張磊,劉杰,張英,王芳,李長雷,劉驥才,劉小亞,付艾妮,游俊,朱書秀

(1.江漢大學醫(yī)學院,武漢 430056;2.湖北省婦幼保健院,武漢 430070)

正常子宮內膜僅在一個極短的時期內允許胚胎著床,即“種植窗期”,一般在排卵后6～9 d開放,持續(xù)1～2 d[1]。在體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)治療不孕癥時,控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH)可獲取多個卵泡,同時也出現了高雌激素和高孕激素現象[2],導致子宮內膜提早發(fā)育成熟,卵子與子宮內膜發(fā)育不同步,出現妊娠率低下。子宮內膜同源盒基因 A10(HOXA10)對子宮內膜的發(fā)育進行著精密的時空調節(jié)[3],在細胞增殖和胚胎著床方面起著重要作用。針灸治療不孕癥歷史悠久,大量臨床報道也證實了針灸治療對不孕癥有理想療效[4-5]。近年來,國內外開展了大量研究,綜合其作用機制為調節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸的功能[6],改善卵巢血供及促進卵子的成熟、排出[7-8],改善子宮內膜容受性[9-10],調節(jié)血清雌孕激素水平[11]。本研究通過觀察不同妊娠天數小鼠子宮內膜的HOXA10、整合素avβ3及白血病抑制因子(LIF)蛋白及 mRNA的表達變化,來探討電針提高IVF-ET臨床妊娠率的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

昆明純種性成熟小鼠,SPF級,8周齡,體質量30～35 g,其中雌鼠150只,雄鼠80只(用于交配),由武漢春玉紅實驗動物飼料有限公司提供(動物合格證號42000600023408)。將小鼠置于室溫18℃～22℃、相對濕度60%～80%的環(huán)境中,自由攝食、飲水。取50只雌鼠為自然周期組,剩余100只雌鼠制備COH模型并隨機分為COH組(50只)和電針組(50只)。各組內再根據妊娠天數分為 D2、D3、D4、D5和 D6小組,每小組10只。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》的規(guī)定[12]。

1.2 主要試劑與儀器

曲普瑞林(法國益普生生物制藥有限公司);孕馬血清促性腺激素(寧波三生藥業(yè)有限公司);絨促性素(HCG,麗珠集團麗珠制藥廠);Trizol(美國 Ambion公司);cDNA第一鏈合成試劑盒(立陶宛 Fermentas公司);HOXA10抗體(美國GeneTex公司);整合素αvβ3抗體(美國 Abcam公司);LIF抗體(中國臺灣 Origo公司);Western-blot主要試劑購自碧云天公司。PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司,EDC-810);熒光定量PCR儀(美國ABI公司,QuantStudio 6);酶標儀(美國Thermo公司,mμlISKANMK3);水平電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司,JY300);韓氏電針儀(HANS-100A,南京濟生醫(yī)療科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備方法

采用控制性超促排長方案制備COH小鼠模型[13]。每天上午腹腔內注射曲普瑞林(每 100 g體質量注射0.4 μg),連續(xù)9 d;第9天同時注射孕馬血清促性腺激素(每100 g體質量注射40 U)1次,進行Gn啟動;48 h后注射人絨毛膜促性腺激素(HCG,每100 g體質量注射100 U),與雄鼠合籠。

1.3.2 電針干預

取關元、中極和三陰交(雙),采用0.16 mm×7 mm美容針灸針,進針深度2 mm,關元和中極分別接韓氏電針儀兩極。連續(xù)波,頻率2 Hz,強度1 mA,留針15 min。于HCG注射日開始治療,至取材日停止。僅電針組行電針干預,自然周期組和COH組小鼠不行電針治療。

1.3.3 胚胎著床的觀察與計數

取各組 D6小組,尾靜脈注射 0.3 mL 0.5%臺盼藍,5 min后頸椎脫臼處死。用75%乙醇消毒腹部皮膚,打開腹腔,暴露雙側子宮,被臺盼藍染為藍色即為小鼠胚胎的著床位點。計算小鼠妊娠率和平均著床位點數。妊娠率=(孕鼠數/總動物數)×100%。平均著床位點數=(總著床位點數/妊娠鼠數)×100%。

1.3.4 子宮內膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表達

取各組D2、D3、D4、D5小組小鼠子宮內膜組織,用Western blot技術檢測子宮內膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF的蛋白表達。電動勻漿器勻漿,采用細胞裂解液提取總蛋白,經 SDS-PAGE電泳分離蛋白,濕轉法將目的蛋白轉到PVDF膜上,一抗、二抗依次孵育。通過凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。運用Image-J圖像分析軟件分析,采用目的蛋白與內參的比值比較各組蛋白表達水平。

1.3.5 子宮內膜 HOXA10、整合素αvβ3和 LIF mRNA的表達

取各組D2、D3、D4、D5小組的小鼠子宮,縱行剖開子宮,剝離子宮內膜,剔除囊胚,用RT-PCR技術檢測子宮內膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF mRNA的表達。采用Trizol提取組織內的RNA,并根據反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄,反應條件為25℃下5 min、50℃下15 min、85℃下5 min和4℃下10 min。獲得第一鏈cDNA后,以GAPDH為內參,實時定量PCR擴增反應檢測HOXA10、整合素αvβ3、LIF的mRNA表達量變化,引物序列見表1。反應條件為50℃下2 min、95℃下10 min、95℃下30 s和60℃下30 s,40個循環(huán)。熒光定量分析軟件自動繪制擴增動力曲線和溶解曲線?；蛳鄬Ρ磉_量采用2﹣△△CT的方法進行分析。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數據采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數資料比較采用卡方檢驗。符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差表示,組內各小組之間比較采用單因素方差分析,進一步通過Tukey和SNK檢測的方法分析兩組之間的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠妊娠率及著床位點數

經控制性超排卵后,COH組妊娠率低于自然周期組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),且平均著床位點數顯著高于自然周期組(P＜0.01)。電針治療后,電針組妊娠率與COH組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),但呈現增長趨勢;平均著床位點數比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠妊娠率及著床位點數

2.2 子宮內膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表達

自然周期組中,D4小組 HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表達最高,與D2、D3、D5小組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),結果見圖1。COH組中,D3小組表達最強,與D2、D4、D5小組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,P＜0.01),結果見圖2。電針組中,D4小組達到峰值,與D2、D3、D5小組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,P＜0.01),結果見圖3。

圖1 自然周期組小鼠子宮內膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表達

圖2 COH組小鼠子宮內膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表達

圖3 電針組小鼠子宮內膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表達

2.3 子宮內膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF mRNA表達

2.3.1 各組不同妊娠天數小鼠子宮內膜HOXA10 mRNA表達情況

自然周期組中D4小組HOXA10 mRNA表達最高,與D2、D3、D5小組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);COH組中D3小組HOXA10 mRNA表達最強,與D2、D5小組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);電針組中 D4小組HOXA10 mRNA表達最高,與D2、D5小組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,P＜0.01),與 D3小組比較表達增加,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見表3。

表3 各組不同妊娠天數小鼠子宮內膜HOXA10 mRNA表達情況 (±s)

表3 各組不同妊娠天數小鼠子宮內膜HOXA10 mRNA表達情況 (±s)

注:與同組D4小組比較1)P＜0.01,2)P＜0.05;與同組D3小組比較3)P＜0.01

組別 D2 D3自然周期組 1.000±0.0001) 1.741±0.2231)COH 組 0.974±0.4543) 2.275±0.256電針組 0.995±0.2171) 1.734±0.066 D4 D5 2.248±0.265 1.722±0.1771)1.693±0.222 1.212±0.2523)1.902±0.234 1.457±0.1092)

2.3.2 各組不同妊娠天數小鼠子宮內膜整合素αvβ3 mRNA表達情況

自然周期組中D4小組整合素αvβ3 mRNA表達最高,分別與D2、D3和D5小組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,P＜0.01);COH組中D3小組整合素αvβ3 mRNA表達最強,分別與D2和D5小組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);電針組中整合素αvβ3 mRNA表達最高為D4小組,分別與D2和D5小組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),與D3小組比較表達增加,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見表4。

表4 各組不同天數孕鼠子宮內膜整合素αvβ3 mRNA表達 (±s)

表4 各組不同天數孕鼠子宮內膜整合素αvβ3 mRNA表達 (±s)

注:與同組D4小組比較1)P＜0.01,2)P＜0.05;與同組D3小組比較3)P＜0.01

組別 D2 D3自然周期組 1.000±0.0001) 1.396±0.4251)COH 組 0.965±0.6013) 2.140±0.658電針組 0.957±0.2642) 1.621±0.347 D4 D5 2.154±0.242 1.475±0.2562)1.608±0.381 1.133±0.3553)1.937±0.356 1.306±0.3072)

2.3.3 各組不同妊娠天數小鼠子宮內膜LIF mRNA表達情況

自然周期組中,D4小組LIF mRNA表達最高,分別與 D2、D3和 D5小組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);COH組中,D3小組LIF mRNA表達最強,分別與D2、D4和 D5小組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,P＜0.01);電針組中,D4小組LIF mRNA表達最高,分別與 D2和 D5小組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,P＜0.01),與 D3小組比較,表達增加,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見表5。

表5 各組不同天數孕鼠子宮內膜LIF mRNA表達 (±s)

表5 各組不同天數孕鼠子宮內膜LIF mRNA表達 (±s)

注:與同組D4小組比較1)P＜0.01,2)P＜0.05;與同組D3小組比較3)P＜0.01,4)P＜0.05

組別 D2 D3自然周期組 1.000±0.0001) 1.590±0.2441)COH 組 0.810±0.4873) 2.357±0.175電針組 0.896±0.2481) 1.839±0.236 D4 D5 2.470±0.401 1.608±0.151)1.649±0.2384) 1.068±0.1563)2.066±0.361 1.412±0.0412)

3 討論

LIF是白細胞介素-6家族中的細胞因子之一,在胚胎著床中發(fā)揮重要作用。種植窗期,子宮內膜分泌LIF,與囊胚表達的 LIF受體結合,促進囊胚植入子宮內膜[14]。整合素αvβ3可參與滋養(yǎng)細胞的黏附,在子宮內膜細胞和滋養(yǎng)層細胞上呈現周期特異性表達,其表達高峰與“種植窗期”吻合[15]。因此,與LIF、胞飲突等均為評估種植窗期的重要指標[16]。

本研究發(fā)現,自然周期組子宮內膜整合素αvβ3和LIF在見陰栓后第4天達到峰值,說明受孕后第4天為小鼠種植窗期,COH組中,作為評估種植窗期的重要指標的整合素αvβ3和LIF在受孕后第3天表達最高,表明子宮內膜發(fā)育提前,同時觀察到臨床妊娠率下降,說明超排卵藥物改變子宮內膜的發(fā)育進程,種植窗期提前開放,受精卵與子宮內膜發(fā)育不同步,是 IVF-ET臨床妊娠率低的原因。

中醫(yī)學雖無“種植窗”的概念,但古代文獻對其相關內容進行了一定描述。如張景岳曾提出:“此言婦人經期方止。其時子宮正開,便是布種之時,過此佳期,則子宮閉而不受胎矣?！敝嗅t(yī)學認為“腎藏精,主生殖”,《醫(yī)學衷中參西錄》中“男女生殖,皆賴腎臟作強”。在 IVF-ET中,超排卵耗傷大量腎陰腎精,導致精血不足,沖任虛衰,胞脈失養(yǎng),而難以攝精成孕。關元、中極和三陰交為臨床治療不孕癥的常用穴位[17]。三陰交為足三陰經交會穴,可滋補肝腎、調理沖任;關元、中極為任脈要穴?！端貑枴吠醣ⅰ皼_為血海,任主胞胎,兩者相資,故能有子”。三穴相配,共補腎精、調沖任。

同源盒基因(HOX)屬于多基因家族的轉錄調節(jié)基因,從3’到5’端分別有HOXA1～13,與生殖密切相關的有HOXA9、10、11和13。HOXA10是一種多效的轉錄調節(jié)因子,在胚胎著床及發(fā)育、細胞分化與增殖方面具有重要意義[18]。子宮內膜HOXA10表達減少可出現著床失敗和蛻膜化障礙[19]。臨床研究[20]發(fā)現,輸卵管性不育和反復植入失敗的婦女,子宮內膜 HOXA10和 HOXA11啟動子的甲基化水平表達異常。動物研究[21]顯示,HOXA10突變小鼠子宮內膜不能正常植入胚胎,而將HOXA10突變小鼠的胚胎移植到野生型小鼠子宮內,著床成功,說明母體HOXA10的良好表達是胚胎著床所必須的條件之一。HOXA10的表達貫穿整個月經周期,并隨月經周期呈現周期性改變,在種植窗期,高水平雌激素和孕激素作用下,子宮內膜HOXA10表達呈現高峰狀態(tài)[22-23]。在研究中發(fā)現,經過電針治療后,子宮內膜整合素αvβ3和LIF在受孕第4天表達最高,種植窗期恢復正常。HOXA10的表達在受孕第4天達到峰值,較COH組推遲1天,臨床妊娠率呈現上升趨勢,表明電針可能通過調控HOXA10的表達時相,來調節(jié)種植窗期的開放與關閉。

綜上所述,針刺調控COH小鼠子宮內膜HOXA10的表達時相,恢復正常種植窗期,使受精卵與子宮內膜發(fā)育同步,是電針提高IVF-ET臨床妊娠率的作用機制之一,但電針通過何種途徑來調控 HOXA10的表達時相,尚需進一步研究。