張丹丹，孫玉嬋，路迎冬，方旭琴，曲 藝，崔向?qū)?/p>

心血管疾病是目前全球最主要的死亡原因，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是其病理基礎(chǔ)[1-3]。動(dòng)脈粥樣硬化被廣泛認(rèn)為是由動(dòng)脈壁內(nèi)含有脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞沉積驅(qū)動(dòng)所致的與炎癥反應(yīng)有關(guān)的慢性進(jìn)行性疾病[4-5]，且動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展也會(huì)伴隨著不斷升級(jí)的血管壁炎癥。大量的臨床試驗(yàn)研究充分表明，對(duì)于冠心病病人通過降低血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，可以降低20%～30%心血管事件風(fēng)險(xiǎn)，在極高危病人中甚至可達(dá)40%～50%[6]。但臨床研究結(jié)果同時(shí)顯示，盡管動(dòng)脈粥樣硬化病人在接受充分的他汀類藥物治療的部分病人中，即使LDL-C水平已經(jīng)達(dá)標(biāo)，但心血管事件仍有發(fā)生，炎癥仍可能成為剩余心血管事件發(fā)生的主要驅(qū)動(dòng)因素[7]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa，NF-κB)信號(hào)通路通過介導(dǎo)多種細(xì)胞因子的表達(dá)參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[8-11]，已成為抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物研究的靶點(diǎn)之一[12-13]。冠心舒通膠囊臨床廣泛用于冠心病的預(yù)防和治療[14-16]，本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，冠心舒通膠囊能夠降低ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠的血脂水平，縮小動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究冠心舒通膠囊對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈及血清炎性因子和NF-κB表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 16只6～8周齡雄性C57BL/6小鼠，48只6～8周齡雄性同系A(chǔ)poE-/-小鼠，全部由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部)提供，無特定病原體(SPF)級(jí)，體質(zhì)量18～20 g，許可證號(hào)：SCXK(京)2011-0012，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房，動(dòng)物室為清潔級(jí)，動(dòng)物的飼養(yǎng)條件：溫度(20±2)℃，濕度(50±2)%，標(biāo)準(zhǔn)12 h光照/12 h黑暗節(jié)律，自由飲水。C57BL/6小鼠采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，ApoE-/-小鼠采用高脂飼料(76.5%標(biāo)準(zhǔn)飼料、0.5%膽酸鈉、5%白糖、3%膽固醇、10%豬油、5%蛋黃粉配制)喂養(yǎng)，飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

1.2 藥物 冠心舒通膠囊為膠囊制劑(由廣棗、丹參、丁香、冰片、天竺黃組成)，由陜西步長制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：Z20020055。阿托伐他汀鈣片，由Pfizer Ireland Pharmaceuticals生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字J20120050。

1.3 試劑和儀器 白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒均由北京華英生物技術(shù)研究所提供，一抗小鼠抗大鼠NF-κB p65單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，批號(hào)：sc-8008)，二抗PV-6000(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：17G57D08)，TNF-α(Abcam，批號(hào)：Ab66579，兔多克隆抗體)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(Santa Cruz Biotechnology，批號(hào)：SC-365062)，免疫組化棕色 DAB顯色試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)，3K18小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)，脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司 JT-12S)，包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司 JB-P7)，病理切片機(jī)(德國Leica公司 RM2235)，CX21顯微鏡(日本奧林巴斯)，圖像分析軟件：Image-Pro Plus Version 6.0(IPP，USA)型圖像分析軟件。

1.4 方法

1.4.1 模型制備及分組 16只6～8周齡雄性C57BL/6小鼠普通飲食飼養(yǎng)作為正常對(duì)照組；48只6～8周齡雄性同系A(chǔ)poE-/-小鼠，采用高脂飼料喂養(yǎng)至12周(隨機(jī)殺死小鼠3只，油紅O染色，脂質(zhì)斑塊形成，造模成功)建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，將造模成功小鼠隨機(jī)分為模型組、冠心舒通組、阿托伐他汀組，每組15只。

1.4.2 給藥方式及途徑 冠心舒通組按照0.41 g/(kg·d)冠心舒通膠囊灌胃，阿托伐他汀組按照5 mg/(kg·d)阿托伐他汀鈣片灌胃，模型組和正常對(duì)照組灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)灌胃8周。

1.4.3 樣品制備 小鼠飼養(yǎng)至20周，禁食12 h，摘眼球取血，血液離心后-80 ℃凍存，進(jìn)行血清學(xué)檢測；無菌條件下解剖小鼠，切取小鼠主動(dòng)脈，仔細(xì)剝除結(jié)締組織，用生理鹽水沖洗干凈后，主動(dòng)脈組織一部分常規(guī)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋用于組織學(xué)分析；另一部分新鮮組織離體后液氮冷凍，用于蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測。

1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清IL-6、TNF-α水平 每組選取8只小鼠，摘眼球取血離心，取血清，測IL-6、TNF-α水平，實(shí)驗(yàn)步驟按照產(chǎn)品說明書操作。

1.4.5 免疫組織化學(xué)法檢測主動(dòng)脈組織中NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平 將備用切片預(yù)熱后脫蠟、梯度乙醇脫水。自來水沖洗2 min，pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液高壓、140 ℃修復(fù)2.5 min，自然冷卻。自來水沖洗3次，3%過氧化氫(H2O2)孵育10 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶。pH 7.2磷酸鹽緩沖液(PBST)沖洗3次，每次2 min，滴加一抗NF-κB p65(Santa Cruz Biotechnology，sc-8008，1∶500，鼠單克隆抗體)，37 ℃孵育2 h。pH 7.2 PBST沖洗3次，每次2 min，滴加一步法試劑盒中的二抗即PV6000中的羊抗鼠試劑，室溫孵育20 min。pH 7.2 PBST沖洗3次，每次2 min，DAB顯色自來水沖洗，75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，每組選取3只小鼠，在200倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野拍照，計(jì)算每張圖片陽性染色區(qū)域的積分光密度值(IOD)。

1.4.6 Western Blot檢測主動(dòng)脈組織中TNF-α蛋白的表達(dá)水平 取適量主動(dòng)脈組織，用干凈眼科剪剪成碎塊，用PBST洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液，低溫機(jī)器勻漿混勻，移入離心管中1 000 r/min，低溫離心10 min，

取上清用BCA法行蛋白定量后制成蛋白樣品。取上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳，取出電泳后的膠浸入轉(zhuǎn)膜液平衡120 min，行濕轉(zhuǎn)法蛋白轉(zhuǎn)膜，5%血清白蛋白(BSA)-PBST室溫封閉1 h。TNF-α一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育40 min。經(jīng)洗滌、顯影、灰度掃描后，用Scion Corporation分析軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行測定，分別以目的條帶灰度與內(nèi)參條帶GAPDH灰度的比值表示TNF-α蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活情況 采用高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠12周，造模成功后小鼠行動(dòng)緩慢，毛發(fā)稀疏無光澤。正常對(duì)照組小鼠活動(dòng)進(jìn)食正常，毛發(fā)順滑，濃密有光澤。

2.2 各組血清IL-6、TNF-α水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠IL-6、TNF-α水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，冠心舒通組和阿托伐他汀組IL-6、TNF-α水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，冠心舒通組和阿托伐他汀組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較(±s) 單位：pg/mL

2.3 各組主動(dòng)脈組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較 4組小鼠主動(dòng)脈組織中NF-κB p65存在不同程度表達(dá)，與正常對(duì)照組相比，模型組主動(dòng)脈組織中NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，冠心舒通組和阿托伐他汀組主動(dòng)脈組織中NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見圖1、圖2。

圖1 各組NF-κB p65蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果(陽性表達(dá)為棕色顆粒)

與正常對(duì)照組比較，＊ P<0.01；與模型組比較，# P<0.01。

2.4 各組主動(dòng)脈組織中TNF-α蛋白表達(dá)水平比較 為進(jìn)一步量化TNF-α的表達(dá)情況，進(jìn)行Western Blot檢測。結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，模型組TNF-α蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，冠心舒通組和阿托伐他汀組TNF-α蛋白表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見圖3。

與正常對(duì)照組比較，＊ P<0.01；與模型組比較，# P<0.01。

3 討 論

近年來，研究人員從動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過程中的不同病理變化入手闡述其機(jī)制，曾先后提出脂質(zhì)浸潤學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、平滑肌細(xì)胞克隆學(xué)說、炎癥反應(yīng)學(xué)說等多種機(jī)制，越來越多的研究表明，非感染性以及感染性因素引起的炎癥機(jī)制貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化的始終[17-18]。NF-κB是具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，經(jīng)高糖、低氧等刺激活化后參與調(diào)控多種細(xì)胞因子的生成， 在正常生理?xiàng)l件下，NF-κB位于細(xì)胞質(zhì)中，其p65亞基以同型二聚體的形式與抑制性蛋白IκB單體結(jié)合，形成復(fù)合體處于無活性狀態(tài)。當(dāng)受到外界各種病理因素的刺激時(shí)，蛋白激酶B(Akt)作為其重要的上游分子，可通過磷酸化IκB激酶促使后者降解IκB，使NF-κB與IκB分離，NF-κB激活并移位進(jìn)入細(xì)胞核，與特異靶基因結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種促炎癥細(xì)胞因子[19-20]。目前研究證實(shí)NF-κB參與調(diào)控的細(xì)胞因子IL-6和TNF-α與動(dòng)脈粥樣硬化炎癥、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、平滑肌細(xì)胞增殖等過程，以及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

IL-6由巨噬細(xì)胞分泌，是參與心血管疾病的重要的炎性因子。激活的IL-6可直接損傷血管內(nèi)膜，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)分泌增多，引起血管壁的炎癥反應(yīng)，增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積。有學(xué)者提出，病人血清中IL-6濃度越高，其發(fā)生冠狀動(dòng)脈硬化及再發(fā)心絞痛的風(fēng)險(xiǎn)越大[21]。IL-6還可刺激基質(zhì)降解酶的合成，侵蝕斑塊內(nèi)的基質(zhì)，從而導(dǎo)致不穩(wěn)定斑塊破裂。IL-6在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展中起著重要作用，可以作為動(dòng)脈粥樣硬化等其他心血管疾病重要的預(yù)測因子。TNF-α是一種多功能的炎性細(xì)胞因子，主要由激活的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞分泌。TNF-α作為NF-κB的主要下游因子，是炎癥反應(yīng)中最早的啟動(dòng)因子和損傷內(nèi)皮細(xì)胞的主要因素[22]。研究證實(shí)在心肌梗死后處于穩(wěn)定期的男性病人中， TNF-α升高與復(fù)發(fā)性冠狀動(dòng)脈事件的危險(xiǎn)性增加有關(guān)[23]。有研究表明在正常動(dòng)脈組織中沒有TNF-α的表達(dá)，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中存在TNF-α的表達(dá)，此外大量的TNF-α可使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊向不穩(wěn)定性方向轉(zhuǎn)變[24-25]。因此，檢測IL-6、TNF-α表達(dá)水平可作為預(yù)測心腦血管事件的指標(biāo)，降低其表達(dá)水平有利于延緩或抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。

動(dòng)脈粥樣硬化的形成多為喜食肥甘，脾胃受損，運(yùn)化失司，聚濕成痰，痰濕郁結(jié)，蒸騰津液，侵入心脈，絡(luò)損血瘀，而致痰瘀互結(jié)損傷脈管，影響局部氣血溫煦功能，結(jié)塊日久越堅(jiān)，這種痰瘀凝塊即是冠狀動(dòng)脈硬化之斑塊。冠心舒通膠囊由廣棗、丹參、丁香、天竺黃、冰片組成，其中廣棗行氣活血，為君藥，丹參養(yǎng)血活血、祛瘀止痛，為臣藥，丁香、冰片溫中降逆、調(diào)暢氣機(jī)，為佐藥，天竺黃清熱豁痰為使藥，全方共奏活血祛瘀、化痰通絡(luò)、行氣止痛之功效，體現(xiàn)了痰瘀同治的思想?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)廣棗果皮中含有豐富的有機(jī)酸類成分，其具有抗炎癥反應(yīng)的作用[26]。丹參中主要成分丹參酮ⅡA可作用于NF-κB信號(hào)通路的多個(gè)作用環(huán)節(jié)，包括抑制NF-κB-DNA復(fù)合體的形成、NF-κB結(jié)合活性及IκBα的磷酸化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)受NF-κB調(diào)控的下游促炎因子的調(diào)節(jié)，有效減低體內(nèi)炎癥因子及抑制甚至阻斷炎癥表達(dá)通路來達(dá)到緩解體內(nèi)炎癥反應(yīng)[27-28]。本研究表明，冠心舒通膠囊可顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血清炎性因子IL-6和TNF-α水平，并能降低小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中TNF-α和NF-κB的表達(dá)，推斷其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制與阻斷NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路的過度激活、抑制炎癥細(xì)胞在動(dòng)脈管壁集聚有關(guān)。