黃 彪，單曉菊，趙 鑫，曹永兵，周婷婷，范國榮 （. 海軍軍醫(yī)大學藥學院，上海 00433；. 科文斯醫(yī)藥研發(fā)（上海）有限公司，上海 003）

紅景天為景天科大花紅景天[Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.）H. Ohba]的干燥根和根莖[1]，是一種多年生草本或亞灌木植物。大部分生長于海拔3 500～5 000 m 的石灰?guī)r、花崗巖地冰川、山梁草地或山谷巖石上，享有“高原人參”、“雪山仙草”之美稱，被當代醫(yī)學界譽為“東方神草”，被全球醫(yī)藥界喻為“黃金植物”[2]，己被前蘇聯(lián)科學家確定為植物適應原[3]。目前的研究表明，紅景天具有抗應激、抗疲勞、抗氧化、抗癌、抗抑郁、保護肝腎、增強機體免疫力和神經(jīng)保護等作用[4-7]。

目前，國內外對紅景天多集中于其藥效研究，體內藥物含量測定和生物利用度研究又多以大鼠為研究對象。在以往研究的大鼠試驗中，不同給藥途徑和不同劑量下，紅景天苷絕對生物利用度(Fabs)結果為32.1%～98%[8-11]，范圍之大可能和紅景天苷在體內的主動轉運有關。而主要參與分子主動轉運的鈉依賴性葡萄糖轉運體介導(SGLT1)在腸黏膜中所占的比例極其有限。在有限的腸道轉運介導下，劑量不同可能會導致生物利用度研究結果不同。當口服紅景天苷劑量大于24 mg/kg時，大鼠腸道出現(xiàn)了飽和吸收過程，且證明此飽和過程與SGLT1 相關[12]。由于腸道中SGLT1 占比有限，若給藥劑量過高，可能會導致藥物腸道重吸收較差，進而體現(xiàn)為生物利用度降低。因此，為了更加科學地考察體內生物利用度，合適劑量的選擇尤為重要。

關于測定比格犬體內紅景天苷含量的分析方法研究報道較少。Mao 等[8]建立了測定犬血漿中紅景天苷含量的HPLC 法，線性范圍為0.83～520 μg/ml（r=0.992 6），最低定量下限為0.83 μg/ml。因定量限較高，不足以滿足其體內藥動學分析。陳帥等[13]應用UHPLC-MS/MS 法，采用柱前衍生化的樣品處理同時測定了比格犬血漿中的紅景天苷和酪醇含量。其中，紅景天苷的定量下限為0.02 μmol/L，質量濃度相當于6.01 ng/ml。該方法的樣品處理方式為先用乙腈蛋白沉淀法去除基質中的蛋白組分，上清溶液經(jīng)堿化后孵育進行衍生化，最后用甲基叔丁基醚進行液液萃取，氮氣吹干復溶后進樣。雖檢測限滿足體內藥動學分析，在批量處理樣品時條件苛刻且步驟復雜。且以上研究均未對紅景天苷在比格犬體內絕對生物利用度進行評估。

本實驗旨在建立準確、快速、靈敏的LC-MS/MS 法測定比格犬血漿中紅景天苷含量，并對其絕對生物利用度進行研究。血漿樣品預處理采用蛋白沉淀，并將驗證后的方法應用于臨床前藥動學研究，包括生物利用度研究，為支持臨床藥動學試驗設計提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Triple quad 5500 型三重四極桿串聯(lián)質譜儀，配備電噴霧電離源（加拿大AB Sciex 公司）；島津液相色譜系統(tǒng)(包括DGU-20A3R型脫氣機、LC-30AD 型二元液相泵、SIL-30AC 型自動進樣器和CTO-20A 型柱溫箱，日本島津公司）。Elma sonic P 300H 超聲波清洗器（德國埃爾瑪公司）；XPR6UD5和XPE205 型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)。

紅景天苷（海軍軍醫(yī)大學藥學院藥物分析教研室，含量99.0%，批號：20180901）；天麻素（內標，上海同田生物技術有限公司，含量：98.9% 批號：4031921）。甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純，Sigma-Aldrich 公司）；超純水（自制，Millipore 純水儀）。

1.2 色譜與質譜條件

1.2.1 色譜條件

Symmetry RP18色譜柱（Waters 公司，100 mm×4.6 mm, 3.5 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：0.1%甲酸溶液，流動相B：含0.1%甲酸和20%乙腈的甲醇溶液；等度洗脫比例為35%流動相B；流速0.4 ml/min，進樣量：2 μl。

1.2.2 質譜條件

離子源為電噴霧電離源；負離子方式檢測；源噴射電壓為-4500 V；去溶劑溫度為550 ℃；霧化器壓力(GS1): 75 psi；輔助氣壓力(GS2): 60 psi；氣簾氣體壓力為35 psi；入口電壓(EP): -10 V；碰撞室出口電壓(CXP): -14 V；掃描方式為多反應監(jiān)測，掃描時間為100 ms。霧化氣、氣簾氣、碰撞氣由氮氣發(fā)生器產(chǎn)生；采用多反應監(jiān)測（MRM）模式，離子監(jiān)測通道為：m/z 299.1→118.9（紅景天苷），m/z 285.1→122.9（天麻素）。紅景天苷和天麻素去簇電壓分別為-70 和-40 eV，碰撞能量分別為-19 和-17 eV。

1.3 溶液的制備

1.3.1 紅景天苷儲備液和工作溶液

分別精密稱取紅景天苷對照品2 份，用40%乙腈水溶液溶解并定容，獲得質量濃度均為0.2 mg/ml 的紅景天苷儲備液2 份，分別用于配制標準系列樣品和質控樣品工作液。按照一定的比例混合，用40%乙腈水溶液稀釋，獲得紅景天苷濃度為：0.2、0.4、2、8、32、80、180 μg/ml 的標準系列樣品工作液和濃度為0.2、0.6、10、160 μg/ml 的質控樣品工作液。于4 ℃保存，備用。

1.3.2 內標儲備液和工作溶液

精密稱取天麻素對照品一份，用40%乙腈水溶液溶解并定容，獲得質量濃度為0.1 mg/ml 的天麻素儲備液一份。以40%乙腈水溶液稀釋內標儲備液獲得4 000 ng/ml 的內標工作溶液，于4 ℃保存，備用。

1.4 標準系列樣品和質控樣品的制備

取 標 準 系 列 溶 液 或 儲 備 液50 μl 至1.5 ml EP 管中，加入比格犬空白血漿950 μl，渦旋10 s，獲得紅景天苷濃度為10、20、100、400、1 600、4 000、9 000、10 000 ng/ml 的標準系列樣品以及濃度為10、30、500 和8 000 ng/ml 質控樣品。標準系列樣品每日新鮮配制，質控樣品于-20 或-70 ℃保存，備用。

1.5 血漿樣品處理

精密吸取血漿50 μl，置于Axygen 96 孔深孔板中，加入內標50 μl，渦旋1 min，加入450 μl 甲醇，渦旋3 min，3000 r/min 離心10 min，取出上清液300 μl，氮 氣 吹 干，加 入10%乙 腈200 μl，渦 旋3 min 后，取2 μl 進行LC-MS/MS 分析。

1.6 動物實驗

動物實驗部分在上海新岡實驗動物場完成。比格犬，體重6～8 kg，雌雄各半；年齡24～30 周，給藥前禁食12 h，自由飲水，給藥后4 h 統(tǒng)一進食。

比格犬口服組（n=6，雌雄各半）給予紅景天苷原料藥15 mg/kg，分別于給藥前0.5 h 內和給藥后即刻、15、30、45 min 及1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、16、24 h 經(jīng)前肢靜脈取血1 ml 置于肝素鈉抗凝試管中，離心10 min (3 000 r/min，4 ℃)分離血漿，-70 ℃保存待測。

比格犬靜脈注射組（n=6，雌雄各半）給予紅景天苷原料藥1.5 mg/kg，分別于給藥前0.5 h 內和給藥后即刻、2、5、10、20、30、45 min 及1、1.5、2、3、4、6、8、12 h 經(jīng)前肢靜脈取血1 ml 置于肝素鈉抗凝試管中，離心10 min（3000 r/min, 4 ℃）分離血漿，-70 ℃保存待測。

1.7 數(shù)據(jù)處理

將所建立并經(jīng)過驗證的方法應用于紅景天苷動物藥動學研究。所得的血漿濃度-時間數(shù)據(jù)采用Phoenix WinNonlin 8.1 (美國Pharsight 公司)軟件，以非房室模型計算藥動學參數(shù)。絕對生物利用度（Fabs）計算方法見公式（1）：

式中：AUC0-∞ (po)為口服給藥后AUC0-∞統(tǒng)計值；AUC0-∞ (iv)為靜脈注射后AUC0-∞統(tǒng)計值；Dosepo為口服劑量；Doseiv為靜脈注射劑量。

2 結果

2.1 專屬性

分別取6 個不同來源的比格犬空白血漿樣品以及用相應比格犬空白血漿配制的定量下限（LLOQ）樣品進行LC-MS/MS 分析測定，考察不同來源空白血漿中的內源性物質是否干擾待測物及內標的測定。

結果表明，比格犬空白血漿中的內源性物質不干擾紅景天苷的測定，同時內標不干擾待測物的測定，待測物對內標也無影響。

2.2 色譜特性

在選定的條件下，紅景天苷和內標峰形良好，紅景天苷的保留時間約為1.6 min，內標的保留時間約為1.2 min，內源性雜質不干擾測定?？瞻籽獫{、紅景天苷及內標、紅景天苷及內標加入空白血漿中的色譜圖、比格犬口服1.5 h 樣品中紅景天苷及內標色譜圖見圖1。

2.3 線性范圍

取“1.4”項下制備的標準含藥血漿樣品50 μl，按照“1.5”項下血漿樣品前處理方法操作，以每個待測物濃度為橫坐標，待測物與內標物的峰面積比值為縱坐標，采用加權(W= 1/X2)最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程即為標準曲線，相關系數(shù)r 均＞0.998 6。比格犬血漿樣品中紅景天苷濃度在10～1 0000 ng/ml 與峰面積比線性良好，最低定量濃度為10 ng/ml。典型標準曲線方程為：Y =0.003 48X+0.000 397(r=0.999 1)。

2.4 定量下限

取比格犬LLOQ 血漿樣品（紅景天苷質量濃度為10 ng/ml）進行6 份樣本分析，連續(xù)測定3 d 并分別根據(jù)當日標準曲線求得每份樣本的測得濃度。求得該質量濃度紅景天苷的日內精密度分別為8.3%，日間精密度為7.3%，準確度（RE）為6.0%。實驗結果表明，LC-MS/MS 法測定比格犬血漿中紅景天苷的定量下限為10 ng/ml。

2.5 精密度與準確度

取比格犬低、中、高3 個濃度質控樣品，按照“1.5”項下操作，每個濃度進行6 樣本分析并在連續(xù)3 d 內測試，分別根據(jù)當日標準曲線計算每份樣本的測得濃度并根據(jù)QC 樣品結果計算本方法日內、日間精密度和準確度。

圖1 紅景天苷典型質量色譜圖

紅景天苷質控（QC）樣品的精密度與準確度結果見表1。待測物低、中、高質控樣品的日內和日間精密度和準確度均符合生物樣品測定相關要求。待測物低、中、高質控樣品的日內和日間精密度和準確度均符合生物樣品測定相關要求。

2.6 基質效應

分別取6 個不同來源比格犬空白血漿和一份空 白 溶 血 血 漿50 μl，不 加 內 標 溶 液（用50 μl 40%乙腈替代內標工作溶液），按照“1.5”項下操作，40 ℃氮氣下吹干，加入200 μl 由流動相配制的相對應的低、高濃度對照質控溶液和內標溶液，渦流后離心5 min，取2 μl 進行LC-MS/MS 分析，獲得相應峰面積(A)。同時，另取去離子水50 μl 代替比格犬空白血漿，按上述方法操作獲得相應峰面積(B)。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算基質效應，公式為A/B×100%，并以分析物和內標的基質效應比值計算內標歸一化的常規(guī)基質效應和溶血血漿基質效應。

表1 紅景天苷精密度和準確度試驗結果

在比格犬常規(guī)血漿樣品中，紅景天苷低、高濃度經(jīng)內標校正后的基質效應分別為96.3%和96.6%，相對標準差分別為8.4%和4.1%。溶血血漿樣品中，低、高濃度經(jīng)內標校正后的基質效應分別為99.4%和96.7%，相對標準差分別為5.0%和7.0%。

結果表明，待測物紅景天苷在本試驗選擇的色譜和質譜條件下，可忽略基質效應的影響。

2.7 提取回收率

采用比格犬空白血漿配制的低、中、高3 個濃度的血漿樣品，按照“1.5”項下操作，每個濃度進行6 樣本分析。同時另取比格犬空白血漿50 μl，不加內標溶液（用50 μl 40%乙腈溶液替代內標工作溶液），其余按照“1.5”項下操作，于40 ℃氮氣下吹干后，加入對應的低、中、高濃度對照質控溶液和內標溶液，渦流5 min，取2 μl 進行分析，獲得相應峰面積(n=3)。用提取后色譜峰面積與未經(jīng)提取的色譜峰面積之比計算提取回收率。

比格犬血漿樣品經(jīng)蛋白沉淀處理后，紅景天苷在低、中、高濃度的回收率分別為91.8%、94.3%和89.5%。

2.8 穩(wěn)定性試驗

考察了紅景天苷儲備液和工作溶液室溫6 h、比格犬血漿樣品室溫放置24 h、比格犬血漿樣品-20 ℃/-70 ℃經(jīng)歷5 次冷凍-解凍循環(huán)的穩(wěn)定性以及比格犬血漿樣品-20 ℃/-70 ℃經(jīng)歷22 d 冷凍后的穩(wěn)定性。全血樣品室溫/濕冰放置2 h、樣品處理后自動進樣器放置96 h。

結果表明，紅景天苷儲備液和工作溶液室溫至少6 h、血漿樣品中在室溫放置24 h、-20 ℃/-70 ℃凍存22 d、在-20 ℃/-70 ℃存放條件下反復室溫凍融5 次，以及樣品處理后，在自動進樣器放置96 h，紅景天苷能夠保持良好的穩(wěn)定性。自全血采集至分離待測血漿樣本的室溫/濕冰2 h 內，紅景天苷在全血中保持穩(wěn)定。

2.9 稀釋效應

本實驗考察了血漿濃度超出定量上限的比格犬血漿樣品，經(jīng)空白比格犬血漿稀釋后的準確度。取紅景天苷的稀釋質控樣品（比格犬血漿樣品紅景天苷質量濃度為80 000 ng/ml），用空白比格犬血漿稀釋20 倍后，按“1.5”項下操作，進行6 份樣本分析。結果表明，比格犬血漿樣品經(jīng)空白比格犬血漿稀釋20 倍后測定不影響結果的準確度。

2.10 紅景天苷在比格犬體內藥動學研究

比格犬單劑量口服給藥紅景天苷15 mg/kg 或靜脈注射紅景天苷1.5 mg/kg 后，按“1.6”項下采集的各時間點血漿樣品，并按照“1.5”項下操作，進行LC-MS/MS 分析，測定紅景天苷的比格犬血漿濃度?？诜o藥紅景天苷15 mg/kg 和靜脈注射紅景天苷1.5 mg/kg 后的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)曲線分別見圖2 和圖3。采用WinNonlin 軟件以非房室模型計算藥動學參數(shù)（表2、表3）。

圖2 比格犬口服給藥紅景天苷（15 mg/kg）后的血藥濃度-時間曲線(± s, n=6)

圖3 比格犬靜脈注射紅景天苷（1.5 mg/kg）后的血藥濃度-時間曲線(± s, n=6)

本試驗以比格犬單劑量靜注給藥紅景天苷1.5 mg/kg 后體內血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-∞為參比，計算比格犬單次口服給藥紅景天苷入血的絕對生物利用度?？紤]到比格犬動物實驗個體差異的特殊性，采用6 條比格犬（雌雄各半）單劑量口服給藥紅景天苷15 mg/kg 及6 條比格犬（雌雄各半）單劑量靜注給藥紅景天苷1.5 mg/kg 后，血漿AUC0-∞的平均值進行比較，得到紅景天苷在比格犬體內的絕對生物利用度為（43.9±11.2）%。

表2 比格犬口服15 mg/kg 紅景天苷后血漿藥動學參數(shù)(±s, n=6)

表2 比格犬口服15 mg/kg 紅景天苷后血漿藥動學參數(shù)(±s, n=6)

參數(shù) 雄性犬 雌性犬 平均值AUC0-t（ng·h/ml） 15 976±1 702 25 095±1 527 20 535±5 200 AUC0-∞（ng·h/ml） 16 005±1 703 25 211±1 692 20 608±5 266 MRT0-∞（t/h） 2.20±0.561 2.39±0.055 2.29±0.371 t1/2z（t/h） 1.02±0.108 1.61±0.845 1.31±0.628 CLz（L/h·kg） 0.945±0.105 0.597±0.039 0.771±0.203 Vz（L/kg） 1.39±0.232 1.35±0.613 1.37±0.415 cmax（ng/ml） 7 867±2 978 11 493±3 995 9 680±3 725 F(%) 34.2±4.9 55.2±7.4 43.9±11.2

表3 比格犬靜注1.5 mg/kg 紅景天苷后血漿藥動學參數(shù)(±s, n=6)

表3 比格犬靜注1.5 mg/kg 紅景天苷后血漿藥動學參數(shù)(±s, n=6)

參數(shù) 雄性犬 雌性犬 平均值AUC0-t（ng·h/ml） 4 735±1 050 4 557±415 4 646±721 AUC0-∞（ng·h/ml） 4 781±1 042 4 602±411 4 691±715 MRT0-∞（t/h） 1.010±0.064 1.030±0.048 1.020±0.052 t1/2z（t/h） 0.933±0.028 1.03±0.174 0.980±0.132 CLz（L/h·kg） 0.325±0.078 0.328±0.028 0.326±0.052 Vz（L/kg） 0.437±0.104 0.487±0.102 0.462±0.096 cmax（ng/ml） 9 000±1 526 9 620±2 037 9 310±1 645

3 討論與結論

目前，對紅景天苷的藥動學研究多集中在小動物種屬（大鼠、小鼠），僅有少量在比格犬上的研究，且絕對生物利用度未見文獻報道。因此，本實驗旨在建立一種快速、專屬性強、靈敏度高的LCMS/MS 分析方法，并應用于比格犬體內紅景天苷絕對生物利用度的考察。

在前期的方法考察中，血漿提取方法考察了蛋白沉淀法[沉淀試劑考察甲醇、乙腈、甲醇（含0.1%甲酸）和乙腈（含0.1%甲酸）]、液-液萃取法（萃取試劑考察乙酸乙酯、氯仿和異丙醇）。紅景天苷在常規(guī)液液萃取溶劑中回收率較差。而蛋白沉淀法中基質效應較為明顯，紅景天苷及其內標天麻素在初始色譜條件下均表現(xiàn)出較強的基質抑制現(xiàn)象。

以往的研究中，并未見藥典中針對生物分析方法驗證所要求的特殊基質（溶血、高脂血等）基質效應的考察。因高脂血研究不適用于比格犬試驗，固本次僅新增對溶血血漿中基質效應的考察。且前期發(fā)現(xiàn)在LC-MS/MS 檢測紅景天苷濃度時，溶血血漿在提取后嚴重抑制了紅景天苷的響應，使其無法準確定量。本實驗最終采用甲醇作為沉淀試劑，蛋白沉淀后吹干的方式，對提取物進行濃縮，并使用10%乙腈溶液復溶，減少了進樣過程中的溶劑效應，從而進一步改善了峰型。同時，通過對色譜柱的篩選和流動相成分的優(yōu)化，使得原始方法中血漿的內源性共流出組分和待測物及內標在不同時間出峰，很大程度上避免了干擾現(xiàn)象，并顯著改善了基質效應。

另外，結合以往對大鼠試驗中對紅景天苷生物利用度差異和劑量關系的研究，說明本試驗在合理的給藥劑量下，所呈現(xiàn)的生物利用度數(shù)值有著很高的可靠度和參考價值。在較低的給藥劑量下，所建立的LC-MS/MS 方法，定量范圍為10～10 000 ng/ml，能充分滿足本實驗研究的需要。且此方法的專屬性、準確度、精密度、基質效應、穩(wěn)定性等均符合方法學要求，方法可靠，能夠準確測定比格犬血漿中紅景天苷的濃度，評價其在比格犬體內的藥動學行為。

本研究填補了紅景天苷在比格犬體內的絕對生物利用度研究的空白，為以后臨床試驗中推測人體內暴露量，考察生物利用度提供了參考數(shù)據(jù)，同時為臨床選擇給藥途徑提供了依據(jù)。