胡等慧，王秀麗，任蕾蕾 （北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488）

超多孔水凝膠（SPF）是一種三維結構的親水性高分子聚合網(wǎng)格，在水中能夠溶脹但不溶解，且因其具有良好的生物相容及生物可降解性，被廣泛應用于醫(yī)學、藥學等領域。與傳統(tǒng)水凝膠相比，超多孔水凝膠通過致孔劑、模板等方法調整孔隙率，從而改變溶脹速率以及釋藥速率[1-3]。胰島素等生物大分子類藥物不僅體內穩(wěn)定性差、易被酶解、生物半衰期短、不易透過生理屏障，故現(xiàn)有給藥方式多以注射為主，患者依從性差[4]。有研究顯示[5]，超多孔水凝膠承載胰島素灌胃后可以顯著降低大鼠血糖：給藥2 h 后血糖顯著下降，4～6 h 降至最低，但12 h 即回至最初血糖的80%，說明該制劑起效快但持續(xù)時間短，血糖波動大，需頻繁給藥，患者依從性差。上述情況，結合胃腸道對胰島素的滅活等原因，本實驗擬合成具有緩釋作用的聚（丙烯酸-丙烯酰胺）/O-羧甲基殼聚糖[P(AA-co-AM)/O-CMC]互穿網(wǎng)絡聚合物超多孔水凝膠（SPH-IPN），以期通過皮下給藥包載胰島素的SPH-IPN 后，實現(xiàn)長效、減小血糖波動的目的。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）、N,N′-亞甲基-雙丙烯酸胺（Bis）、過硫酸銨（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆127（PF127，北京化工廠）；O-羧甲基殼聚糖（O-CMC，大連美侖生物技術有限公司）；戊二醛（GA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；姜黃素（寶雞國康生物科技有限公司）；牛胰島素（上海源葉生物有限公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、碳酸氫鈉、鹽酸、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氫氧化鈉均為分析純，實驗用水為去離子水。

1.2 儀器

85-2 型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（余姚市東方電工儀器廠）；透析袋（Viskase，美國）；Nicolet iS50 傅里葉變換紅外光譜儀（Thermo，美國）；AVANCE III 400 核磁共振譜儀（Bruker，德國）；FE28 型pH 計（Mettler Toledo，美國）；Waters UPLC：二元溶劑管理系統(tǒng)、在線脫氣機、自動進樣器、PDA 檢測器（Waters 公司，美國）；TTL-DC 型多功能氮吹儀（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）；SHA-B 雙功能恒溫水浴振蕩器（常州金壇良友儀器有限公司）。

1.3 實驗動物

雄性SD 大鼠，體重范圍（220±20）g，合格證號：SCXK（京）2017-0002，購自北京斯貝福實驗動物科技有限公司，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物房。

2 方法與結果

2.1 超多孔水凝膠（SPH-IPN）的制備[5]

依次向西林瓶中加入50% AM 和AA 溶液，以10 mol/L NaOH 調節(jié)pH 至5.0。隨后再加入2.5% Bis 溶液、10% PF 127 溶液、20%APS 溶液和50 μl 16.7% TEMED 溶液，磁力攪拌混勻。室溫放置15 min 后，逐滴加入 6% O-CMC 溶液，使溶液中O-CMC/單體比（w/w）為0.144，迅速加入NaHCO3粉末，攪拌約20 s 使其產生氣泡，將其置于40 ℃水浴加熱5 min，室溫固化30 min，即得半互穿網(wǎng)絡水凝膠（semi-IPN）。將所得semi-IPN 置于GA/OCMC 比（w/w）為2∶10 的GA 溶液（用0.2 mol/L的鹽酸溶液調節(jié)pH 至1.0）中至將其吸干，室溫放置1 h，得粗P(AA-co-AM)/O-CMC 超多孔水凝膠（SPH-IPN）。將SPH-IPN 置于0.1 mol/L 鹽酸溶液中，透析5 d，無水乙醇中脫水透析2 d，30 ℃烘干至恒重，干燥密閉保存，即得純化后的SPH-IPN。

2.2 SPH-IPN 的結構表征

將樣品充分干燥，KBr 壓片法制樣，使用傅里葉變換紅外光譜儀測定500～4 000 cm-1波數(shù)的SPHIPN 的IR 譜。將樣品置于氧化鋯樣品管（A=4 mm），轉速5 000 Hz，固體碳譜測定。

2.3 SPH-IPN 的溶脹性能測定

取干燥的SPH-IPN，室溫下浸于過量水中（pH 7.0），于不同時間點用篩網(wǎng)取出SPH-IPN，吸去表面殘余水后稱重，根據(jù)以下公式計算SPH-IPN 在不同時間點的溶脹比（QS）：

其中，WS為溶脹后SPH-IPN 質量（g）；Wd為干SPH-IPN 質量（g）。

2.4 SPH-IPN 孔隙率測定

采用乙醇替代法測定SPH-IPN 的孔隙率[6]。取干燥的SPH-IPN，置無水乙醇中浸泡12 h，取出后吸去表面殘余乙醇，稱重，根據(jù)以下公式計算孔隙率：

其中，M1為干SPH-IPN 質量（g）；M2為乙醇浸泡后的SPH-IPN 質量（g）；ρ 為乙醇密度（g/cm），V 為SPH-IPN 體積（cm3，以游標卡尺測量長方體SPH-IPN 的長、寬、高后計算而得）。

2.5 載胰島素SPH-IPN 的制備及含量測定

2.5.1 載胰島素SPH-IPN 的制備

取胰島素15 mg，精密稱定，置10 ml 量瓶中，加0.1 mol/L pH 7.4 PBS 溶解并定容至刻度，得1.5 mg/ml的胰島素溶液。稱取50 mg SPH-IPN 置裝有10 ml胰島素溶液的西林瓶中，37 ℃溫浴放置2 h，取出，置烘箱內，30 ℃恒溫干燥。

2.5.2 載藥量的測定

取胰島素SPH-IPN 適量，研磨粉碎，取20 mg，精密稱定，置10 ml 量瓶中，加入0.1 mol/L pH 7.4 PBS，定容至刻度。37 ℃溫浴2 h，超聲10 min，精密量取上清液20 μl 注入HPLC 儀，記錄色譜圖，計算胰島素含量，并根據(jù)以下公式計算載藥量：

其中，c 為測得胰島素的濃度（mg/ml），V 為量瓶體積（ml），M 為SPH-IPN 的質量（mg）。

2.6 載胰島素SPH-IPN 降血糖實驗

2.6.1 不同方法載藥SPH-IPN 的制備

按“2.5.1”項下方法制備載胰島素SPH-IPN，采用冷凍干燥法將其凍干即得含胰島素的凍干SPHIPN。稱取空白凝膠200 mg 置于1.5 mg/ml 的胰島素溶液37 ℃中溶脹2 h，備用，即得含胰島素的預溶脹SPH-IPN。

2.6.2 糖尿病大鼠模型的建立

給大鼠喂食高脂飼料（88.8%基礎飼料、1%膽固醇、10%豬油和 0.2%膽鹽[7]）喂養(yǎng)4 周，動物自由進食和飲水，每周記錄體重。于喂養(yǎng)的第28 天晚禁食，在第29 天一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，將一次性注射STZ 3 d 后大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L 或隨機血糖≥16.7 mmol/L作為成模標準[8]。對照組大鼠則腹腔注射無菌生理鹽水（0.3 ml/100 g）。注意測血糖前應禁食12 h，空腹測血糖。造模期間要防止感染，注意消毒。未造模成功的大鼠再次注射STZ35 mg/kg，3 d 后測血糖驗證是否造模成功。

2.6.3 分組、給藥及血糖測定

取糖尿病大鼠12 只，按隨機數(shù)字表分為2 組，即模型1 組和模型2 組；取正常大鼠12 只，按隨機數(shù)字表分為2 組，即正常1 組和正常2 組。模型組1 組和正常1 組皮下埋植含胰島素的預溶脹SPH-IPN，模型2 組和正常2 組皮下埋植含胰島素的凍干SPH-IPN。給藥后分別于1、2、4、6、8、10、12、24、28、32、36、48、60、72 h 不同時間間隔大鼠尾部取血0.02 ml，用血糖儀測定血糖值，考察不同時間血糖值的變化情況。

3 實驗結果

3.1 IPN 結構表征

3.1.1 傅立葉變換紅外光譜（FTIR）

圖1 為SPH-IPN 的FTIR 圖。在1 651 cm-1處有-COOH 的伸縮振動峰，且1 615 cm-1附近無AA 和AM 的C=C 雙鍵吸收峰，說明已聚合成P(AA-co-AM)，SPH-IPN 中存在P（AA-co-AM），圖中3 335 和2 922 cm-1處分別為-O-H 和-C-H 的伸縮振動峰；1 604 和1 416 cm-1處分別為羧酸鹽-COO-的反對稱伸縮振動峰和對稱伸縮振動峰；1 086、1 044 和1 171 cm-1處分別為O-CMC 中糖環(huán)羥基-CH-OH、一級羥基-CH2-OH 和醚基C-OC 中的C-O 伸縮振動峰。以上結果表明SPHIPN 中存在P(AA-co-AM)，還存在的一些雜峰可能是還有一些未反應單體未被除盡。

圖1 SPH-IPN 的傅立葉變換紅外光譜

3.1.2 核磁共振（13C-NMR）

圖2 為SPH-IPN 的13C-NMR 圖。圖中41.926×10-6為P(AA-co-AM)上主鏈碳原子的化學位移峰；179.499 處為羧基碳原子的化學位移峰，說明結構中含有羧基官能團，AA 與AM 已聚合形成P(AAco-AM)。

由于制得的水凝膠未找到合適的溶液將其溶解，因此在測定核磁共振圖譜時，采用的是固體核磁技術[9]。

綜合紅外和碳譜結果可知，通過該方法可聚合形成P(AA-co-AM)結構，而該結構又是超多孔水凝膠SPH-IPN 的主要結構，由此可說明已成功聚合SPH-IPN。

圖2 SPH-IPN 的核磁共振碳譜

3.2 SPH-IPN 的溶脹性能

圖3 為不同溫度介質中SPH-IPN 的溶脹曲線，可見隨著溫度升高，SPH-IPN 的溶脹速率加快，平衡溶脹比增大，原因是溫度較高時相互纏繞的聚合物鏈松開，破壞分子間的氫鍵，增加鏈運動，水分子在凝膠骨架內外的擴散速率加快，從而促進了聚合物的溶脹[10]。

圖3 不同溫度下SPH-IPN 的溶脹性

3.3 SPH-IPN 孔隙率的測定

表1 為SPH-IPN 孔隙率測定結果，所制SPHIPN 超多孔水凝膠空隙分布均勻。除此之外，與傳統(tǒng)水凝膠相比[11]，孔隙率高，更利于藥物的釋放。

表1 SPH-IPN 的孔隙率測定結果

3.4 SPH-IPN 載胰島素含量測定結果

37 ℃時SPH-IPN 溶脹比較大，溫度過高易引起胰島素變性，故選擇37 ℃溫度載藥，胰島素的載藥量試驗結果見表2。

表2 SPH-IPN 對胰島素的載藥量

3.5 載胰島素凝膠降血糖實驗

圖4 是含胰島素的預溶脹SPH-IPN 和凍干SPH-IPN 對糖尿病大鼠和正常大鼠降糖作用的比較。圖中預溶脹模型組在10 h 時血糖值才有所降低，最低值為10 h 的16.8 mmol/L，之后血糖又開始慢慢升高；預溶脹正常大鼠組在給藥4 h 后血糖開始降低，到24 h 時血糖達到7.3 mmol/L，之后維持平穩(wěn)狀態(tài)；凍干模型組在包埋1 h 后血糖便開始下降，血糖值降到6.7 mmol/L，在24 h 后血糖開始慢慢升高，凍干正常大鼠組在1 h 后血糖降至5.3 mmol/L，之后雖有起伏，但也一直在正常范圍內。說明凍干凝膠的降糖作用較預溶脹組好，凍干凝膠在1～24 h時間段內的降糖作用較平穩(wěn)。

圖4 載胰島素SPH-IPN 的降糖作用

4 討論

4.1 SPH-IPN 的制備

本實驗選用了能夠迅速聚合的水溶性原料AA、AM 為聚合反應單體；以APS/TEMED 為引發(fā)體系；PF127 為泡沫穩(wěn)定劑，使產生的泡沫穩(wěn)定時間更長；NaHCO3為起泡劑；O-CMC 在合成過程中作為增稠劑，維持合適的起泡速率，使產生的氣泡均勻、穩(wěn)定，不致產生的氣泡過快逸散[12]。采用溶液聚合法制備了含semi-IPN 的水凝膠。因為該聚合反應在反應過程中會產生大量熱量，這對泡沫的穩(wěn)定極為有利，因此在常溫條件下便能進行聚合反應，條件溫和。以pH 1.0 的GA 溶液交聯(lián)O-CMC時，可避免過度溶脹對孔隙結構的破壞，且pH 1.0時GA 的交聯(lián)能力較好。除此之外，相較于參考文獻[5]，本實驗中O-CMC/單體比較高，當O-CMC/單體比為0.144 時，雖然可形成具有大量相互貫通孔隙的聚合物，但會導致其溶脹速率減慢，溶脹比降低，從而影響載藥量和釋藥速率。隨著溶脹速率減慢，藥物溶出速率也相應減慢；隨著溶脹比的降低，吸收的藥物溶液減少，載藥量隨之降低。本實驗提高O-CMC/單體的目的是希望通過減慢SPHIPN 的溶脹速率，從而嘗試制備緩釋制劑。

4.2 水凝膠的載藥方法

水凝膠的載藥方法通常有2 種：一是將藥物與單體溶液混合，隨著單體聚合、交聯(lián)將藥物包埋于水凝膠中[13]；另一種方法為吸附載藥，即凝膠在被載藥液中溶脹，將載藥水凝膠干燥，實現(xiàn)藥物包埋[14]。姜黃素屬于脂溶性藥物，課題組前期研究結果表明，0.5%的SDS 對姜黃素有一定的增溶效果；0.1 mol/L pH 7.4 PBS 中SPH-IPN 的溶脹比較大，對胰島素具有一定的增溶作用，故分別選用這兩種溶劑配制胰島素溶液。

4.3 超多孔水凝膠的釋藥性能

文獻[5]表明，超多孔水凝膠載藥后的釋藥性能與O-CMC 的含量、pH、離子強度、溫度等多個因素有關，同時也有可能與載藥SPH-IPN 的制備過程有關。

筆者曾用SPH-IPN 包載姜黃素，并開展探索性實驗。結果發(fā)現(xiàn)20、40、60 目不同粒徑的凝膠累積釋放率不同，前13 h 三者的累積釋放率均幾乎一樣（接近0），13 h 后累積釋放率逐漸增加，以40 目凝膠的效果最佳，48 h 后達到6.00%，明顯高于其他組，但其釋放速度慢，見圖5。灌胃給予載姜黃素SPH-IPN 后，部分大鼠排泄物中可見載姜黃素SPH-IPN，說明SPH-IPN 在體內溶脹速率很慢；而載姜黃素SPH-IPN 組和姜黃素原藥組，灌胃后大鼠眼眶血中均未檢出姜黃素，也進一步體現(xiàn)SPH-IPN 未促進姜黃素的吸收。

圖5 不同粒徑載姜黃素SPH-IPN 的釋藥情況

將載胰島素SPH-IPN 予灌胃給藥溶脹很慢，降糖效果極不明顯，為延長SPH-IPN 溶脹時間，最終考慮將其進行皮下包埋給藥。

載胰島素SPH-IPN 皮下包埋給藥發(fā)現(xiàn)，載胰島素凍干SPH-IPN 組的降糖效果優(yōu)于載胰島素溶脹SPH-IPN 組，表明載藥SPH-IPN 的釋放性能除與溶脹比有關外，其制備過程也會一定程度影響被載藥物的療效，與文獻[5]報道一致。實驗中將凍干組和溶脹組均進行包埋，均可延長溶脹時間，但凍干SPH-IPN 組的降糖效果優(yōu)，皮下包埋2 h 后表現(xiàn)出明顯的降糖作用，相比溶脹組而言，起效時間快（8 h 左右）且持續(xù)時間長，24 h 之內均具有良好的降糖作用。提示我們在制備載藥SPH-IPN 的過程中應該時刻關注被載藥物的活性及穩(wěn)定性，應在適當?shù)臈l件下對藥物進行包載以提高藥物療效，同時也說明載胰島素凍干SPH-IPN 可作為控釋制劑，實現(xiàn)調節(jié)大鼠血糖的目的。結合實驗結果分析可知，SPH-IPN 能夠增強藥物的穩(wěn)定性，提高生物利用度，比較適合作為蛋白質藥物給藥載體。

4.4 SPH-IPN 載胰島素的微針給藥展望

文獻研究發(fā)現(xiàn)，胰島素經(jīng)皮給藥具有不錯的療效，與皮下給藥效果幾無差異，且依從性好，成為最新、有效、方便的給藥方式。Norduist 等[15]將微針貼劑用于胰島素給藥，結果發(fā)現(xiàn)，血漿胰島素濃度變化與傳統(tǒng)的皮下注射并無太大差異，但微針貼劑能極大地提高實驗大鼠的依從性。無痛中空微針皮內胰島素給藥系統(tǒng)已獲得 FDA 批準，進入II 期臨床，相關產品有以色列納米通道技術公司采用MEMS 技術開發(fā)的中空微針器具，其中包括用于無痛釋放胰島素薄片與胰島素微型泵相結合。Liu 等[16]將可溶性材料透明質酸制備成負載胰島素的微針陣列。在體實驗發(fā)現(xiàn)，負載胰島素的微針能夠在1 h 內完全溶解，攜帶的胰島素快速釋放入體內。

與上述研究及應用相比，本實驗的載胰島素SPH-IPN，釋放藥物無需微型泵，皮下包埋給藥可以24 h 內保持平穩(wěn)、正常的血糖濃度，適合作為一日一次給藥的控釋制劑。為了提高患者的依從性，進一步研究將載胰島素SPH-IPN 制備為微針陣列的形式，以期得到一種方便、快捷、安全的胰島素緩釋遞藥系統(tǒng)。