陳詠君 郎華 徐芳芫 劉姝 趙男

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是一種條件致病菌,同時(shí)也是醫(yī)院感染的主要病原菌之一［1］。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用以及抗菌藥物使用量的不斷增加,多重耐藥銅綠假單胞菌(multi-drug resistance Pseudomonas aeruginosa,MDRP)及泛耐藥銅綠假單胞菌不斷產(chǎn)生［2］。亞胺培南屬于碳青霉烯類藥物中常用的一種,近年來(lái),由于亞胺培南在臨床上的大量使用,導(dǎo)致耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌引起的感染不斷增多,這些問(wèn)題已經(jīng)成為威脅人們健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題,同時(shí)耐藥菌的增加也是臨床治療的重要挑戰(zhàn)。尤其是由于我國(guó)抗生素的廣泛應(yīng)用,使得我國(guó)部分細(xì)菌的耐藥顯著高于西方國(guó)家［3］。因此,檢測(cè)醫(yī)院內(nèi)的耐藥情況,找尋其耐藥的機(jī)制,是亟待解決的問(wèn)題。本研究對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行了探討,旨在為臨床合理使用抗菌藥物治療銅綠假單胞菌的感染提供較有價(jià)值的依據(jù)?，F(xiàn)對(duì)沈陽(yáng)某教學(xué)醫(yī)院2017～2019年銅綠假單胞菌感染情況進(jìn)行回顧性分析,并將收集的耐亞胺培南銅綠假單胞菌進(jìn)行耐藥機(jī)制研究,結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院2017年1月～2019年12月所有臨床送檢樣本中分離的253 株銅綠假單胞菌,其中亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌15 株。來(lái)自同一患者相同部位的菌株只分析第1 株。標(biāo)本包括痰、膿、咽拭子等。銅綠假單胞菌(ATCC27853)由衛(wèi)健委臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 細(xì)菌基因提取試劑盒(上海生工有限公司)；Tag 酶及 PCR 相關(guān)試劑(上海生工有限公司)；PCR 引物(上海生工有限公司合成)；全自動(dòng)微生物鑒定分析儀(法國(guó)生物梅里埃)、PCR 儀(上海宏石)、電泳儀(美國(guó)伯樂(lè))、恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海)；超速低溫離心機(jī)(美國(guó)賽默飛)；紫外凝膠成像儀(美國(guó) Alpha Innotech)。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 公布的基因序列,利用Primer Premier 5.0軟件及參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)［4］,引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因引物一覽表

1.4 方法

1.4.1 DNA 提取 嚴(yán)格按照操作說(shuō)明提取基因組DNA。

1.4.2 PCR 擴(kuò)增體系 擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25 μl,DNA模板3 μl,上下引物各0.5 μl,2×TaqPCRMasTerMix 12.5 μl 加無(wú)菌去離子水至 25 μl。

1.4.3 PCR 反應(yīng)條件 基因熱循環(huán)擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃ 延伸1 min,共30 個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min。

1.4.4 瓊脂糖凝膠電泳 1 g 瓊脂糖粉末與100 ml 0.5×TBE 緩沖液混合加熱煮沸,冷卻至80℃后,制備成1%的瓊脂糖凝膠。2 μl 上樣緩沖液與5 μl PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物混合后加入1%瓊脂糖凝膠孔,10×TBE 為電泳緩沖液,用水平式電泳槽140 V,電流為80 mA,時(shí)間為40 min。EB 染色20 min,300 nm 紫外燈觀察結(jié)果,凝膠成像系統(tǒng)成像。

2 結(jié)果

15 株亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌檢出OprD2 基因5 株(見(jiàn)圖1)、blaVIM 基因4 株(見(jiàn)圖2)、blaOXA-10基因8 株(見(jiàn)圖3)；均未檢出blaGES、blaIMP、blaGIM、blzSIM、blaTEM、blaPER、blaVEB 基因。

圖1 OprD2 基因PCR 電泳擴(kuò)增圖M:marker 1～15 為標(biāo)本

圖2 VIM 基因PCR 電泳擴(kuò)增圖M:marker 1～10 為標(biāo)本

圖3 OXA-10 基因PCR 電泳擴(kuò)增圖M:marker 1～10 為標(biāo)本

3 討論

銅綠假單胞菌分布廣泛,廣泛分布于自然界、土壤、水、空氣、人體皮膚、腸道、呼吸道。同時(shí)銅綠假單胞菌也是臨床上最常見(jiàn)的條件致病菌之一,其以呼吸系統(tǒng)感染為主,現(xiàn)已成為醫(yī)院感染的主要病原菌之一［5,6］。最近一些年,碳青霉烯類廣譜抗生素在臨床的大量應(yīng)用,導(dǎo)致臨床分離的耐碳青霉烯的銅綠假單胞菌出現(xiàn)上升現(xiàn)象。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制包括以下幾種［7,8］：①細(xì)菌產(chǎn)生滅活酶；②膜通透性下降；③抗菌藥物作用靶位改變；④細(xì)菌生物被膜形成；⑤基因突變；⑥獲得外源性耐藥基因；⑦其他耐藥機(jī)制。在以上的這些耐藥機(jī)制中,金屬β-內(nèi)酰酶(MBL)是銅綠假單胞菌產(chǎn)生的最主要碳青霉烯酶,此耐藥機(jī)制可以水解除氨曲南以外所有β-內(nèi)酰胺酶類抗生素。同時(shí)外膜孔蛋白OprD2 是碳青霉烯類抗生素進(jìn)入菌體內(nèi)的特異性通道,而外膜孔蛋白OprD2 的缺失將導(dǎo)致銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥［9］。對(duì)于耐碳青霉烯酶銅綠假單胞菌國(guó)內(nèi)外的研究如下：國(guó)際方面已經(jīng)檢出blaIMP、blaVIMb、blaSIM、blaSPM、blaGIM、blsAIM 基因,而國(guó)內(nèi)關(guān)于銅綠假單胞菌的研究是已檢出blaIMP、blaVIM、blaSPM 基因,其中blaIMP、blaVIM 這兩個(gè)基因檢出較多［10-12］。

有研究表明,耐碳青霉烯酶的銅綠假單胞菌的分離率每年都在增長(zhǎng),本次研究中痰液標(biāo)本分離率為最高,這和陶春梅等［13］的報(bào)道結(jié)果相符。本此研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,2017年1月～2019年12月,沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院共分離出253 株銅綠假單胞菌。這253 株銅綠假單胞菌感染主要以痰標(biāo)本為主,共240 株,所占比例為94.9%；其次是尿液6 株,所占比例為2.4%；分泌物3 株,所占比例為1.2%；膿汁2 株,所占比例為0.8%。從病房的分布情況來(lái)看,檢出菌株率分別是呼吸、干診三病房、冠心病監(jiān)護(hù)病房(CCU)、干病房、神經(jīng)外科病房等。其中呼吸病房共檢出68 株,占26.9%；干三病房共檢出67 株,占26.5%；CCU 共檢出29 株,占11.5%。其中慶大霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率均較高,在2018年慶大霉素的耐藥率達(dá)到63.5%,為耐藥率最高；多粘菌素B 為3年來(lái)耐藥率最低?；仡櫺苑治鲞^(guò)去3年本院的耐藥情況,總體在2019年得到有效控制。這和醫(yī)院這些年對(duì)于耐藥問(wèn)題的重視有關(guān),積極控制抗生素的使用有很大的關(guān)系［14］。

本研究中15 株耐碳青霉烯酶銅綠假單胞菌攜帶耐藥基因結(jié)果如下：其中外膜孔蛋白 OprD2 缺失5 株,攜帶率為33.3%；VIM 型陽(yáng)性4 株,攜帶率為26.7%；OXA-10 型陽(yáng)性8 株,攜帶率為53.3%；未擴(kuò)增出其他基因型。外膜孔蛋白OprD2 是一類底物特異性蛋白,它可促進(jìn)碳青霉烯類藥物、氨基酸等進(jìn)入細(xì)胞,外膜孔蛋白OprD2 基因缺失或降低可以使抗生素不能進(jìn)入到指定的部位發(fā)揮其作用,從而增加銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯酶類藥物產(chǎn)生的耐藥機(jī)制［15,16］。本次研究中檢測(cè)出外膜孔蛋白OprD2 缺失5 株,說(shuō)明外膜孔蛋白OprD2 缺失可能是沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的重要原因之一。同時(shí)本次研究中外膜孔蛋白OprD2 基因缺失率與韋柳華［17］報(bào)道的16.13%的報(bào)道相接近,但是與華東地區(qū)的袁莉莉等［18］報(bào)道的缺失率85.6%和黑龍江地區(qū)的劉沫然等［19］報(bào)道的缺失率86.3%存在一定差異。這可能與菌株來(lái)源、標(biāo)本收集例數(shù)、臨床用藥習(xí)慣、醫(yī)院對(duì)于院感重視程度等一系列原因有關(guān)。目前認(rèn)為MDRP 對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的機(jī)制非常復(fù)雜,在本次研究中發(fā)現(xiàn)攜帶OXA-10 耐藥基因的細(xì)菌8 株,這說(shuō)明了可能產(chǎn)抗生素水解酶耐藥機(jī)制在本研究菌株介導(dǎo)的耐藥過(guò)程中占主導(dǎo)地位,對(duì)于本院銅綠假單胞菌產(chǎn)抗生素水解酶耐藥機(jī)制,會(huì)在后續(xù)研究中報(bào)道。雖然有研究指出產(chǎn)生金屬酶和外膜孔蛋白OprD2 缺失是引起銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯酶耐藥的主要原因［20,21］,但是這種現(xiàn)象與本研究還是存在一定的差異,本研究外膜孔蛋白OprD2 基因缺失是引起銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥的主要原因之一。

本此研究結(jié)果顯示,2017～2019年沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院收集的15 株耐碳青霉烯酶銅綠假單胞菌中,發(fā)現(xiàn)個(gè)別菌株未出現(xiàn) OprD2 基因的缺失,也未出現(xiàn)金屬酶耐藥機(jī)制,在本次研究耐碳青霉烯酶銅綠假單胞菌中,可能有其他耐藥機(jī)制的存在,例如主動(dòng)外排系統(tǒng)的過(guò)度表達(dá)；或者是生物膜的形成,使抗菌藥物不能有效到達(dá)作用部位等。對(duì)于這些菌株將在后續(xù)的研究中,為臨床及醫(yī)院的感染控制提供依據(jù),同時(shí)也可對(duì)耐碳青霉烯酶銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制進(jìn)行更深一步的研究。

綜上所述,由于抗生素的大量使用,耐碳青霉烯酶銅綠假單胞菌引起的醫(yī)院感染變得每日俱增,這已經(jīng)成為臨床科室必須要面對(duì)的一個(gè)非常嚴(yán)重的問(wèn)題。因此,醫(yī)院應(yīng)加強(qiáng)對(duì)碳青霉烯酶耐藥銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制的檢測(cè)和監(jiān)控,合理使用抗生素。