瑪麗娜·庫爾曼，包怡紅，2*

（1 黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室 哈爾濱150040 2 東北林業(yè)大學林學院 哈爾濱150040）

酵素是指動物、植物、菌類以微生物發(fā)酵制得的具有特定活性成分的產品。酵素的發(fā)酵方式分為人工接種發(fā)酵和自然接種發(fā)酵，與人工發(fā)酵相比，采用自然選擇適應性強的優(yōu)勢菌株發(fā)酵，具有更豐富的微生物多樣性，發(fā)酵過程中的微生物對酵素風味、顏色和營養(yǎng)特性起著關鍵作用[1]。酵素是具有多種功效的營養(yǎng)體，含有多種酶、維生素、礦物質等，具有抗氧化[2]，抗菌消炎[3]，美白養(yǎng)顏[4]，提高免疫力[5]等功效。近些年，微生物酵素發(fā)展較快，對酵素中益生菌分離純化的相關研究較多，其中主要益生菌為酵母菌和乳酸菌屬。益生菌是當機體攝入一定量時能夠平衡腸道菌群，并對宿主起到健康功效的活體微生物[6]。益生菌在降脂，增強免疫[7]，改善酒精性脂肪肝[8]，抑制腸病[9]，抗過敏[10]，抗腫瘤[11]，治療炎癥[12]以及強化營養(yǎng)方面均有一定效果。Teoh 等[13]從紅茶菌酵素中分離得到具有較好耐酸和耐高糖的接合酵母；Kim 等[14]將干酪乳桿菌接種于土豆泥中發(fā)酵，得到具有抗氧化功能的酵素飲品。

高濃度的血清膽固醇是引起動脈粥樣硬化、冠心病等心腦血管疾病的主要原因[15]。在膳食中膽固醇的推薦攝入量為250～300 mg/d[16]，過量攝入膽固醇將會危害身體健康。近年來，益生菌降血清膽固醇的作用已引起研究者的關注。眾多研究者以體內和體外試驗證實了一些益生菌有降低膽固醇的作用，如王霄鵬[17]測定了10 株益生菌的降解膽固醇和甘油三酯能力，發(fā)現干酪乳桿菌的降膽固醇能力最強，降解率達48.13%；Kim 等[18]研究發(fā)現短乳桿菌OK56 能降低高脂肪誘導的肥胖小鼠體重及附睪脂肪質量，抑制LPS 刺激的巨噬細胞TNF-α，IL-1β 和IL-6 的表達，降低血漿及結腸液中LPS 的水平，起到降脂的作用。菌株降低膽固醇主要為以下3 個機制：1） 在一定條件下，膽固醇與非結合型膽酸鹽的共沉淀作用，如Klaver等[19]提出共沉淀理論，在酸性條件下，發(fā)生共沉淀作用；2） 菌株細胞的同化吸收作用，如Gilliland等[20]證實嗜酸乳桿菌的同化作用；3）菌株產生膽鹽水解酶（BSH），使結合型膽酸鹽轉化成游離型膽酸鹽，從而與膽固醇結合，排出體外，如Taranto等[21-22]證實BSH 降膽固醇的機理。

本研究從民間自制的傳統酵素中篩選具有降膽固醇功能的菌株，通過測定菌株的體外降膽固醇能力、膽鹽耐受性、耐酸性、疏水性、自凝聚力及膽鹽水解酶活性，分析比較篩選菌株的降脂作用，并進行分子生物學鑒定，為進一步研究利用微生物影響脂代謝提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統民間酵素，由具有多年制作經驗并長期飲用的哈爾濱市某家庭提供，服用此酵素具有明顯降脂、減肥的作用。

鄰苯二甲醛，上?；瘜W試劑采購供應五聯化工廠；膽固醇，上海藍季生物；牛磺膽酸鈉、巰基乙酸鈉、考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、二硫蘇糖醇、?；撬?，上海源葉生物；二甲苯，天津市東麗區(qū)天大化學試劑場；茚三酮，天津市鑫鉑特化工有限公司。

MRS 培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20.0、蛋白胨10.0、牛肉膏10.0、酵母浸粉5.0、無水乙酸鈉5.0、檸檬酸二鈉2.0、K2HPO42.0、MgSO40.58、MnSO40.17、瓊脂15.0，吐溫-80 1.0 mL，pH 6.5，121 ℃滅菌20 min。MRS-CHOL 培養(yǎng)基、M17-CHOL 培養(yǎng)基、PDA-CHOL 培養(yǎng)基：分別在MRS 液體培養(yǎng)基、M17 肉湯培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基中添加3 mg/mL 膽鹽和1 mg/mL 膽固醇。BSH 篩選培養(yǎng)基：在MRS瓊脂平板的基礎上，添加3 g/L ?；悄懰徕c，2 g/L巰基乙酸鈉和0.37 g/L CaCl2。

1.2 儀器與設備

滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；722 型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；離心機，上海安亭科學儀器廠；生物顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；XK96-A 快速混合機，江蘇新康醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 膽固醇含量的測定 參考馮雁波等[23]的方法，以膽固醇標準溶液質量濃度（x，mg/mL）為橫坐標，吸光度（A550nm）為縱坐標，制得標準曲線為y=0.0067x+0.001（R2=0.9991）。

廣東省是學生溺水事故的高發(fā)省份，在自然水域或在游泳池中因不當游泳、搭救同伴、不小心跌滑發(fā)生的悲劇并不鮮見。究其原因，一是學生缺乏自我生命安全保護意識；二是家長安全監(jiān)護不利；三是在校內沒有系統地學習水中自救與水上救助的知識與技能。長期以來，華南師范大學附屬中學注重學生游泳及水上安全意識和技能的培養(yǎng)，并開發(fā)一系列校本游泳課程培養(yǎng)學生的游泳自救與水上救助能力，取得了豐碩的經驗成果。

1.3.2 降膽固醇菌株初篩 從原料中接菌進行平板培養(yǎng)得單菌落，分別挑選單菌落于相應的液體培養(yǎng)基中，將活化的菌株接種至含1 mg/mL 膽固醇 的MRS-CHOL、M17-CHOL、PDA-CHOL 培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h 后滅菌處理，5 000 r/min離心15 min，取上清液用鄰苯二甲醛比色法[24]測定A550nm。按照式（1）計算膽固醇去除率。

式中，B——對照組在波長550 nm 處的OD值；A——試驗組在波長550 nm 處的OD 值。

1.3.3 降膽固醇菌株復篩

1.3.3.1 菌株膽鹽耐受性測定 將活化后的菌株，按3%（體積分數）接種量接種于含有2 g/L 膽鹽的MRS、M17、PDA 液體培養(yǎng)基中，不加膽鹽的MRS、M17 和PDA 液體培養(yǎng)基為對照組。37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h，測各組菌液的OD600nm值。按照式（2）計算菌株的耐膽鹽存活率。

1.3.3.2 菌株耐酸性測定 將MRS、M17、PDA 液體培養(yǎng)基的pH 值分別調至3.0，6.0，其中pH 6.0的液體培養(yǎng)基為對照組。將2 次活化后的菌種按3%（體積分數）的接種量接種于上述培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16 h 后取樣，測定OD600nm值[25]。按照式（3）計算菌株的耐酸率。

1.3.3.3 菌株疏水性的測定 采用細菌黏著物質法（BATS）測定菌株的疏水性[26]。按5%（體積分數）接種量接種于相應的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，5 000 r/min 離心15 min，收集菌體，用無菌的PBS緩沖液（pH 6.8）洗滌2 次，將沉淀用緩沖液懸浮。緩沖液作為空白對照，用緩沖液調整菌體濃度，使其初始濃度在波長600 nm 下吸光值約為1，取4 mL 調整濃度后的菌液，加入0.8 mL 二甲苯（或氯仿），高速渦旋2 min，靜置10 min 分層，取下層水相（或上層水相）在波長600 nm 處測其吸光度A。按照式（4）計算菌株細胞表面的疏水率。

式中，A0——與二甲苯（或氯仿）混合前菌液在波長600 nm 下測量得到的吸光值；A——與二甲苯（或氯仿）混合后，菌液在波長600 nm 下測量得到的吸光值。

1.3.3.4 菌株自凝聚力測定 按5%接種量接種于相應的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，5 000 r/min 離心15 min，收集菌體，用無菌的PBS 緩沖液（pH 6.8）洗滌2 次，將沉淀用緩沖液懸浮。緩沖液作為空白對照，用緩沖液調整菌體濃度，使其初始濃度在波長600 nm 下吸光值約為1。菌液在試管中靜置1，24，48 h，取1 mL 上層菌液測定光密度值，每個菌株每個時間點做3 個平行[27]。按照式（5）計算菌株的自凝聚力百分比。

式中，A0——于600 nm 波長處測得的光密度值；At——靜置不同時間測得的光密度值。

1.3.3.5 菌株膽鹽水解酶定性測定 在液體培養(yǎng)基中添加3 g/L ?；悄懰徕c、2 g/L 巰基乙酸鈉、0.37 g/L CaCl2和15 g/L 瓊脂，121 ℃滅菌15 min，傾倒入無菌平板中，待凝固后把無菌濾紙片均勻放入平板中，在每個濾紙片上滴加10 μL 菌液（108～109CFU/mL），于37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h。若濾紙片周圍有白色沉淀物，則認為具有膽鹽水解酶活性[28]。

1.3.4 菌株膽鹽水解酶定量分析

1.3.4.1 粗酶解液的制備 按5%接種量接種于相應培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，5 000 r/min 離心15 min，收集上清液與菌體沉淀。上清液用超濾膜（30 ku）過濾濃縮，保存?zhèn)溆谩＞w用0.1 mol/L 磷酸緩沖溶液（pH 7.0）洗滌2 次，調整菌體濃度使其在波長600 nm 下的吸光度約為1.0。加入10 mmol/L 二硫蘇糖醇以減少BSH 的氧化，取1 mL上述細胞懸濁液，冰浴超聲破碎4 min，離心去除細胞碎片，得到無細胞提取液[29]。

1.3.4.2 酶活力測定 在10 μL 上述粗酶解液中加入180 μL 0.1 mol/L 磷酸緩沖溶液（pH 6.0），10 μL 200 mmol/L 結合膽鹽（TDCA） 和10 μL 0.1 mol/L 的石蠟油，混合后置于37 ℃培養(yǎng)30 min（以反應后加入結合膽鹽的樣品為對照）。立即在上述反應液中加入等體積的0.15 mg/mL 三氯乙酸終止反應，混合均勻，離心15 min，取上清液。將0.1 mL 上清液（樣品或對照）與1.9 mL 茚三酮顯色液混合，振蕩混勻，沸水浴14 min，用自來水冷卻3 min 后測定波長570 nm 下的吸光度。以?；撬釢舛龋é蘭ol/mL）為橫坐標，吸光值（A570nm）為縱坐標，制作標準曲線為：y=1.9791x-0.0066（R2=0.9995）。酶活力定義：單位時間、單位體積的粗酶，結合膽鹽水解產生氨基酸的物質的量，單位：μmol/（min·mL）。

1.3.4.3 蛋白質含量測定 參考考馬斯亮藍G-250 法[30-31]測定。

1.4 數據分析

數據統計分析采用Origin 9 和SPSS 20.0 分析軟件進行處理，試驗結果以平均值±標準偏差（±s）表示，顯著性水平P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 降膽固醇菌株的初篩

從傳統民間酵素中分離出51 株菌分別編號為S-1～S-12（MRS 培養(yǎng)基）、M-1～M-19（M17 培養(yǎng)基）和P-1～P-20（PDA 培養(yǎng)基）。如表1所示，菌株降膽固醇能力在8.03%～47.41%，只有S-5 菌的降膽固醇能力低于10%，多數菌的降膽固醇能力在20%以上，M-16 菌的膽固醇去除率為47.41%，對應的膽固醇降低量為474.1 μg/mL。黃燕燕等[28]研究發(fā)現，植物乳酸菌DMDL 9010 的膽固醇降解率為37.58%；嚴玉婷等[32]研究表明，從新疆酸馬奶中分離出的菌株降膽固醇能力在15.12%～66.82%，初篩出23 株降膽固醇能力較高的菌株進行后續(xù)研究。

2.2 降膽固醇菌株的復篩

2.2.1 菌株的耐受性 膽鹽耐受性和耐酸性是益生菌的重要特征，菌株發(fā)揮益生作用，需要經過胃酸屏障以及耐受腸道中的膽鹽。由表2可知，初篩出的23 株菌對膽鹽和酸呈現出不同的耐受性，在pH 值為3 的環(huán)境下，23 株菌都能夠生長，Wang等[33]從發(fā)酵芥末中篩選出的3 株菌均能在低酸環(huán)境下存活。M-7、S-8、M-2、M-16 的膽鹽耐受性較高，分別為65.64%，42.09%，23.96%和22.80%；M-7、M-16、S-8、M-19 的耐酸性比較高，分別為86.94%，72.68%，71.53%和70.32%；P-12 和P-14 的耐受性較高。因此，篩選出M-7、M-16、S-8、P-12 和P-14 共5 株菌進一步研究。

2.2.2 菌株的疏水性 疏水性與菌株的黏附性具有高度相關性，益生菌對腸上皮細胞的黏附能力涉及各種類型的相互作用，包括疏水性和自凝聚力[34]。Wadstroum 等[35]證實了疏水性高的乳酸菌對腸上皮細胞具有強的黏附性。本研究以二甲苯和氯仿為吸附劑，研究了菌株的疏水性，由圖1可知，P-12 和P-14 疏水性差異較?。籗-8 在二甲苯中呈較高的疏水性，達35.91%，超過了陳明等[36]篩選的XS40 菌株的疏水性（31.92%）；M-7 在氯仿中疏水能力強，疏水率為45.22%，S-8 和M-7 菌間存在顯著差異，且疏水性比其它3 株菌高。

表1 降膽固醇菌株的初篩Table 1 Primary screening of cholesterol-lowering strains

表2 菌株的膽鹽耐受性和耐酸性Table 2 Bile tolerance and acid resistance of strains

2.2.3 菌株的自凝聚力測定 由圖2可知，隨時間的延長，菌株的自凝聚力提高，在24 h 后，S-8、M-7、P-12 菌懸液上層呈現澄清狀態(tài)，自凝聚力在80%以上。S-8 菌的自凝聚力達88.42%。菌株的疏水性決定自凝聚力，同時與黏附性相關[37]。對腸道的黏附性強弱依次為：M-7＞S-8＞M-16＞P-12＞P-14，篩選出的菌株均具有良好的疏水性與自凝聚性，在腸道中具有較高的穩(wěn)定性，能夠很好的定殖于腸道。

圖1 菌株的疏水性Fig.1 Hydrophobicity property of strains

圖2 菌株的自凝聚力Fig.2 Self-agglomeration ability of strains at different standing time

2.2.4 菌株的膽鹽水解酶定性分析 膽鹽水解酶（BSH）是一種胞內酶，能夠將結合型膽鹽轉變成游離型膽鹽，游離膽鹽會與膽固醇結合形成復合體，排出體外[38]。在酸性條件下，游離型膽鹽與Ca2+結合，形成白色沉淀。因此，BSH 能夠作為篩選降膽固醇菌株的一個重要指標。由圖3可知，篩選出的5 株菌中S-8、M-7 和M-16 產生明顯的沉淀，說明這3 株菌具有BSH 活性，其它2 株菌沒有表現膽鹽水解酶活性。菌株中膽汁鹽水解酶（BSH）的存在使得它們對膽汁鹽更耐受，這也有助于降低宿主的血液膽固醇水平[39]。

圖3 菌株膽鹽水解酶定性測定Fig.3 Determination of bile salt hydrolytic enzyme activity in solid medium

2.2.5 菌株的膽鹽水解酶定量分析 通過茚三酮法測定膽鹽水解酶活力，由表3可知，S-8、M-7 和M-16 菌株均對?；悄懰徕c體現出膽鹽水解酶活性，M-16 菌的胞內酶比活力最高，達1.2807 U/mg，高于董自星[40]測定的羅伊氏乳桿菌BBE6 菌的酶比活力（0.149 U/mg）。這3 株菌的胞內酶活力均高于胞外酶活力，篩選出的菌株胞內酶比活力是胞外酶比活力的近7 倍，由此可得出，篩選出的菌株降脂酶可能源于胞內酶。胞外蛋白質含量高于胞內蛋白質含量，而蛋白質與降膽固醇作用沒有直接相關性，由此可知，S-8、M-7 和M-16 菌是具有高效降膽固醇潛能的菌株。

2.3 菌落及菌株形態(tài)學觀察

如圖4所示，A 圖中菌落呈中等大小，不透明，邊緣光滑整齊，凸起，為乳白色圓形；B 圖中菌落為淡黃色圓形，形態(tài)略比A 圖中的菌落大；C 圖中菌落較大，濕潤，透明，隆起，邊緣光滑，黏稠。在顯微鏡下觀察，D 圖中菌株細胞為短桿狀，成對或者鏈狀排列，E 細胞為圓形，單個或成串狀聚集，均無芽孢，無鞭毛，為革蘭氏陽性菌；F 圖中菌呈卵圓形，無鞭毛，不能游動。

表3 胞內和胞外粗酶液酶活力比較Table 3 Comparison of enzyme activity between intracellular and extracellular crude enzymes

圖4 篩選菌株的形態(tài)Fig.4 The morphology of the strains

2.4 菌株的16S rDNA 分子生物學鑒定

提取S-8、M-7 和M-16 菌的基因組DNA 后，用16S rDNA 通用引物進行PCR 擴增，各菌株的擴增產物序列長度在1 500 bp 左右，見圖5。

圖5 16S rDNA 片段PCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.5 Agarose gel electrophoresis patterns of PCR amplified-products of 16S rDNA fragments

將PCR 產物進行測序，測序結果在NCBI 網站上做Blast 序列分析，各菌株與參考菌株的同源性在99%以上（表4），用MEGA5 構建系統發(fā)育樹（圖6），呈現菌株間的親緣關系。

如表4所示，M-7 和M-16 菌株與人葡萄球菌極相似，同源性達100%；系統發(fā)育樹中顯示S-8 與副干酪乳桿菌的親緣關系最近，因此，鑒定S-8 為副干酪乳桿菌，M-7 和M-16 菌為人葡萄球菌。

表4 16S rDNA 序列分析結Table 4 16S rDNA sequence analysis results

圖6 S-8 菌株16S rDNA 序列構建的系統發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of S-8 strain based on the 16S rDNA sequence

3 結論與討論

近些年，酵素成為市場上的熱銷降脂產品，其中益生菌起主要降脂功效，益生菌可產生降低膽固醇的酶類，或本身細胞結構對膽固醇有吸附作用。Chiu 等[41]研究發(fā)現44 名志愿者食用日本阿馬托酶公司提供的酵素8 周后，志愿者體重和體脂肪等參數降低，總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇下降更為明顯。自然發(fā)酵的傳統酵素中微生物群體較為復雜，其中最為主要的是乳酸菌發(fā)酵，眾多研究者從中分離出植物乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌等[42]，也有分離出酵母菌，如Jayabalan 等[43]從自然發(fā)酵的紅茶中分離得到拜氏接合酵母和克勞森酒香酵母。

國內外的研究已證實乳酸菌具有高效降膽固醇的功效，并研究了相應的降脂機理。黃燕燕等[28]從開菲爾粒和陳年泡菜中分離得到降低膽固醇的乳酸菌，并從基因水平上分析了其可能的機理。本文采用民間自然發(fā)酵的傳統酵素，經多年服用具有很好降脂減肥功效的樣品，從中分離出51 株菌，多數菌株的膽固醇去除率在20%～40%之間，M-16 菌的降脂率達47.41%，明顯高于劉曉強[44]篩選出的消化乳桿菌的降低膽固醇能力（去除率為31.23%，降低量為62.89 μg/mL）。通過試驗發(fā)現，菌株的膽鹽耐受性差異較大，M-7、S-8 的膽鹽耐受性較高，分別為65.64%，42.09%，與李利等[25]研究的植物乳桿菌SN1 和鼠李糖乳桿菌SN6（0.3%膽鹽）結果相近。菌株平均耐酸性為66.28%，明顯高于高玉榮等[45]篩選的4 株菌的耐酸性（31.5%～48.8%）。菌株不僅以高活性到達腸道，也要定殖于腸道，生長繁殖，成為優(yōu)勢菌群，菌株的黏附性與疏水性和自凝聚力等特征密切相關。M-7 菌在氯仿中的疏水性比較高，與溫賀等[27]研究的結果相反，可能與不同菌株對有機溶劑的吸附性不同有關。自凝聚力與疏水性呈正相關，證實了疏水性決定自凝聚力[38]。在靜置24 h 后，菌液上層為澄清狀態(tài)，說明菌株對腸黏膜細胞具有較高的黏附性，具有較好的穩(wěn)定性，能夠在復雜的腸道系統中形成保護機制[46]。膽鹽共沉淀作用被認為是降低膽固醇機制的核心[47]，因此，本文從膽鹽水解酶角度分析降膽固醇作用，發(fā)現分離得到的P-12 和P-14 不產生膽鹽水解酶（BSH），其降脂作用可能與細胞的吸附作用等機制有關。S-8、M-7、M-16 菌的胞內酶比活力是胞外酶比活力近7 倍，丁苗等[48]研究發(fā)現，發(fā)酵酸肉中篩選出的消化乳桿菌RS10的胞內酶比活力是胞外酶的8.7 倍，因此，可以認為菌株降低膽固醇的降脂酶主要源于胞內酶。通過16S rDNA 序列分析，S-8 為副干酪乳桿菌，M-7 和M-16 為人葡萄球菌，資料表明人葡萄球菌一般是具有較弱致病力的病原菌，屬于凝固酶陰性葡萄球菌[49]，常定殖于人的皮膚、毛囊中。而本試驗發(fā)現這2 株球菌具有很好的降膽固醇能力以及良好的菌株特性，能夠表現膽鹽水解酶活性，并且提供酵素的制作者個人、家人和周圍人多年服用，表現出較好的降血脂和降體重的功效，對于該菌株的致病力及益生性有待進一步研究。提醒廣大消費者，民間傳統自制酵素雖有多種功效，但需謹慎飲用。