文向圓，原雨欣，余東亮，2，劉樹文，3，4*

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院 陜西楊凌712100 2 秦皇島金士國際葡萄酒有限公司 河北昌黎066600 3 陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心 陜西楊凌712100 4 陜西省合陽葡萄試驗示范站 陜西渭南715300）

酒酒球菌（Oenococcus oeni，O.oeni）是從葡萄酒中分離出的革蘭氏陽性菌[1-3]，通常在酒精發(fā)酵后大量繁殖，可以通過啟動蘋果酸-乳酸發(fā)酵（Malolactic fermentation，MLF） 將L-蘋果酸轉(zhuǎn)化成L-乳酸[4-5]。MLF 可以降低葡萄酒的酸度，柔和口感，增加葡萄酒的穩(wěn)定性和香氣[6-8]。在葡萄酒苛刻的環(huán)境條件下（高酒精度，低pH 值和營養(yǎng)匱乏）[9-11]，酒酒球菌因具有良好的抗逆性而成為MLF 的主要乳酸菌種[12-14]。酒酒球菌的生長最適pH 值為4.8，而葡萄酒中的pH 值通常為3.2～3.5，葡萄酒中的低pH 值是限制細(xì)菌生長的一個主要因素[15]，因此，研究酒酒球菌中的抗酸基因具有十分重要的意義。

在細(xì)菌中，F(xiàn)tsH 是一種細(xì)胞質(zhì)膜上的ATP 依賴蛋白酶[16-17]。FtsH 可使膜上的蛋白質(zhì)脫離，利用ATP 展開這些脫離蛋白并逐步降解它們[18]。在脅迫條件下敲除乳酸菌中FtsH 基因會降低細(xì)胞活力[19-21]。FtsH 的沉默使植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，L.plantarum）WSCF1 對高溫和高鹽的耐受能力及形成細(xì)胞膜的能力下降[22]。本研究中的ATPase 基因隸屬于FGGY 亞家族的L-核酮糖激酶基因。L-核酮糖激酶主要參與碳水化合物的代謝，在許多細(xì)菌的碳源和能量的獲得中發(fā)揮著重要作用[23-24]。根據(jù)這一特性推測其可能與細(xì)菌的抗性存在關(guān)聯(lián)。

目前，酒酒球菌中基因操作缺乏有效的分子技術(shù)，導(dǎo)致酒酒球菌基因功能的研究一直進展緩慢[25]。有研究成功地將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到酒酒球菌中[26]；Assad-García 等[27]使用酒精作為膜介質(zhì)成功實現(xiàn)了外源質(zhì)粒的導(dǎo)入；Darsonval 等[28]利用反義RNA 技術(shù)實現(xiàn)了酒酒球菌中hsp 基因的沉默，然而這樣的報道不太多。由于酒酒球菌轉(zhuǎn)化十分困難[7]，因此本研究在植物乳桿菌中驗證來源于酒酒球菌基因的功能。

本實驗室前期通過誘變得到3 對抗酸和酸敏酒酒球菌，并通過重測序比對3 對抗酸和酸敏酒酒球菌中的SNP 突變位點，共定位到181 個可能與抗酸相關(guān)的基因[29]。依據(jù)文獻報道挑取41 個基因進行實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，RT-qPCR），將結(jié)果分為2 類，一類為抗酸與酸敏菌株表達趨勢一致，另一類為抗酸與酸敏菌株表達趨勢不一致，從中挑選2 種典型的具有不同表達趨勢的基因進行分析，分別為ATPase 基因和FtsH 基因。本研究對ATPase 基因和FtsH 基因進行了表達量差異分析、生物信息學(xué)分析及功能驗證。分別在最適條件（pH 4.8）和脅迫條件（pH 3.0）的ATB 培養(yǎng)基中提取誘變酒酒球菌抗酸菌株b1 和酸敏菌株b2 的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進行RT-qPCR 分析，得到2 個基因的表達趨勢。接著提取2 株誘變菌株的DNA，克隆ATPase 基因和FtsH 基因，進行生物信息分析。最后將兩對基因在植物乳桿菌XJ25 中進行功能驗證，在脅迫條件（pH 3.2 的MRS 培養(yǎng)基）下測定試驗菌株和對照菌株（含空載體）生長能力的差異。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

誘變酒酒球菌抗酸菌株b1，誘變酒酒球菌酸敏菌株b2[29]和從葡萄酒中分離的植物乳桿菌XJ25 均由本實驗室保藏，甲基化缺陷型大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）HST04，Takara-寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

質(zhì)粒pMG36e 為江南大學(xué)惠贈（組成型質(zhì)粒，3 612 bp，紅霉素抗性，啟動子為P32）。

1.2 相關(guān)試劑與培養(yǎng)基

相關(guān)試劑：培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA 提取試劑盒（DP430）、Universal DNA 純化回收試劑盒（DP214）、質(zhì)粒小提試劑盒（DP103），天根生化科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus），Takara-寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，諾唯贊生物科技有限公司；NovoRecRPlus PCR 一步定向克隆試劑盒，近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；XbaI 限制性內(nèi)切酶、HindIII 限制性內(nèi)切酶，西安熱默爾生物科技有限公司。

培養(yǎng)基：酸性番茄汁培養(yǎng)基（Acid tomato juice broth，ATB）[30]、LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基和MRS 培養(yǎng)基[31]。

1.3 儀器與設(shè)備

QuantStudioTM6 Flex System PCR，賽默飛世爾科技有限公司；紫外可見分光光度計，Agilent Technologies；凝膠成像儀，北京賽智科技有限公司；電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 誘變酒酒球菌總RNA 提取及RT-qPCR在pH 4.8（最適條件） 和pH 3.0（脅迫條件）的ATB 培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)誘變酒酒球菌抗酸菌株b1 和酸敏菌株b2 至指數(shù)生長中期，取1 mL 菌液離心收集菌體。根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA 提取試劑盒（DP430）說明書，分別提取4 組處理的總RNA。調(diào)整4 組RNA 濃度一致，利用Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，反轉(zhuǎn)錄4 組RNA 為cDNA，存于-20 ℃待用。

為研究pH 4.8 和pH 3.0 條件下，ATPase 和FtsH 在誘變酒酒球菌抗酸菌株b1 和酸敏菌株b2中表達趨勢的差異，以ldhD（Gen Bank accession No.AJ831540.1）和gyrA（Gen Bank accession No.AJ831541.1）作為內(nèi)參基因[32]，以上述4 組cDNA為 模板，利用TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）試劑盒，進行RT-qPCR 擴增，反應(yīng)體系見表1，反應(yīng)程序為95 ℃30 s，95 ℃5 s，60℃34 s，40 個循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s，1 個循環(huán)。引物由Primer-Blast 在線設(shè)計，本文所有引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，序列如表2所示。按照2-△ct法分析結(jié)果。

1.4.2 基因克隆

1.4.2.1 質(zhì)粒與目的基因的連接 參照分子克隆實驗指南第4 版中的堿裂解法（大量制備），提取大腸桿菌中的質(zhì)粒pMG36e，使用限制性內(nèi)切酶XbaI 和HindIII 進行雙酶切，得到線性質(zhì)粒。參照重測序結(jié)果，設(shè)計擴增引物（表3），從抗酸菌株b1中 擴 增ATPase 和FtsH，命 名 為ATPase1 和FtsH1，從酸敏菌株b2 中擴增ATPase 和FtsH，命名為ATPase2 和FtsH2。ATPase PCR 反應(yīng)程序為95 ℃3 min，95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃2 min，35 個循環(huán)；72 ℃，10 min；FtsH PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃3 min，95 ℃30 s，55 ℃0 s，72 ℃2.5 min，35 個循環(huán)；72 ℃，10 min。

表1 RT-qPCR 反應(yīng)體系Table 1 RT-qPCR reaction system

表2 RT-qPCR 基因引物序列Table 2 RT-qPCR primer sequence of genes

分別純化線性質(zhì)粒和目的基因，利用NovoRec?Plus PCR 一步定向克隆試劑盒，將線性載體和目的基因進行同源重組，同源臂為20 bp左右。

表3 同源重組基因引物序列Table 3 Gene primer sequences of homologous recombination

1.4.2.2 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化 有研究證實以甲基化缺陷大腸桿菌HST04 為構(gòu)建重組質(zhì)粒的載體菌株，可顯著提高重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物乳桿菌的效率[33]，因此，本研究以甲基化缺陷型大腸桿菌HST04 為構(gòu)建重組質(zhì)粒的載體菌株。

利用CaCl2法制備大腸桿菌HST04 的感受態(tài)細(xì)胞。100 μL 感受態(tài)細(xì)胞中加入10 μL 連接產(chǎn)物，利用熱激法進行轉(zhuǎn)化。涂布于固體LB 培養(yǎng)基（含紅霉素200 μg/mL），37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落進行菌落PCR 鑒定。挑取大腸桿菌HST04 的陽性轉(zhuǎn)化子，分別提取重組質(zhì)粒pMG36e-ATPase1，pMG36e-ATPase2，pMG36e-FtsH1 和pMG36e-FtsH2。

1.4.3 生物信息學(xué)分析 將提取的4 個重組質(zhì)粒測序，引物為載體上的通用引物，如表4所示。分析目的基因的氨基酸序列。用ClustalX 2 進行序列比對，由EsPript 3.0 作圖；在NCBI 和UniProt上查找序列的基本信息；使用TMHMM Server v.2.0 在線預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域；應(yīng)用MEGA 5.1，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 為1 000。

1.4.4 重組植物乳桿菌的構(gòu)建及功能驗證 根據(jù)田雨[34]的方法制作植物乳桿菌XJ25 感受態(tài)細(xì)胞，將pMG36e-ATPase1，pMG36e-ATPase2，pMG36e-FtsH1，pMG36e-FtsH2 和空載體pMG36e 分別電轉(zhuǎn)到植物乳桿菌XJ25 感受態(tài)細(xì)胞中，挑單菌落進行PCR 鑒定，挑選陽性轉(zhuǎn)化子保存于-80 ℃。

將保存于-80 ℃的重組植物乳桿菌活化2 次，取指數(shù)生長中期菌液，按2%的比例接種于pH 3.2的MRS 培養(yǎng)基中，每隔3 h 測定菌液在波長600 nm 處的吸光度，繪制生長曲線。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 分析軟件對RT-qPCR 結(jié)果進行配對t 檢驗，分析其顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變酒酒球菌抗酸菌株b1 和酸敏菌株b2中ATPase 和FtsH 的相對表達量

在誘變酒酒球菌抗酸菌株b1 和酸敏菌株b2中，為研究ATPase 和FtsH 的表達趨勢，在pH 4.8和pH 3.0 的ATB 培養(yǎng)基中，分別測定抗酸菌株b1 和酸敏菌株b2 指數(shù)生長中期ATPase 和FtsH的相對表達量。如圖1a 所示，以pH 4.8 為對照，脅迫條件下ATPase 的表達量在b1 和b2 中均顯著上調(diào)（P＜0.05）；在b1 中上調(diào)約13 倍，在b2 中約上調(diào)5 倍；如圖1b 所示，以pH 4.8 為對照，脅迫條件下FtsH 的表達量在b1 中無顯著變化，在b2 中顯著上調(diào)（P＜0.05）。由此可知，脅迫條件下，誘變酒酒球菌抗酸菌株b1 和酸敏菌株b2 中ATPase 和FtsH 具有不同的表達趨勢。

2.2 誘變酒酒球菌ATPase 和FtsH 基因克隆及生物信息學(xué)分析

2.2.1 基因基本信息 為充分了解2 個基因的基本信息，在NCBI 和UniProt 中分別查找這2 個基因的信息，如表5所示。

圖1 誘變酒酒球菌抗酸菌株b1 和酸敏菌株b2 中ATPase 和FtsH 的相對表達量Fig.1 Relative expression levels of ATPase and FtsH in the mutagenized acid-tolerant O.oeni b1 and acid-sensitive O.oeni b2

2.2.2 基因克隆 從誘變酒酒球菌抗酸菌株b1中擴增ATPase1 和FtsH1，從酸敏菌株b2 中擴增ATPase2 和FtsH2，分別與質(zhì)粒pMG36e 重組，構(gòu)建質(zhì)粒 pMG36e-ATPase1，pMG36e-ATPase2，pMG36e-FtsH1 和pMG36e-FtsH2。使用載體上的通用引物pMG36eseq-F 和pMG36eseq-R 進行擴增，結(jié)果如圖2所示。空載體的理論擴增長度為406 bp，ATPase 的理論擴增長度為1 988 bp，F(xiàn)tsH的理論擴增長度為2 594 bp。由圖2可知，空載體和2 個基因的PCR 條帶大小正確。結(jié)果初步表明，重組質(zhì)粒pMG36e-ATPase1，pMG36e-ATPase2，pMG36e-FtsH1 和pMG36e-FtsH2 構(gòu)建成功。

表5 ATPase 和FtsH 的基本信息Table 5 Basic information of ATPase and FtsH

2.2.3 氨基酸序列比對 為研究ATPase1 和ATPase2 及FtsH1 和FtsH2 編碼蛋白的序列差異，將重組質(zhì)粒測序，比較目的基因的氨基酸序列，應(yīng)用ClustaL X 2.0 進行序列比對，EsPript 3.0 作圖，如圖3所示。ATPase 共發(fā)生5 處非同義突變，突變位點分別為57（D-V），123（V-E），173（K-E），248（D-G） 和521（I-V）；FtsH 共發(fā)生2 處非同義突變，分別為150（A-V）和680（D-N）。

2.2.4 功能結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測 用Pfam在線預(yù)測功能結(jié)構(gòu)域，TMHMM Server v.2.0 在線預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域。

ATPase 有2 個功能結(jié)構(gòu)域，分別為：12-241，F(xiàn)GGY-N；274-473，F(xiàn)GGY-C。綜合序列比對結(jié)果可知，ATPase 在功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)共發(fā)生3 處突變，分別為57（D-V）和123（V-E）位于功能結(jié)構(gòu)域FGGY-N 中，173（K-E）位于功能結(jié)構(gòu)域FGGY-C中。由圖4a 可知ATPase 無跨膜結(jié)構(gòu)域。

FtsH 有4 個功能結(jié)構(gòu)域，分別為：12-130，F(xiàn)tsH ext；229-362，AAA；384-428，AAA+；442-630，肽鍵家族M41。綜合序列比對結(jié)果可知，F(xiàn)tsH在功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)無突變。由圖4b 可知FtsH 有2個跨膜結(jié)構(gòu)域，位點分別為13-30 和134-156。綜合序列比對結(jié)果可知，F(xiàn)tsH 的134-156 跨膜結(jié)構(gòu)域中發(fā)生一個突變，突變位點是150（A-V）。

2.2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 為研究ATPase 和FtsH的進化關(guān)系，應(yīng)用MEGA 5.1，以模式菌株大腸桿菌和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中對應(yīng)的氨基酸序列及與酒酒球菌親緣關(guān)系較近的乳酸菌，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖5a 可知，在近源物種中，酒酒球菌中的ATPase 與乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的進化關(guān)系最近，其次是腸系膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides） 和植物乳桿菌，與植物乳桿菌中的序列同源性為55%，其中植物乳桿菌為本研究中功能驗證所用的宿主菌。有趣的是，酒酒球菌中的ATPase 與非近源物種鳥腸球菌（Entercoccus avium）的進化關(guān)系較近。由圖5b 可知酒酒球菌中的FtsH 與酒球菌屬（Oenococcus）的菌親緣關(guān)系最近，與植物乳桿菌的序列同源性為60%。由此可知，酒酒球菌中ATPase 和FtsH 序列與植物乳桿菌中的序列存在一定的差異。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR 條帶Fig.2 PCR band of recombinant plasmid

圖3 ATPase 和FtsH 的氨基酸序列比對結(jié)果Fig.3 Amino acid sequence alignment of ATPase and FtsH

圖4 ATPase 和FtsH 的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.4 Protein transmembrane domain prediction of ATPase and FtsH

圖5 ATPase 和FtsH 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of ATPase and FtsH

2.3 重組植物乳桿菌的構(gòu)建

為鑒定重組植物乳桿菌是否構(gòu)建成功，挑取轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR 鑒定。如圖6所示，對照組pMG36e-XJ25（以下簡稱con），ATPase1-pMG36e-XJ25 和ATPase2-pMG36e-XJ25（以下簡稱a1 和a2） 及FstH1-pMG36e-XJ25 和FstH2-pMG36e-XJ25（以下簡稱f1 和f2）的PCR 擴增條帶大小正確，表明5 個重組植物乳桿菌構(gòu)建成功。

2.4 重組植物乳桿菌脅迫條件下的生長曲線

為研究脅迫條件下a1 和a2 及f1 和f2 與對照（con）生長能力間的差異，在pH 3.2 的MRS 培養(yǎng)基中接種重組植物乳桿菌con，a1，a2，f1 和f2，使其初始OD 值約為0.08，測定其生長曲線，如圖7所示。在脅迫條件下，a1 和a2 的生長能力均強于con，a1 與a2 生長能力之間無明顯差異；f1 生長能力強于con，而f2 與con 生長能力無明顯差異。結(jié)果表明，ATPase1 和ATPase2 均可以提高菌株的抗酸性；FtsH1 可以提高菌株的抗酸性，而FtsH2 不能提高菌株的抗酸性。

圖6 重組植物乳桿菌的鑒定Fig.6 Identification of recombinant L.plantarum

圖7 重組植物乳桿菌在pH 3.2 的MRS 培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.7 Growth curve of recombinant L.plantarum in MRS medium at pH 3.2

3 結(jié)論與討論

1） 以pH 4.8 為對照，在pH 3.0 的ATB 培養(yǎng)基中，誘變酒酒球菌抗酸菌株b1 和酸敏菌株b2 中的ATPase 表達趨勢一致，均顯著上調(diào)。由功能驗證結(jié)果可知，ATPase 可提高菌株抗酸性，且5個突變位點57（D-V），123（V-E），173（K-E），248（D-G）和521（I-V）未影響該蛋白抗酸性。

ATPase 在UniProt 中被推測為L-核酮糖激酶，屬于FGGY 家族，具有磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，主要參與碳水化合物代謝過程，而碳水化合物的代謝是細(xì)胞獲取能量的重要途徑。結(jié)合ATPase 在b1和b2 中的表達量差異和ATPase 的功能來看，脅迫條件下抗酸菌株b1 獲取的能量可能大于酸敏菌株b2，這可能是導(dǎo)致誘變酒酒球菌b1 和b2 生長能力差異的一個原因。由重組植物乳桿菌a1 和a2 生長能力無明顯差異推測，ATPase 中的5 處非同義突變不影響該蛋白抗酸性。

2） 以pH 4.8 為對照，在pH 3.0 的ATB 培養(yǎng)基中，誘變酒酒球菌抗酸菌株b1 和酸敏菌株b2 中的FtsH 表達趨勢不一致，在b1 中無顯著變化，在b2 中顯著上調(diào)。FtsH 可提高菌株抗酸性；突變位點150（A-V）和680（D-N）影響了該蛋白的抗酸性。

FtsH 是一種細(xì)胞質(zhì)膜上的ATP 依賴性蛋白酶[17-18]。由FtsH 在b1 和b2 中的表達量差異及表型差異推測，位于跨膜結(jié)構(gòu)域的150（A-V）突變位點影響了FtsH2 的功能，使其不能正常發(fā)揮作用，因此導(dǎo)致重組植物乳桿菌f1 和f2 在脅迫MRS 培養(yǎng)基中的生長差異。同時也正是由于FtsH2 功能的喪失，使得酸敏菌株b2 中相關(guān)調(diào)節(jié)通路得不到反饋，從而試圖通過升高FtsH 的表達量來彌補這種不足。

3） 綜合2 個基因的表達情況和重組植物乳桿菌的表型差異，在篩選誘變酒酒球菌的抗酸基因時，可以將關(guān)注點放在誘變酒酒球菌抗酸菌株b1 和酸敏菌株b2 在脅迫條件下，相對表達量差異較大或表達趨勢不同的基因上，這也為后續(xù)抗酸基因的篩選奠定了基礎(chǔ)。