張麗瓊，陳 迪，楊松杰，聶祥濤

（安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西 安康 725000）

煙草作為經(jīng)濟(jì)作物，一直是植物生物工程學(xué)、植物分子遺傳學(xué)的主要研究對象［1］，在遺傳學(xué)與生物工程學(xué)的各領(lǐng)域中，煙草的離體培養(yǎng)也可以為其他植物組織培養(yǎng)提供參考資料。研究者在煙草莖切斷和髓培養(yǎng)研究中，確定了嘌呤∕IAA 的比例是控制根和芽形成的條件［2］。詹紅等［3］研究了 6-BA 和 NAA不同濃度對煙草植物組織的影響，經(jīng)過試驗(yàn)證明，在MS+6-BA 0.5 mg∕L+NAA 0.5 mg∕L 培養(yǎng)基上，煙草的出芽率最高，但是在高濃度NAA 下對芽的生長有影響。何余勇等［4］以不同生長調(diào)節(jié)劑濃度配比處理云煙97 變異株，優(yōu)化該變異株培育的快繁體系，觀察結(jié)果顯示，MS+6-BA 2.0 mg∕L+NAA 0.2 mg∕L 是誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽分化的最佳培養(yǎng)基，1∕2MS+6-BA 0.1 mg∕L+IBA 0.5 mg∕L 是誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基。何川生等［1］利用K326、紅大、G-28 種子為材料，對煙草的快速繁殖進(jìn)行了研究，試驗(yàn)結(jié)果表明，MS+6-BA 0.3 mg∕L+IBA 0.05 mg∕L 是最適宜這 3 種外植體誘導(dǎo)芽分化的培養(yǎng)基。MS+6-BA 3.0 mg∕L+IBA 0.2 mg∕L 是繼代培養(yǎng)中的最適培養(yǎng)基，培養(yǎng) 1 個(gè)月左右后均有幼芽形成，繼續(xù)培養(yǎng)1 個(gè)月后可以長出根。

陜西省安康市鎮(zhèn)坪縣從2010 年開始種植烤煙，種植面積穩(wěn)定在200 hm2左右，屬于當(dāng)?shù)氐奶厣?jīng)濟(jì)作物，為增加農(nóng)民收入和財(cái)政稅收作出了一定貢獻(xiàn)。2016 年全縣共種植烤煙186.67 hm2，簽訂種植合同108 份，共收購煙葉350 t，收購總資金798.76 萬元，戶均收入7.4 萬元。2016 年9 月在鎮(zhèn)坪縣引進(jìn)種植的云煙97 中發(fā)現(xiàn)2 株超高未現(xiàn)蕾的巨型變異株，全株無病蟲害，煙葉烤后呈檸檬黃色，組織疏松、光澤鮮亮、油分充足、質(zhì)量上乘。通過與普通對照株比較，發(fā)現(xiàn)其有較大的生長優(yōu)勢，株高3.4 m，莖圍17.5 cm，葉片數(shù)129 片，平均 1～3 d 萌發(fā) 1 片新葉，而未變異云煙97 對照株株高僅115.3 cm，有效葉片20 片左右，節(jié)距 5.7 cm，莖圍 9.7 cm，每 5 d 左右萌發(fā) 1 片新葉。

煙草組織培養(yǎng)適宜培養(yǎng)基研究的較多，但不一定適宜于云煙97 變異株腋芽的組培快繁，因此有必要探索適于云煙97 變異株快繁的培養(yǎng)基。為保存這一優(yōu)良的種質(zhì)資源，本研究利用組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，以MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究不同濃度6-BA對云煙97 變異株初代培養(yǎng)組培苗繼代培養(yǎng)的影響，以期利用該變異株腋芽進(jìn)行快速繁殖，通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得大量無菌苗，培育出遺傳穩(wěn)定的云煙97變異株，研究出的快速繁殖技術(shù)可用于生產(chǎn)，為大面積推廣種植云煙97 變異株提供種苗，對鎮(zhèn)坪縣烤煙生產(chǎn)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用煙草為2016 年9 月在陜西鎮(zhèn)平縣田間發(fā)現(xiàn)的2 株超高未現(xiàn)蕾的巨型變異株云煙97 腋芽初代培養(yǎng)的組培苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將變異株云煙97 腋芽初代培養(yǎng)的組培苗切成1 cm×1 cm 左右小塊，放置在添加了不同濃度 6-BA（1.0、2.0 mg∕L）的 MS 固體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行二代培養(yǎng)，分別用A、B 來表示，以不添加6-BA的MS 固體培養(yǎng)基為對照，每瓶接種5 個(gè)外植體，每種處理30 個(gè)重復(fù)，在（25±2）℃，2 000 lx，每天14 h光照條件下培養(yǎng)。將二代培養(yǎng)中生成的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的MS 固體培養(yǎng)基內(nèi)（表1），基本培養(yǎng)基配方為：MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH 為5.8。愈傷組織切成1 cm×1 cm 左右小塊，每瓶接種4～5 個(gè)愈傷組織，每種處理30 個(gè)重復(fù)，在（25±2）℃，2 000 lx，每天14 h 光照條件下培養(yǎng)。

表1 三代培養(yǎng)基

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 記錄每組煙草愈傷組織的生長情況和芽的發(fā)生率，并用Excel軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。其中，愈傷組織形成率=形成愈傷組織數(shù)∕接種外植體數(shù)×100%，出芽率=形成芽的愈傷組織塊數(shù)∕接種愈傷組織塊數(shù)×100%，污染率=污染的外植體數(shù)∕總外植體數(shù)×100%，褐變率=褐變的外植體數(shù)∕總外植體數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 二代培養(yǎng)的結(jié)果分析

2.1.1 二代培養(yǎng)觀察結(jié)果 接種后對第5 天到第25天煙草變異株二代培養(yǎng)的變化進(jìn)行觀察，結(jié)果（表2）表明，第10 天時(shí)3 個(gè)處理中外植體均開始增大，并出現(xiàn)愈傷組織，在第15 天時(shí)處理B 首先出現(xiàn)芽，處理CK 與處理A 在第25 天時(shí)有芽的形成；培養(yǎng)到第25 天，在 CK 處理中，共有 10 瓶出現(xiàn)污染，6 瓶出現(xiàn)褐變；在A 處理中，共有3 瓶部分出現(xiàn)污染，6 瓶出現(xiàn)褐變；在B 處理中，共有4 瓶出現(xiàn)污染，4 瓶部分出現(xiàn)褐變。經(jīng)過比較3 個(gè)處理的長勢、污染、褐變情況，可以看出處理B 較為適宜作二代培養(yǎng)基。

表2 二代培養(yǎng)觀察結(jié)果

2.1.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑含量對愈傷組織形成的影響 分析不同植物生長調(diào)節(jié)劑含量對煙草變異株愈傷組織形成的影響，由表3 可知，處理CK 的褐變率與污染率均為3 個(gè)處理中最高，愈傷組織形成率最低；處理A 的污染率最低，為11.7%，處理B 次之；處理B 的褐變率最低，為13.3%，處理A 次之；處理B的愈傷組織形成率最高，為88.3%，處理A 次之。隨著6-BA 濃度的升高，煙草變異株愈傷組織形成率呈上升趨勢，通過綜合比較，處理A 與處理B 雖然在污染率與褐變率上相差較小，但處理B 形成的愈傷組織數(shù)及總體長勢更好（圖1），因此，在二代培養(yǎng)中，愈傷組織形成率隨6-BA 濃度升高呈上升趨勢，且MS+2.0 mg∕L 6-BA 培養(yǎng)基更適合誘導(dǎo)該變異株愈傷組織的形成。

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑含量對愈傷組織形成的影響

圖1 處理A 和處理B 愈傷組織的形成比較

2.2 三代培養(yǎng)的結(jié)果

2.2.1 三代培養(yǎng)觀察結(jié)果 在二代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，選擇合適的愈傷組織作為繼代培養(yǎng)的外植體，轉(zhuǎn)移到含有不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的MS 固體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行繼代培養(yǎng)，定期進(jìn)行觀察。

第5 天時(shí)，所有處理中愈傷組織均無明顯變化（表 4）；第10 天時(shí)，處理A3、A5 首先有嫩芽形成，處理A6、A7 出現(xiàn)芽點(diǎn)；第15 天時(shí)，各處理中均形成嫩芽或芽點(diǎn)，其中處理A5 的長勢最好；第25 天時(shí)，各處理中有叢生芽出現(xiàn)，處理A5 的莖增高，處理A2、A3 有根出現(xiàn)；到第 25 天，A1 處理共有 5 瓶出現(xiàn)污染，4 瓶出現(xiàn)褐變；在A2 處理中，共有4 瓶出現(xiàn)污染，3 瓶出現(xiàn)褐變；在 A3 處理中，共有 3 瓶出現(xiàn)污染，1 瓶出現(xiàn)褐變；在A4 處理中，共有5 瓶出現(xiàn)部分污染，4瓶出現(xiàn)褐變；在A5 處理中，共有2 瓶出現(xiàn)污染，無褐變；在A6 處理中，共有3 瓶出現(xiàn)污染，1 瓶出現(xiàn)部分褐變；在A7 處理中，共有2 瓶出現(xiàn)污染，2 瓶出現(xiàn)部分褐變；在A8 處理中，共有3 瓶出現(xiàn)污染，4 瓶出現(xiàn)褐變；在A9 處理中，3 瓶出現(xiàn)污染，4 瓶出現(xiàn)部分褐變；在 A10 處理中，4 瓶出現(xiàn)污染，6 瓶出現(xiàn)褐變。

2.2.2 不同生長調(diào)節(jié)劑組合對煙草變異株愈傷組織分化芽的影響 在不含NAA 的條件下（表5），隨著6-BA 濃度的升高，愈傷組織分化成芽率逐漸上升，在本試驗(yàn)條件下6-BA 濃度為2.0 mg∕L 時(shí)有利于促進(jìn)愈傷組織芽的分化，但當(dāng)6-BA 濃度升到3.0 mg∕L時(shí)，分化成芽率呈下降趨勢，經(jīng)比較，處理A3 的污染率與褐變率均低于其他3 個(gè)組合，且分化成芽率最高，由此說明，在單獨(dú)使用 6-BA 時(shí)，MS+2.0 mg∕L 6-BA 培養(yǎng)基適合用于煙草變異株愈傷組織分化。

在 NAA 濃度為 0.2 mg∕L 的條件下，6-BA 濃度為1.0 mg∕L 時(shí)愈傷組織分化成芽率最高，即處理A5，而當(dāng) 6-BA 濃度為 2.0 mg∕L 和 3.0 mg∕L 時(shí)，分化成芽率較低，說明當(dāng) NAA 濃度為 0.2 mg∕L 時(shí)，愈傷組織分化成芽率隨著6-BA 濃度的升高逐漸降低，且在6-BA濃度為 1.0 mg∕L 時(shí)最高。

在 NAA 濃度為 0.5 mg∕L 的條件下，6-BA 濃度為1.0 mg∕L 時(shí)，分化成芽率為 62.4%，6-BA 濃度為 2.0 mg∕L 時(shí)，分化成芽率為 73.6%，在 6-BA 濃度為 3.0mg∕L 時(shí)，分化成芽率為 53.9%，說明當(dāng) NAA 濃度為0.5 mg∕L 時(shí)，6-BA 濃度為 2.0 mg∕L 對芽的分化作用較好。

表4 繼代培養(yǎng)觀察結(jié)果

表5 不同生長調(diào)節(jié)劑組合對煙草變異株愈傷組織分化芽的影響

處理 A5（NAA 濃度為 0.2 mg∕L，6-BA 濃度為1.0 mg∕L）愈傷組織分化成芽率最高，為88.9%，其污染率與褐變率在所有處理中均為最低，故此培養(yǎng)基適宜進(jìn)行云煙97 變異株腋芽的繼代培養(yǎng)。

3 討論

本試驗(yàn)分別探討了不同濃度6-BA 對愈傷組織誘導(dǎo)以及加入NAA 后6-BA 濃度對芽分化的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，變異株云煙97 在二代培養(yǎng)中，在A處理與B 處理中均能形成愈傷組織，在A 處理中分化率為76.7%，B 處理中分化率為88.3%，B 處理的愈傷組織分化較高，說明在二代培養(yǎng)中最優(yōu)培養(yǎng)基配方為 MS+2.0 mg∕L 6-BA，這與陳剛［5］在對該變異株進(jìn)行組織培養(yǎng)研究中得出的MS+2.0 mg∕L 6-BA 結(jié)果一致。

在三代培養(yǎng)中，當(dāng)不使用NAA 時(shí)，隨著6-BA 濃度的升高，愈傷組織分化成芽率逐漸上升，在6-BA濃度為 2.0 mg∕L 時(shí)達(dá)到最高，但當(dāng) 6-BA 濃度升為3.0 mg∕L 時(shí)，分化成芽率呈下降趨勢。當(dāng) NAA 濃度為0.2 mg∕L 時(shí)，愈傷組織分化成芽率隨著6-BA 濃度的升高逐漸降低，且在 6-BA 濃度為 1.0 mg∕L 時(shí)最高。當(dāng) NAA 濃度為 0.5 mg∕L 時(shí)，逐漸增加 6-BA 濃度對芽分化有促進(jìn)作用，但當(dāng)6-BA 濃度達(dá)3.0 mg∕L時(shí)，對芽分化起抑制作用。

在各處理中，處理A5 愈傷組織分化成芽率達(dá)到最高，為88.9%，污染率、褐變率均較低，因此在繼代培養(yǎng)中，更適合該變異株愈傷組織分化成芽的培養(yǎng)基組合是 MS+0.2 mg∕L NAA+1.0 mg∕L 6-BA，這與陳剛［5］的研究結(jié)果一致。何余勇等［4］得出 MS+2.0 mg∕L 6-BA+0.2 mg∕L NAA 是誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽分化的最佳培養(yǎng)基，這與本研究結(jié)果不一致，原因可能是試驗(yàn)采用的材料及培養(yǎng)條件不同導(dǎo)致的。

4 小結(jié)

以云煙97 變異株腋芽為外植體，在25 ℃、2 000 lx、每天14 h 光照的條件下，二代培養(yǎng)時(shí)愈傷組織形成率隨6-BA 濃度的升高呈上升趨勢，最適培養(yǎng)基為MS+2.0 mg∕L 6-BA。三代培養(yǎng)基不使用NAA 時(shí)，隨著6-BA 濃度的升高，愈傷組織分化成芽率逐漸上升，在 6-BA 濃度為 2.0 mg∕L 時(shí)較高，但當(dāng) 6-BA 濃度升高為3.0 mg∕L 時(shí)，分化成芽率有所下降。當(dāng)NAA 濃度為 0.2 mg∕L 時(shí)，愈傷組織分化成芽率隨著6-BA 濃度的升高逐漸降低，且在6-BA 濃度為1.0 mg∕L 時(shí)最高。當(dāng) NAA 濃度為 0.5 mg∕L 時(shí)，逐漸增加6-BA 濃度對芽分化有促進(jìn)作用，但當(dāng)6-BA 濃度達(dá)3.0 mg∕L 時(shí)，對芽分化起抑制作用。通過比較愈傷組織分化成芽率，三代培養(yǎng)最適培養(yǎng)基為MS+0.2 mg∕L NAA+1.0 mg∕L 6-BA。