俞 俊，段晶晶，張 曄 （上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上海 201499）

非 小 細(xì) 胞 肺 癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌中最常見的組織學(xué)類型，發(fā)病率逐年增高，無論是在我國還是全球，都已成為致死率最高的癌癥之一[1]。因此，對于NSCLC 的防治，特別是探索新的化學(xué)預(yù)防策略顯得尤為重要。目前新興出現(xiàn)的以靶向和免疫療法為手段治療NSCLC越來越引人關(guān)注，盡管如此，對于肺癌的治療同樣也面臨著研發(fā)新型抗癌藥物的挑戰(zhàn)，包括研發(fā)過程中所需巨額費用和時間，而重新使用具有潛在癌癥治療的非抗癌藥物用于癌癥治療，不僅可以節(jié)省研發(fā)新藥所需的人、財、物力，甚至還可能提高治療效果。臨床前研究和數(shù)據(jù)證實許多非抗癌藥物具有潛在的預(yù)防和治療癌癥的作用，譬如對NSCLC的預(yù)防和治療，這些藥物就有阿司匹林、他汀類藥物等[2]。

阿司匹林和阿托伐他汀是廣泛用于心血管疾病的一線防治用藥。近年來，它們已經(jīng)被證實可能成為新興的、可用于不同類型腫瘤（包括NSCLC）的化學(xué)預(yù)防藥物[3-5]。盡管它們抗NSCLC 的確切分子機制尚需要進一步研究，但文獻報道其抗腫瘤作用機制存在重疊，即均可靶向作用于mTOR 和NFκB 通路。據(jù)此我們假設(shè)：阿司匹林和阿托伐他汀聯(lián)合使用可通過共同抑制mTOR 和NFκB 通路而發(fā)揮協(xié)同抗NSCLC 效應(yīng)。為驗證假設(shè)，本實驗選取了非小細(xì)胞肺癌A549 和NCI-H460 細(xì)胞，在體外研究阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀對它們細(xì)胞增殖的影響及其相關(guān)作用機制，期望在應(yīng)用阿司匹林和阿托伐他汀防治心血管疾病的同時可以降低NSCLC 的患病風(fēng)險，以及為設(shè)計新型控制NSCLC的干預(yù)策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細(xì)胞肺癌A549 和NCI-H460 細(xì)胞（美國Manassas 公司），培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（美國Sigma-Aldrich 公司），置37 ℃飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱孵育。阿司匹林和阿托伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品化合物（美國Sigma-Aldrich 公司），用DMSO 溶解后-20 ℃保存。RNA 提取試劑盒購自上海博彩生物科技公司，BCA 法蛋白定量試劑盒和TNF-α 和IL-1β 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo scientific 公司，SYBR qPCR 試劑盒購自美國Invitrogen 公司。mTOR、p-mTOR、NFκB、p-NFκB、Bcl-2、Mcl-1、β-Actin 抗體以及鼠、兔二抗購自美國CellSignal 公司。其他試劑以及儀器設(shè)備由本實驗室提供。

1.2 MTS 法檢測細(xì)胞增殖活性

分別取對數(shù)生長期非小細(xì)胞肺癌A549 和NCIH460 細(xì)胞，用胰酶-EDTA 消化并計數(shù)，將100 μl的細(xì)胞混懸液接種于96 孔培養(yǎng)板使每孔的細(xì)胞數(shù)約為5×103個/100 μl。待24 h 后細(xì)胞貼壁，加入阿司匹林或/和阿托伐他汀（先用DMSO 溶解再用DMEM培養(yǎng)液稀釋成不同濃度）。使與細(xì)胞作用的阿司匹林濃度分別為0、5、50、100、150、200 μmol/L，阿托伐他汀濃度分別為0、1、2、5、10、20 μmol/L。每個濃度設(shè)3 個復(fù)孔，對照組加入DMEM 培養(yǎng)液。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱72 h 后，加入10 μl MTS 溶液（臨用前用PBS 溶解，pH7.4,質(zhì)量濃度為5 g/L），再置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h，于酶標(biāo)儀490 nm處檢測吸光度值（A 值）。

細(xì)胞增殖存活率（%）=（實驗孔A 值/對照孔A 值）×100。

1.3 細(xì)胞劃痕實驗

分別將A549 和NCI-H460 細(xì)胞懸液接種于兩個6 孔培養(yǎng)板中，保證每孔細(xì)胞數(shù)約為1×105個/孔，次日待細(xì)胞貼壁鋪滿后進行劃痕，PBS 清洗一遍后更換無血清培養(yǎng)液。根據(jù)MTS 實驗結(jié)果選取了濃度為100 μmol/L 阿司匹林、5 μmol/L 阿托伐他汀以及二者聯(lián)合作為處理藥物，共設(shè)3 個給藥組和1 個對照組進行實驗，24 h 后觀察劃痕距離變化并在顯微鏡下拍照，與給藥前進行比較。

1.4 Western blotting 檢測蛋白表達

以1×105個/孔接種NCI-H460 細(xì)胞于6 孔板中，同樣設(shè)置有濃度為100 μmol/L 阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者聯(lián)合的3 個藥物處理組和1 個對照組，并給予對應(yīng)濃度的藥物處理細(xì)胞，對照組不作處理。繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后收集細(xì)胞，PBS 洗細(xì)胞3 次，加入細(xì)胞裂解液（含20 mmol/L Tris-Hcl/pH 7.5、1% Triton、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、2.5 mmol/L 無水焦硫酸鈉、1 mmol/L β-甘油磷酸鹽、1 μg/ml 亮肽素和1 mmol/LPMSF），用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，4 ℃冰浴中超聲破碎細(xì)胞，待細(xì)胞膜破碎反復(fù)渦旋后，于4 ℃、12 000 r/min 離心，取上清，BCA 法蛋白定量后樣品經(jīng)SDS-PAGE 分離，蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，將PVDF 膜在5%牛奶中封閉1 h，加入1∶1 000 的一抗，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌，加入酶標(biāo)二抗室溫1 h，PVDF 膜經(jīng)ECL 化學(xué)發(fā)光底物檢測蛋白。

1.5 實時定量PCR 分析（qRT-PCR）實驗

以1×105個/孔接種NCI-H460 細(xì)胞于6 孔板中，設(shè)置有濃度為100 μmol/L 阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者聯(lián)合的3 個藥物處理組和1 個對照組。次日待細(xì)胞貼壁換培養(yǎng)液給予對應(yīng)濃度的藥物處理細(xì)胞，對照組不作處理，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞。采用RNA 提取試劑盒（上海博彩）提取細(xì)胞總RNA，按照TNF-α 和IL-1β 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（美國Thermo scientific 公司）操作進行反轉(zhuǎn)錄。得到的cDNA 按照SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒說明書進行實時定量PCR 檢測。每個PCR 反應(yīng)體系包括：SYBR Green PCR Master Mix 10 μl、cDNA 模板2 μl、10 μmol/L 上下引物（表1）各0.4 μl 以及7.2 μl 去離子水，總反應(yīng)體積為20 μl，經(jīng)7300 qRT-PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems）檢測，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95 ℃ 5 s、60 ℃ 35 s 共40 個循環(huán)?；虻谋磉_用ΔΔCt 法計算，以β-actin 作為內(nèi)參。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.6 統(tǒng)計處理

使用SPSS 16.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用t 檢驗進行兩組間差異比較，P＜0.05 為顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯(lián)合對A549和NCI-H460 細(xì)胞增殖的影響

我們選取了濃度分別為0、5、50、100、150、200 μmol/L 的阿司匹林和0、1、2、5、10、20 μmol/L的阿托伐他汀處理A549 和NCI-H460 細(xì)胞，72 h后采用MTS 法測定兩種細(xì)胞的增殖活性，以濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)繪制曲線（圖1）。結(jié)果顯示：阿司匹林和阿托伐他汀單用（濃度分別≥100 和5 μmol/L）或二者聯(lián)用均能明顯抑制A549 和NCI-H460 細(xì)胞增殖，且二者聯(lián)用抑制作用大于單用。例如，100 μmol/L 阿司匹林和5 μmol/L 阿托伐他汀，以及二者聯(lián)用處理A549 細(xì)胞，72 h 后存活率（與對照孔比較）分別為(69.64±5.95)%、(59.31±5.66)%和(39.51±13.22)%，聯(lián)合與單用比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同樣相同濃度的阿司匹林和阿托伐他汀以及二者聯(lián)用處理NCI-H460 細(xì)胞，72 h 后與存活率（與對照孔比較）分別為(76.73±11.30)%、(59.13±6.61)%和(36.82±8.15)%，且聯(lián)合與單用比較，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯(lián)合對A549 和NCIH460 細(xì)胞增殖的影響

2.2 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯(lián)合對A549和NCI-H460 細(xì)胞遷移與侵襲的影響

根據(jù)MTS 實驗結(jié)果，選取了濃度為100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L 阿托伐他汀以及二者聯(lián)合作為處理藥物，共設(shè)3 個給藥組和1 個對照組進行實驗，24 h 后觀察劃痕距離變化并在顯微鏡下拍照（圖2）。結(jié)果顯示：與給藥前比較，阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯(lián)合均較明顯抑制了兩種細(xì)胞的遷移與侵襲，且二者聯(lián)合的抑制作用顯著增強。

圖2 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯(lián)合對A549 和NCIH460 細(xì)胞遷移與侵襲的影響

2.3 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯(lián)合對NCIH460 細(xì)胞信號調(diào)控因子相關(guān)蛋白表達的影響

選取濃度為100 μmol/L 阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者聯(lián)合作為處理藥物，共設(shè)3 個給藥組和1 個對照組處理NCI-H460 細(xì)胞，72 h 后收集細(xì)胞。細(xì)胞裂解提取蛋白并采用BCA 法測定總蛋白，采用Western blotting 法檢測相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果如圖3。

結(jié)果顯示：100 μmol/L 阿司匹林、5 μmol/L 阿托伐他汀以及二者聯(lián)合均可以抑制p-NFκB、pmTOR 以及抗凋亡因子Mcl-1 和Bcl-2 的蛋白表達，且與單藥相比，二者聯(lián)合抑制效應(yīng)增強，表明阿司匹林和阿托伐他汀聯(lián)合可以產(chǎn)生協(xié)同抑制作用。但與對照組比較，給藥組對總NFκB 和總mTOR 的蛋白表達均無明顯影響。

圖3 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯(lián)合對NCI-H460 細(xì)胞信號調(diào)控因子蛋白表達的影響

2.4 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯(lián)合對NCIH460 細(xì)胞TNF-α 和IL-1β mRNA 表達的影響

同 樣，選 取 濃 度 為100 μmol/L 阿 司 匹 林、5 μmol/L 阿托伐他汀以及二者聯(lián)合作為處理藥物，共設(shè)3 個給藥組和1 個對照組處理NCI-H460 細(xì)胞，72 h 后收集細(xì)胞。提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說明書操作對TNF-α 和IL-1β 進行實時定量PCR 檢測，結(jié)果如圖4。

圖4 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者聯(lián)合對NCI-H460 細(xì)胞TNF-α 和IL-1β mRNA 表達的影響

結(jié)果顯示：與對照組比較，阿司匹林組、阿托伐他汀組以及二者聯(lián)合處理組NCI-H460 細(xì)胞中TNF-α 表達量分別是對照組的（1.13±0.25）、（0.89±0.06）和（0.79±0.23）倍，IL-1β 表達量分別是對照組的（0.94±0.20）、（0.81±0.36）和（0.52±0.24）倍。其中，阿托伐他汀組TNF-α 和聯(lián)合處理組IL-1β 的表達，與對照組比較差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），尤其是聯(lián)合處理組IL-1β 的表達差異最為明顯，與對照組比較下降了近50%。

3 討論

流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，服用阿司匹林或者阿托伐他汀的人群出現(xiàn)了肺癌患病率降低或者腫瘤發(fā)生發(fā)展的延緩。譬如，Van Dyke 等[6]發(fā)現(xiàn)成人加強劑量的阿司匹林可以降低55～64 歲婦女罹患NSCLC 的概率；Jiang 等[7]報道，標(biāo)準(zhǔn)劑量阿司匹林（＞325 mg）服用5 年以上降低了肺癌事件的發(fā)生。Lin 等[8]在采用傾向評分法對5 118 名65 歲以上的Ⅳ期NSCLC 患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)，服用了阿托伐他汀平均生存時間提高了3 個月，并且得出結(jié)論阿托伐他汀提高了Ⅳ期NSCLC 患者的存活率。這些報道均提示阿司匹林和阿托伐他汀對肺癌具有直接的抑制效應(yīng)，然而兩藥聯(lián)合使用時是否可以表現(xiàn)出協(xié)同抗癌活性，目前報道較少，He 等[9]研究顯示阿司匹林和阿托伐他汀對前列腺癌細(xì)胞的增殖有聯(lián)合抑制作用，但對肺癌細(xì)胞的作用未見報道。據(jù)此，我們選取了非小細(xì)胞肺癌A549 和NCI-H460 細(xì)胞，在體外研究阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀對它們的抑制效應(yīng)及其相關(guān)作用機制。

首先，我們采用MTS 法檢測了阿司匹林和阿托伐他汀單用及聯(lián)合對A549 和NCI-H460 細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示（圖1）：當(dāng)阿司匹林和阿托伐他汀的濃度分別大于100 和5 μmol/L 時均能明顯抑制A549 和NCI-H460 細(xì)胞增殖，且二者聯(lián)用抑制作用明顯大于各自單用。他汀類藥物在體內(nèi)外可以抑制癌細(xì)胞（包括NSCLC）的增殖已有文獻報道[10-12]，該結(jié)果與之相符。但阿司匹林在體外抑制NSCLC 細(xì)胞的增殖，以及聯(lián)合阿托伐他汀發(fā)揮協(xié)同抑制作用，文獻未見報道。所以，本實驗結(jié)果提示阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀可以發(fā)揮協(xié)同抑制NSCLC 細(xì)胞增殖效應(yīng)。其次，我們在細(xì)胞劃痕實驗中觀察到100 μmol/L 阿司匹林和5 μmol/L 阿托伐他汀均能抑制A549 和NCI-H460 細(xì)胞的遷移與侵襲，且二者聯(lián)合抑制作用顯著增強（圖2），該結(jié)果也進一步說明阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀發(fā)揮協(xié)同抑制NSCLC 細(xì)胞效應(yīng)。

阿司匹林和他汀類藥物在臨床上廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療心血管疾病，但近年來由于其抗炎作用、抗腫瘤活性的研究發(fā)現(xiàn)，且其分子機制研究已經(jīng)比較成熟，已經(jīng)無可爭議的成為癌癥預(yù)防的候選藥物。通過文獻綜述我們發(fā)現(xiàn)，阿司匹林和他汀類藥物發(fā)揮抗腫瘤的分子機制有重疊，即均可以直接或間接作用于mTOR 和NFκB 信號靶點[4,13]，影響它們通路下游一些基因和蛋白的表達，進而發(fā)揮抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抗血管生成以及轉(zhuǎn)移等一系列抗腫瘤活性。本研究我們在NCI-H460 細(xì)胞中驗證了阿司匹林和阿托伐他汀靶向作用于mTOR 和NFκB 信號靶點，抑制它們的磷酸化過程（即抑制活化），且能夠抑制它們信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游抗凋亡基因Mcl-1 和Bcl-2 的蛋白表達。同時還發(fā)現(xiàn)當(dāng)阿司匹林和阿托伐他汀聯(lián)合應(yīng)用時，對這些信號通路中這些蛋白的表達下調(diào)作用更加明顯，提示二者聯(lián)合發(fā)揮了協(xié)同作用（圖3）。另外，文獻報道他汀類藥物可以通過作用炎癥調(diào)控因子NFκB 影響細(xì)胞內(nèi)一些重要炎癥因子（如TNF-α、IL-8 等）的生成[14-15]，同樣，我們在研究中也發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀降低了NCI-H460 細(xì)胞中炎癥因子TNF-α 的mRNA表達，對IL-1β 的mRNA 表達也有抑制作用但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（與對照組比較P＞0.05，圖4），阿司匹林未發(fā)現(xiàn)有相同的作用，但二者聯(lián)合顯著降低了IL-1β 的mRNA 水平，與對照組比較下降近50%。此結(jié)果提示阿司匹林和阿托伐他汀聯(lián)合應(yīng)用可能對某些促炎因子（如IL-1β）的影響有協(xié)同作用。

綜上所述，阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀可以協(xié)同抑制非小細(xì)胞肺癌A549 和NCI-H460 細(xì)胞的增殖，其機制為共同作用于mTOR 和NFκB 信號靶點并且影響該靶點信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游調(diào)控基因的表達，如抗凋亡基因Mcl-1、Bcl-2 以及炎癥因子TNF-α 和IL-1β（圖5），但這種協(xié)同作用是如何通過作用mTOR 和NFκB 并調(diào)控其下游目的基因來實現(xiàn)的，以及是否還通過作用于新的信號靶點或者其他信號通路（圖5 路線③）發(fā)揮協(xié)同抑制作用有待于進一步研究求證。

圖5 阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀抑制NSCLC 分子機制