王 靜，鄒榮成，汪 捷，羅 兵

阿爾茨海默病又稱老年癡呆，是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，嚴重影響病人的認知及生活能力，降低病人生活質量。老年癡呆發(fā)病原因復雜，發(fā)病機制尚未完全闡明，尚無可靠有效的治療方案[1-3]。目前臨床常采用鹽酸多奈哌齊進行治療，該藥能夠可逆性地抑制乙酰膽堿酯酶引起的乙酰膽堿水解從而增加受體部位的乙酰膽堿含量，因此，短期內能夠取得較好的治療效果，但無法從根本上延緩或阻止疾病的發(fā)展，且存在一定的副反應[4-5]。腦脈通是由大黃、人參、葛根、川芎組成的復方中藥，可有效改善腦缺血再灌注損傷，是治療腦梗死的常用藥物。臨床研究發(fā)現(xiàn)鹽酸多奈哌齊聯(lián)合腦脈通治療老年癡呆效果顯著，療效穩(wěn)定，但關于兩者聯(lián)合用藥治療老年癡呆的作用機制尚未明確。老年癡呆病人腦組織常伴有一定的炎癥反應，而炎癥反應會導致病灶部位內皮糖萼損傷。內皮糖萼是覆蓋在內皮細胞表面的一種多糖蛋白類復合物，其損傷將會導致腦組織海馬神經(jīng)細胞損傷或凋亡。同時，內皮糖萼損傷引發(fā)的應激反應會進一步加重炎癥反應，加速老年癡呆疾病的發(fā)展。本研究通過構建大鼠老年癡呆模型，從腦組織內皮糖萼角度初步探討分析鹽酸多奈哌齊聯(lián)合腦脈通治療老年癡呆的作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 選擇無特定病原體(SPF)級健康雄性SD大鼠50只[購于南京青龍山動物繁殖場，合格證號：SCXK(蘇)2017-0001]，體質量200～250 g，飼養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，相對濕度(55±5)%，給予水分和普通飼料適應性飼養(yǎng)1周。本實驗已通過南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院動物委員會批準同意[科研倫審〔2018〕第18號]。

1.2 藥物與試劑 鹽酸多奈哌齊[國藥準字：H20070181，規(guī)格：10 mg，衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司生產]；腦脈通(醫(yī)院內制劑，組成：大黃9 g，葛根9 g，人參6 g，川芎6 g)，白細胞介素(IL)-6、IL-1、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒采購于南京森貝伽生物科技有限公司；神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)免疫組化試劑盒采購于南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1 老年癡呆大鼠模型的建立 SD大鼠正常飼養(yǎng)1周后，造模前禁食12 h，自由飲水，隨機分為空白組、模型組、鹽酸多奈哌齊組、腦脈通組與聯(lián)合用藥組，每組10只。除空白組大鼠外，其余各組均皮下注射D-半乳糖150 mg/(kg·d)，連續(xù)6周，第7周雙側海馬區(qū)注射10 μg聚集肽Aβ25～35，建立老年癡呆大鼠模型[6-7]。建模完成后通過比較空白組與各組模型大鼠行為學判斷建模是否成功。造模過程中模型組大鼠死亡1只，聯(lián)合用藥組大鼠死亡1只，腦脈通組1只大鼠造模失敗。

1.3.2 給藥方法 建模成功后，空白組和模型組給予生理鹽水2.50 mL/(kg·d)灌胃，鹽酸多奈哌齊組給予鹽酸多奈哌齊0.85 mg/(kg·d)灌胃，腦脈通組給予腦脈通復方制劑1.50 g/(kg·d)灌胃，聯(lián)合用藥組同時給予鹽酸多奈哌齊0.85 mg/(kg·d)與腦脈通1.50 g/(kg·d)灌胃。持續(xù)灌胃給藥8周。

1.4 取材與觀察指標 分別于給藥前、給藥1周、3周、5周和8周時，采用內眥靜脈采血，收集各組大鼠靜脈血，2 500 r/min離心10 min，取上清液轉移到已消毒的EP管內，-80 ℃保存。檢測各組大鼠給藥前及給藥1周、3周、5周、8周時內皮糖萼損傷標志物(Syndecan-1、硫酸乙酰肝素)水平。

給藥8周后以斷頸方式處死各組大鼠，取腦組織，采用甲醛固定，制備病理切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，于光學顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織形態(tài)。采用ELISA試劑盒檢測各組大鼠10%腦組織勻漿中IL-6、IL-1及TNF-α含量。采用免疫組化法檢測各組大鼠腦組織BDNF、NGF蛋白表達情況。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦組織海馬區(qū)HE染色結果 空白組腦組織海馬神經(jīng)細胞排列規(guī)則，數(shù)量正常；模型組腦組織海馬神經(jīng)細胞層次不清，呈現(xiàn)無規(guī)律性排列，且數(shù)量較少；鹽酸多奈哌齊組腦組織海馬神經(jīng)細胞排列稍顯規(guī)律性，數(shù)量較模型組增多；腦脈通組腦組織海馬神經(jīng)細胞排列趨于規(guī)律性，數(shù)量增多；聯(lián)合用藥組腦組織海馬神經(jīng)細胞排列恢復一定的規(guī)律性，數(shù)量增多。詳見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織海馬區(qū)HE染色結果(×100)

2.2 各組大鼠腦組織炎性因子水平 與空白組比較，模型組、鹽酸多奈哌齊組和腦脈通組大鼠IL-6、IL-1、TNF-α水平升高(P<0.05或P<0.01)，聯(lián)合用藥組與空白組炎性因子水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組、腦脈通組和聯(lián)合用藥組炎性因子水平降低(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠腦組織炎性因子水平比較 (±s)

2.3 各組大鼠腦組織BDNF、NGF蛋白表達水平比較 與空白組比較，模型組、鹽酸多奈哌齊組、腦脈通組與聯(lián)合用藥組BDNF表達水平均降低(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和腦脈通組BDNF表達水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，聯(lián)合用藥組BDNF表達水平升高(P<0.01)。與空白組比較，模型組、鹽酸多奈哌齊組和腦脈通組NGF表達水平降低(P<0.05或P<0.01)，聯(lián)合用藥組NGF表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和腦脈通組NGF表達水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，聯(lián)合用藥組NGF表達水平升高(P<0.01)。詳見表2、圖2。

表2 各組大鼠腦組織BDNF、NGF蛋白表達水平比較 (±s)

圖2 各組大鼠BDNF、NGF蛋白表達情況(免疫組化，×200)

2.4 各組大鼠灌胃前及灌胃給藥不同時間點內皮糖萼損傷標志物水平比較 空白組大鼠血清中糖萼損傷標志物(Syndecan-1和硫酸乙酰肝素)水平較低，且整個研究過程中無明顯變化。其他4組老年癡呆模型大鼠灌胃前Syndecan-1和硫酸乙酰肝素水平高于空白組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且模型組Syndecan-1和硫酸乙酰肝素水平在研究過程中無明顯變化。與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和腦脈通組在灌胃5周時，聯(lián)合用藥組在灌胃3周時，血清Syndecan-1和硫酸乙酰肝素水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與鹽酸多奈哌齊組和腦脈通組比較，聯(lián)合用藥組灌胃5周時血清Syndecan-1和硫酸乙酰肝素水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但其水平仍高于空白組(P<0.05)。各組大鼠不同時間點血清Syndecan-1和硫酸乙酰肝素水平變化見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠不同時間點血清Syndecan-1水平變化

圖4 各組大鼠不同時間點血清硫酸乙酰肝素水平變化

3 討 論

老年癡呆的發(fā)生與神經(jīng)原纖維纏結、乙酰膽堿含量降低、氧化應激及炎癥反應等相關。神經(jīng)原纖維纏結因神經(jīng)細胞內絲氨酸蛋白激酶3β被激活，上調微管相關Tau蛋白過度磷酸化產生，進而導致細胞骨架失穩(wěn)及記憶功能障礙。Tau蛋白過度磷酸化與氧化應激反應密切相關[8-9]。鹽酸多奈哌齊為選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑，能夠可逆性地抑制乙酰膽堿酯酶引起的乙酰膽堿水解進而增加受體部位的乙酰膽堿含量，改善老年癡呆，但治療具有一定的局限性，且存在副作用[10]。腦脈通由大黃、人參、葛根、川芎組成，具有抗炎、抗氧化、改善腦缺血的作用[11]。多年臨床實踐發(fā)現(xiàn)，鹽酸多奈哌齊聯(lián)合腦脈通治療老年癡呆效果較好，但其治療機制尚未闡明。

中醫(yī)學認為“癡呆”“呆病”與瘀血、痰濁等密切相關，與“熱”“毒”有關，抗炎、抗氧化作用的中藥對老年癡呆的治療可能存在重要潛力。老年癡呆病人血清炎性因子水平普遍高于正常人[12-13]，炎性因子能夠刺激細胞產生大量的活性氧簇，損傷血腦屏障和受損的細胞膜，加重氧化應激反應和神經(jīng)退化[14]。糖萼是覆蓋于血管內皮細胞內側的一種絨毛狀多糖-蛋白復合結構，對于維持血管通透性具有至關重要的作用，炎癥反應、氧自由基、缺血再灌注等多種因素均會造成糖萼結構受損[15-16]。老年癡呆病人通常伴有炎癥反應、高氧化應激水平，炎性因子及氧自由基造成糖萼受損，引起腦組織血管通透性升高，進一步促進炎癥反應，加重氧化應激水平，形成不良循環(huán)。腦脈通中大黃的主要活性成分大黃素及大黃鞣質具有較強的抗炎作用，可有效降低炎性因子水平；人參的主要活性成分人參皂苷具有較強的抗氧化能力，可降低氧化應激水平，有效改善缺血再灌注狀態(tài)[17-19]。

聯(lián)合用藥組糖萼損傷標志物及炎性因子水平顯著降低，海馬神經(jīng)細胞數(shù)量增多，恢復規(guī)則性排列，推測腦脈通可能通過改善內皮糖萼損傷，降低炎癥反應，進而修復海馬神經(jīng)元細胞，改善老年癡呆。同時鹽酸多奈哌齊是特異性可逆乙酰膽堿酯酶抑制劑，可有效抑制乙酰膽堿水解，增加乙酰膽堿含量，改善老年癡呆。鹽酸多奈哌齊和腦脈通聯(lián)合用藥可通過抑制乙酰膽堿酯酶水解，修復內皮糖萼，降低炎癥反應，發(fā)揮協(xié)同治療老年癡呆的作用。

綜上所述，鹽酸多奈哌齊聯(lián)合腦脈通可促進大鼠腦組織海馬神經(jīng)細胞數(shù)量及排列恢復，提高神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF和NGF水平，治療老年癡呆效果較好。其作用機制可能是腦脈通修復內皮糖萼、降低炎癥反應及鹽酸多奈哌齊抑制乙酰膽堿酯酶進而協(xié)同發(fā)揮治療效果。