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        離子色譜法同時(shí)測(cè)定尿液中草酸和硫氰酸鹽

        2021-02-07 07:15:26張麗黃選忠杜宏山
        化學(xué)分析計(jì)量 2021年2期

        張麗,黃選忠,杜宏山

        (湖北興山縣疾病預(yù)防控制中心,湖北興山 443711)

        人的尿液中含有大量的Cl-、HPO42-、SO42-和微量的SCN-等陰離子,其中Cl-、HPO42-、SO42-是人體正常代謝產(chǎn)物,而SCN-是有機(jī)和無機(jī)氰化物在人體內(nèi)的解毒產(chǎn)物,因此尿液中SCN-含量常作為人體接觸氰化物的一項(xiàng)生物接觸指標(biāo)[1]。SCN-可致甲狀腺腫,可阻滯甲狀腺激素合成,尤其對(duì)胎兒和嬰兒的智力以及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育存在較大的風(fēng)險(xiǎn)[2],因此監(jiān)測(cè)人血液、尿液等生物標(biāo)本中的SCN-含量具有重要意義。目前,測(cè)定尿液中微量SCN-的方法主要有分光光度法[3-5]、衍生-頂空氣相色譜法[6-7]等,其中分光光度法和氣相色譜法均存在氰化物的干擾問題。

        臨床資料顯示,約70%的尿結(jié)石為草酸鈣結(jié)石,草酸代謝異常所引起的高含量草酸尿是泌尿系結(jié)石形成的主要原因[8],因此準(zhǔn)確測(cè)定尿液中草酸含量對(duì)研究結(jié)石形成機(jī)理、結(jié)石的鑒別等均具有重要意義。目前測(cè)定尿液中草酸的方法主要是光度法,包括絡(luò)合物褪色比色法[9]和催化光度法[10-11]、催化熒光法[12-13]、高效液相色譜法[14-15]和毛細(xì)管電泳法[16]等,而比色法、光度法、熒光法等光譜分析方法特異性差,樣品需進(jìn)行前處理,操作繁雜,高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法均需要專用儀器,應(yīng)用受限。

        多組分同時(shí)測(cè)定歷來是分析工作者所追求的目標(biāo),也是離子色譜法的優(yōu)勢(shì)。離子色譜法操作簡便、試劑消耗少、可自動(dòng)化,現(xiàn)已成為陰離子分析的首選方法[17],并已應(yīng)用于尿液中草酸[17-18]和SCN-[19-20]的分別測(cè)定,但用離子色譜法同時(shí)測(cè)定尿液中草酸和SCN-尚未見報(bào)道。筆者以SH-AC-3型陰離子交換柱為分離柱,10.0 mmol/L Na2CO3溶液為淋洗液,1.0 mL/min 的流量等度洗脫,建立了抑制電導(dǎo)檢測(cè)-離子色譜法同時(shí)測(cè)定尿液中草酸和SCN-的方法。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 主要儀器與試劑

        離子色譜儀:CIC-100 型,青島盛瀚色譜公司。

        SPEIC-C18凈化柱:1 mL,青島盛瀚色譜公司。

        電子天平:萬分之一,BT214D 型,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

        電子天平:千分之一,JA2003 型,上海菁海儀器有限公司。

        離心機(jī):LG10-2.4A 型,北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

        濾膜過濾器:0.22 μm,青島盛瀚色譜公司。

        草酸(H2C2O4·2H2O)、硫氰酸鉀:優(yōu)級(jí)純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:1 000 mg/L,稱取0.140 1 g 草酸(H2C2O4·2H2O),用高純水溶解,定容至100 mL。

        SCN-標(biāo)準(zhǔn)溶液:1 000 mg/L,稱取0.167 3 g 烘干的硫氰酸鉀,用高純水溶解,定容至100 mL。

        磷酸二氫鉀:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        H2PO4-標(biāo)準(zhǔn)溶液:1 000 mg/L,稱取0.140 2 g磷酸二氫鉀,用高純水溶解,定容至100 mL。

        Cl-、SO42-標(biāo)準(zhǔn)溶液:均為1 000 mg/L ,編號(hào)分別為GBW(E) 080268、GBW(E) 080266,中國計(jì)量科學(xué)研究院。

        無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、無水亞硫酸鈉:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        試驗(yàn)用水為高純水(18.2 MΩ·cm)。

        1.2 溶液的配制

        草酸、SCN-混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:分別取適量草酸和SCN-標(biāo)準(zhǔn)溶液,用水稀釋,定容,分別制備成含草酸和SCN-均為10.0 mg/L(A液)、100.0 mg/L(B液)的兩種混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

        系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A液0.20、0.50、1.00 mL 及B 液0.50、1.00、1.50、2.00、3.00 mL 分別置于8 只10 mL 容量瓶中,加水定容至標(biāo)線,混勻,配制成含草酸和SCN-均為0.20、0.50、1.00、5.00、10.00、15.00、20.00、30.00 mg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

        亞硫酸鹽(SO32-)溶液:稱取0.5 g 無水亞硫酸鈉于砷化氫發(fā)生瓶中,加50 mL 高純水溶解,并向溶液中加入5 mL 10%硫酸溶液,迅速將導(dǎo)管插入200 mL 水中以吸收反應(yīng)產(chǎn)生的SO2氣體(可將砷化氫發(fā)生瓶置于約60 ℃水浴中),待反應(yīng)完畢后取10 mL吸收液用碘量法[21]測(cè)定SO32-的濃度,儲(chǔ)存于4 ℃冰箱備用。

        模擬尿樣:Cl-、H2PO4-、SO42-等是正常尿液中含量較多的幾種陰離子[22],根據(jù)其濃度,分別取相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液用高純水稀釋成含500 mg/L Cl-、300 mg/L H2PO4-和SO42-的模擬尿樣備用。

        1.3 儀器工作條件

        分 離 柱:SH-AC-3 型(250×4.0 mm,青 島 盛瀚色譜公司);保護(hù)柱:SH-AC-3 型(50×4.0 mm,青島盛瀚色譜公司);抑制器:自再生抑制器;檢測(cè)器:電導(dǎo)檢測(cè)器;定量環(huán)體積:25 μL;自動(dòng)進(jìn)樣器(SHA-15 型,青島盛瀚色譜公司);柱箱溫度:35 ℃;電流:75 mA;量程:1 檔;自動(dòng)進(jìn)樣器:全定量環(huán)取樣,取樣后清洗(每針之間),置換量為70 μL,取樣量為25 μL,扎針深度為4 mm。

        1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        取1.2 制備的系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液,各管取1.5 mL 于樣品瓶中,啟動(dòng)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣,分別測(cè)定,以草酸和SCN-的色譜峰面積(S)為縱坐標(biāo),以色譜峰面積對(duì)應(yīng)的各組分質(zhì)量濃度(c)為橫坐標(biāo),繪制工作曲線。

        1.5 尿樣的采集

        將聚乙烯瓶清洗干凈、用高純水浸泡后烘干備用,采集尿樣50 mL 于聚乙烯瓶中儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中,待測(cè)定。

        2.2.3 精準(zhǔn)考核確保權(quán)責(zé)到位 加強(qiáng)民政和政府部門、衛(wèi)生部門等協(xié)作,將基層居家養(yǎng)老服務(wù)項(xiàng)目作為街道或社區(qū)政府績效考核的內(nèi)容,并加強(qiáng)對(duì)農(nóng)村居家養(yǎng)老服務(wù)意識(shí)的轉(zhuǎn)變。將農(nóng)村居家養(yǎng)老服務(wù)作為政府績效考評(píng)的內(nèi)容,從對(duì)農(nóng)村居家養(yǎng)老服務(wù)購買的效率與服務(wù)提供的質(zhì)量兩方面進(jìn)行考量。除此之外,還要考評(píng)轄區(qū)內(nèi)居家養(yǎng)老服務(wù)組織數(shù)目以及服務(wù)內(nèi)容落實(shí)情況等信息。從而保證考核標(biāo)準(zhǔn)的精準(zhǔn),促進(jìn)組織的“活躍度”和可持續(xù)性發(fā)展,避免造成重硬件輕服務(wù)的“惡性競(jìng)爭(zhēng)”。

        1.6 尿樣測(cè)定

        取新鮮尿樣經(jīng)8 000 r/min 離心10 min,取上清液用高純水稀釋10 倍,然后分別用C18柱凈化和0.22 μm 濾膜過濾,取1.5 mL 濾液于樣品瓶中,啟動(dòng)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣,測(cè)定各組分的色譜峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 色譜條件的選擇

        2.1.1 淋洗液的選擇

        以SH-AC-3 型陰離子交換柱為分離柱,以Na2CO3-NaHCO3溶液為淋洗液,取模擬尿樣進(jìn)行測(cè)定,考察淋洗液對(duì)各組分的分離效果。當(dāng)Na2CO3-NaHCO3淋洗液的濃度配比在6∶1~6∶3 mmol/L時(shí),均可將草酸和硫氰酸鹽與尿液中的氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等常見陰離子完全分離,各組分相對(duì)于后續(xù)組分的分離度(R)不小于1.5,但硫氰酸鹽的保留時(shí)間(t)超過24 min,分析效率低下。為縮短硫氰酸鹽的保留時(shí)間,提高分析工作效率,以洗脫能力較強(qiáng)的Na2CO3溶液進(jìn)行了淋洗試驗(yàn),設(shè)置流量為1.0 mL/min,試驗(yàn)結(jié)果列于表1。由表1 可知,當(dāng)Na2CO3溶液濃度分別為8.0、10.0、12.0 mmol/L時(shí),草酸和硫氰酸鹽與尿液中的氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽(當(dāng)Na2CO3溶液超過8 mmol/L 時(shí)磷酸鹽和硫酸鹽合并為一個(gè)色譜峰)等陰離子均可完全分離,且硫氰酸鹽的保留時(shí)間分別縮短至21、20 和19 min 左右。考慮到Na2CO3溶液濃度增大,相應(yīng)的抑制電流也高,不利于抑制器的使用[17],為保證適宜的分離度和較短的保留時(shí)間,選擇10.0 mmol/L Na2CO3溶液為淋洗液。

        表1 Na2CO3 溶液濃度對(duì)分離結(jié)果的影響

        2.1.2 色譜柱的選擇

        以10.0 mmol/L Na2CO3溶液為淋洗液,流量為1.0 mL/min 進(jìn)行等度洗脫,取模擬尿樣進(jìn)行測(cè)定,考察了青島盛瀚色譜公司生產(chǎn)的SH-AC-1 型和SH-AC-3 型陰離子交換柱對(duì)草酸和硫氰酸鹽與氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等常見陰離子的分離情況。結(jié)果表明,在此條件下SH-AC-1 型柱雖能將草酸與常見陰離子完全分離,但硫氰酸鹽在90 min 內(nèi)尚未出峰;而SH-AC-3 型柱不但可將草酸和硫氰酸鹽與氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等常見陰離子完全分離,且硫氰酸鹽的保留時(shí)間小于21 min。故本實(shí)驗(yàn)選擇SH-AC-3 型陰離子交換柱為分離柱。

        2.1.3 淋洗液流量的選擇

        淋洗液濃度相同,流量不同時(shí),組分的分離度和保留時(shí)間會(huì)發(fā)生改變??疾?0.0 mmol/L Na2CO3為淋洗液,不同流量時(shí)草酸和硫氰酸鹽與氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等陰離子的分離效果,試驗(yàn)結(jié)果列于表2。由表2 可知,當(dāng)淋洗液流量從0.8 mL/min 增加至1.2 mL/min 時(shí),氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽、草酸和硫氰酸鹽的保留時(shí)間逐漸變短,分離度逐漸下降,但氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽、草酸的分離度遠(yuǎn)大于1.5 達(dá)到完全分離的標(biāo)準(zhǔn)。在保證待測(cè)組分與干擾離子完全分離的前提下盡量使用較低的流量,以減少系統(tǒng)壓力,因此淋洗液流量選定為1.0 mL/min。

        表2 不同Na2CO3 淋洗液流量試驗(yàn)結(jié)果

        2.1.4 柱箱溫度的確定

        考察了柱溫分別在30、35、40 ℃時(shí)各組分的分離效果,結(jié)果顯示,在所選溫度下,草酸和硫氰酸鹽均能與氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等常見陰離子完全的分離,且隨著柱溫的升高組分的保留時(shí)間稍微縮短,分離度逐漸下降,草酸的色譜峰面積隨著柱溫的升高而增長,從30 ℃上升35 ℃,增長10%左右,從35 ℃上升40 ℃,增長6%左右;硫氰酸鹽的色譜峰面積隨著柱溫的升高基本保持不變。在保證適宜的保留時(shí)間和較高的分離度的情況下,盡量采用較低的柱溫,本試驗(yàn)確定柱箱溫度為35 ℃,這也是色譜柱使用說明書推薦的使用溫度。

        2.2 線性關(guān)系與檢出限

        按照1.2 配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,測(cè)定各管的色譜峰面積,以色譜峰面積(S)為縱坐標(biāo),以各組分的質(zhì)量濃度(c)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸。

        測(cè)定儀器30 min 的基線噪聲,以3 倍基線噪聲除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(3N/b)計(jì)算草酸和硫氰酸鹽的檢出限。

        其線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(回歸曲線的截距、斜率和相關(guān)系數(shù)由儀器軟件給出)、檢出限列于表3。由表3 可知,草酸和硫氰酸鹽的質(zhì)量濃度在0.20~30.0 mg/L 范圍內(nèi)與色譜峰面積線性良好,線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999 29、0.999 49,檢出限分別為0.04、0.03 mg/L。

        其中,含10.0 mg/L 草酸和硫氰酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

        表3 草酸、SCN–線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)

        圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

        2.3 共存陰離子及抗壞血酸的影響

        由于尿液中含有大量的有機(jī)物和氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等陰離子,尿樣通過C18柱的凈化可以消除有機(jī)物的影響,尿液經(jīng)10 倍稀釋以降低氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽的影響。考察了氯化物等3 種陰離子對(duì)草酸和硫氰酸鹽測(cè)定結(jié)果的影響,結(jié)果表明,氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽的保留時(shí)間遠(yuǎn)小于草酸和硫氰酸鹽的保留時(shí)間,且500 mg/L Cl-、300 mg/L H2PO4-、SO42-(H2PO4-、SO42-完全分不開合并為一個(gè)峰)不影響50 mg/L 的草酸、3 mg/L 的硫氰酸鹽的測(cè)定,分離色譜圖見圖2。

        圖2 常見陰離子與草酸和硫氰酸鹽分離色譜圖

        尿液中可能含有抗壞血酸,在堿性條件下,抗壞血酸易發(fā)生降解反應(yīng),而草酸是抗壞血酸的降解產(chǎn)物之一,可能會(huì)影響草酸的準(zhǔn)確測(cè)定,有研究顯示在15.0 mmol/L NaHCO3溶液(pH=8.3)中40 mg/L 的抗壞血酸在80 min 內(nèi)未降解為草酸[17],本試驗(yàn)使用10.0 mmol/L Na2CO3溶液(pH≈11.1)為淋洗液,pH 值遠(yuǎn)大于8.3,樣品從進(jìn)樣到草酸出峰超過11 min,這段時(shí)間尿液中的抗壞血酸可能降解生成草酸而影響測(cè)定。觀察用純水配制30 mg/L的抗壞血酸的降解情況,結(jié)果表明本試驗(yàn)條件下30 mg/L 的抗壞血酸降解產(chǎn)生約0.3 mg/L 的草酸。試驗(yàn)采用亞硫酸鹽(SO32-)抑制抗壞血酸的降解,這與在易氧化藥物制劑中加入亞硫酸鹽以提高藥物穩(wěn)定性的方法原理相似。

        試驗(yàn)結(jié)果顯示,50 mg/L 的SO32-可抑制30 mg/L 抗壞血酸的降解,且至少在120 min 內(nèi)30 mg/L 抗壞血酸對(duì)10.0 mg/L 的草酸的色譜峰面積與峰高無明顯影響(增加值<5%)。同時(shí)50 mg/L 的SO32-對(duì)草酸和硫氰酸鹽的測(cè)定結(jié)果無明顯影響(誤差<5%)。

        2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

        取3 份1.5 mL 樣液于樣品瓶中,按1.6 步驟操作,測(cè)得草酸和硫氰酸鹽的含量。在3 份尿樣中分別添加2.0、5.0、10.0 mg/L 的草酸和硫氰酸鹽,平行測(cè)定5 次,并計(jì)算草酸和硫氰酸鹽的回收率及測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表4。由表4 可知,3 份尿液草酸和硫氰酸鹽的測(cè)定結(jié)果分別為4.71~14.83 mg/L 和0.21~0.72 mg/L,加 標(biāo)回收率分別為95.0%~101.1%和95.5%~100.5%,測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.34%~2.06%和1.56%~2.91%。尿液的加標(biāo)色譜圖見圖3。

        表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

        圖3 尿液及其加標(biāo)(尿液加5 mg/L 草酸和硫氰酸鹽)色譜圖

        3 結(jié)語

        建立了抑制電導(dǎo)檢測(cè)-離子色譜法同時(shí)測(cè)定尿液中草酸和硫氰酸鹽的分析方法。該方法具有良好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性,操作簡便快速,尿樣通過C18柱的凈化可以消除有機(jī)物的影響,尿液稀釋10倍后可降低氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽的影響。該方法以自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣,降低檢驗(yàn)人員的工作強(qiáng)度,提高了工作效率,適用尿液中草酸和硫氰酸鹽的同時(shí)測(cè)定。

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