系及部分位點(diǎn)的分析。本分離株與分離自犬的213/95株的核苷酸與氨基酸同源性分別為78.0%和88.8%；與分離自獵豹的V276株、GD株和SH株的同源性分別為76.6%，75.3%，74.1%和87.7%，85.7%，84.6%，說(shuō)明不同宿主的FCV分離株差異性不明顯。從遺傳演化關(guān)系來(lái)看，分離株與美國(guó)Urbana株、新西蘭KCD株等其他不同國(guó)家的毒株在同一分支，且關(guān)系相對(duì)較近，說(shuō)明基因群Ⅰ的FCV分布無(wú)明顯的地域性?；蛉孩蛑饕莵?lái)自中國(guó)和日本的毒株，這可能是中國(guó)和日本特有的，由于所選毒株數(shù)量有限，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。疫苗株都是屬于基因群Ⅱ，可能是目前免疫效果不理想的原因之一。

Sato等[13]報(bào)道基因群Ⅰ和Ⅱ在ORF2的B、F區(qū)有4個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異，即377、539、557和566位氨基酸?；蛉孩穹謩e為Asn或Asp(N或D)，Ala或Pro(A或P)，Gly(G)，Phe或Leu(F或L)，而基因群Ⅱ分別為L(zhǎng)ys(K)，Val(V)，Ser(S)，Tyr(Y)。本研究中基因群Ⅰ和Ⅱ僅在377、539、557位點(diǎn)表現(xiàn)出一致性的差異，分別為N、A、G和K、V、S；566位點(diǎn)處的氨基酸殘基在基因群Ⅰ和Ⅱ中都為F或Y，沒(méi)有表現(xiàn)出特征性差異，與Sato等[13]的報(bào)道不一致，但與Sun等[14]的報(bào)道一致。而這3個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異是否對(duì)毒株的毒力、致病性等有影響還需要后續(xù)深入研究。

FCV抗原變異性很強(qiáng)[15]，這意味著沒(méi)有疫苗能中和所有的病毒株，導(dǎo)致當(dāng)前疫苗免疫很難起到有效的保護(hù)。因此，加強(qiáng)FCV的監(jiān)測(cè)，分離更多毒株，并了解其分子生物學(xué)特性，能夠?yàn)榻窈蠛Y選疫苗候選株和研發(fā)具有較好交叉保護(hù)性的疫苗提供科學(xué)參考。