趙曉峰，賀銀鳳，李 暢

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院 呼和浩特010018 2內(nèi)蒙古財經(jīng)大學旅游學院 呼和浩特010070）

工業(yè)的急速發(fā)展，導致環(huán)境污染愈加嚴重，而鉛是環(huán)境中常見的重金屬污染物[1]。重金屬鉛、鉛合金被廣泛應(yīng)用于汽車、燃油、涂料、農(nóng)藥、化肥、蓄電池、含鉛油漆、鉛字印刷工業(yè)、化妝品等領(lǐng)域，這些鉛及鉛化合物將對土壤、大氣、水體造成難以降解和修復的污染[2]，進而通過植物根部或葉面被植物組織吸收[3-4]或進入水生生物體，最終經(jīng)由食物鏈或呼吸道進入人體，給人體健康帶來危害[5]。

由于微生物具有來源廣泛、生長迅速、吸附高效等優(yōu)點，因此微生物成為緩減重金屬污染的最佳吸附劑，在解決環(huán)境污染問題中發(fā)揮越來越重要的作用。相比傳統(tǒng)的物理化學方法，微生物修復技術(shù)以其成本低，處理效果好，無二次污染等特點，成為重金屬污染治理的一個很有潛力的新方法[6]。

微生物吸附重金屬的作用受到pH 值、溫度、吸附時間、菌濃度、鉛濃度等不同因素的影響。乳酸菌作為食品級的益生菌，對重金屬表現(xiàn)出的高效吸附及高耐受能力，越來越受到人們的關(guān)注。Halttunen 等[7]利用發(fā)酵乳桿菌ME3 和乳酸雙歧桿菌Bb12 去除水中的重金屬鉛和鎘，發(fā)現(xiàn)吸附受pH 值的影響較大。在合適的pH 值下，微生物細胞表面的官能團結(jié)合位點暴露出來，更易與金屬離子結(jié)合[8]。朱一民等[9]研究發(fā)現(xiàn)溫度對草分支桿菌吸附銅、鋅、鉛、鎳的影響較大，溫度升高阻礙了該菌對銅、鉛、鎳的吸附。研究表明，在微生物吸附重金屬的過程中，吸附率與重金屬離子初始濃度不呈線性關(guān)系。Hashim 等[10]在對S 桿菌吸附Cd2+研究時發(fā)現(xiàn)，Cd2+的吸附率隨Cd2+濃度的增加而降低，重金屬濃度升高會加大對微生物的毒害，影響吸附率。蔡青云[11]從贛州某鎢礦區(qū)受鉛鎘污染的土壤中分離純化出2 株菌（S 菌和R 菌），分別對其進行Pb2+、Cd2+吸附試驗時發(fā)現(xiàn)，吸附率會隨著菌體初始濃度的增加而增加，直到平衡，而吸附量會隨著菌體濃度的增加呈下降趨勢。李丹丹[12]在假單胞菌I3 吸附Pb2+的研究中發(fā)現(xiàn)，在吸附開始的30 min 內(nèi)，假單胞菌I3 對Pb2+的吸附能力迅速上升，菌體表現(xiàn)出快速吸附現(xiàn)象，隨著吸附時間的延長，在后續(xù)的30～240 min 時，Pb2+達到吸附平衡。

本文以從包鋼集團礦區(qū)受重金屬污染嚴重的土壤中，分離篩選出耐受Pb2+濃度高達6 000 mg/L的乳酸菌海氏腸球菌Qaa 為研究對象，研究高耐受重金屬鉛的乳酸菌海氏腸球菌Qaa 的吸附特性及其最佳吸附條件，為開發(fā)乳酸菌吸附重金屬的方法提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料 從包鋼集團礦區(qū)受重金屬污染嚴重的土壤中，分離篩選出的高耐受重金屬鉛的乳酸菌海氏腸球菌Qaa，該菌株由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院食品生物技術(shù)團隊實驗室保存。

1.1.2 試驗試劑 硝酸鉛（分析純級），國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸（分析純級），濮陽市吉興化工有限公司；氫氧化鈉（分析純級），廣州市綠邦化工有限公司。MRS 液體培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH 系列生化培養(yǎng)箱，常州恒隆科技有限公司；48 方孔深孔板，上海甘薇生物科技公司；AAS990 火焰原子吸收光譜儀，北京普析通用儀器有限公司；5810R 型高速低溫離心機，德國艾本德股份公司；MBR-022UP 深孔板高速振蕩搖培養(yǎng)箱，日本TAITEC 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌海氏腸球菌Qaa 吸附鉛特性試驗

1.3.1.1 重金屬Pb2+溶液母液的制備 稱取16 g Pb（NO3）2溶于超純水，用容量瓶定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 g/L 的鉛母液，備用。

1.3.1.2 標準曲線的繪制 用50 mg/L 的鉛溶液配制成質(zhì)量濃度分別為0，10，20，30，40，50 mg/L的標準溶液，利用火焰原子吸收分光光度計測定其對應(yīng)吸光度值，以標準曲線工作液的質(zhì)量濃度為橫坐標，對應(yīng)吸光度值A(chǔ) 為縱坐標，繪制標準曲線并求出吸光度值與質(zhì)量濃度關(guān)系的一元線性回歸方程。

1.3.1.3 不同質(zhì)量濃度的Pb2+的制備 利用100 g/L 的鉛母液分別制備Pb2+質(zhì)量濃度為50，100，150，200，250，300 mg/L 的溶液。

1.3.1.4 乳酸菌海氏腸球菌Qaa 對重金屬鉛的吸附能力測定 將篩選出的海氏腸球菌Qaa 活化至3 代，離心（6 000 r/min，10 min）得到菌體，用超純水洗滌3 次后，重復離心以獲得乳酸菌菌體。再次單獨離心菌體（8 000 r/min，5 min），然后制成50 g/L 的濕菌體菌懸液，備用。將硝酸鉛母液定容于100 mL 容量瓶中，使溶液中Pb2+的終質(zhì)量濃度達到50 mg/L，調(diào)pH 值為6，備用。在48 孔深孔板中，將乳酸菌菌懸液加入相同體積的Pb2+溶液（50 mg/L，pH 6）中，使?jié)窬w質(zhì)量濃度達到5 g/L。在深孔搖床培養(yǎng)器中振蕩培養(yǎng)（37 ℃，800 r/min）120 min，將吸附液離心（14 000 r/min，10 min），保留上清液，用火焰原子吸收分光光度計測定Pb2+的質(zhì)量濃度。設(shè)置2 組平行3 次重復試驗。

與測定標準曲線工作液相同條件下，測定吸附后上清液的吸光度值。代入標準系列的一元線性回歸方程中求樣品中Pb2+的含量。

鉛的吸附率和單位質(zhì)量菌體對鉛的吸附量的計算方法，見式（1～2）。

式中，M0——初始溶液中Pb2+的含量（mg）；M1——吸附后溶液中Pb2+的含量（mg）；m——添加的乳酸菌菌體量（g）。

1.3.2 不同因素對海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的影響 利用48 孔深孔板，將制備好的50 mg/L 菌體，取一定量加入到1.4 mL 的不同pH 值（2，3，4，5，6） 和不同鉛離子質(zhì)量濃度（50，100，150，200，250，300 mg/L）的溶液中，使其最終的菌種添加量分別達到0.5，1，1.5，2，2.5，5，10，25 g/L，然后在深孔搖床培養(yǎng)器中振蕩吸附（10，20，30，37，50 ℃，800 r/min），分別吸附10，20，30，60，120，240，360 min。吸附結(jié)束后，將吸附液離心（14 000 r/min，10 min），保留上清液，使用火焰原子吸收光譜法測定其中Pb2+濃度，設(shè)置2 組平行3 次重復試驗。利用SPSS 分析軟件對數(shù)據(jù)的顯著性進行分析，考察pH 值、濕菌體質(zhì)量濃度、Pb2+質(zhì)量濃度、吸附時間、吸附溫度對海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的影響。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化海氏腸球菌Qaa 吸附鉛的最佳條件選擇 通過單因素試驗結(jié)果，選取吸附時間、pH 值、濕菌體初始質(zhì)量濃度、Pb2+質(zhì)量濃度為影響因子，在響應(yīng)面模型中做4 因素3 水平的響應(yīng)面設(shè)計，2 組平行3 次重復試驗，編碼水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以Pb2+的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線如圖1所示。線性回歸方程為：y=0.0025x-0.0015，擬合度R2=0.9995。

表1 Box-Behnken 試驗設(shè)計因素和編碼Table 1 The factors and codes of Box-Behnken test design

圖1 鉛標準曲線Fig.1 Standard curve of lead

2.2 不同因素對海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的影響

2.2.1 不同pH 值對海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的影響 由圖2可知，海氏腸球菌Qaa 在吸附Pb2+的過程中，隨著pH 值的升高，吸附率也呈升高趨勢。在pH 值為5 時，吸附量達到了最大值（6.11±0.46）mg/g，差異顯著（P＜0.05）。這可能是由于隨著pH 值的升高，更多的負電荷官能團暴露于溶液中，從而具有更多的吸附位點可吸附重金屬離子。而且當pH 值大于6 時，會使重金屬鉛出現(xiàn)氫氧化物沉淀，從而導致吸附率降低，不利于吸附的正常進行。因此，結(jié)合考慮選擇pH 值為6 做后續(xù)的試驗。

2.2.2 不同溫度對海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的影響 菌體在適宜溫度范圍內(nèi)生長，同時在吸附Pb2+的過程中，吸附作用也會受到溫度的影響。該菌株分別在不同的溫度下進行吸附時，吸附結(jié)果見圖3。

圖2 不同pH 值對海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的影響Fig.2 Effect of different pH values on Pb2+ adsorption of E.hirae Qaa

圖3 不同溫度對海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的影響Fig.3 Effect of different temperatures on Pb2+ adsorption of E.hirae Qaa

由圖3可知，隨著溫度升高，海氏腸球菌Qaa的鉛吸附率和吸附量都呈升高趨勢。這可能是由于溫度升高，提高了海氏腸球菌Qaa 的生物活性，使菌體表面的活性位點增加，從而提高菌株的吸附能力。當溫度為50 ℃時，雖然吸附率和吸附量達到最高，但高溫更容易使菌體表面結(jié)構(gòu)受到破壞，影響吸附效果，因此選擇37 ℃做后續(xù)試驗。

2.2.3 不同吸附時間對海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的影響 試驗菌株在吸附的過程中，隨著吸附時間的延長，吸附能力也會有所變化。海氏腸球菌Qaa 在10～360 min 內(nèi)，對Pb2+的吸附量和吸附率的影響結(jié)果見圖4。

由圖4可知，海氏腸球菌Qaa 對Pb2+的吸附率和吸附量隨吸附時間的延長均呈上升趨勢，而且在吸附10 min 時就有吸附作用，說明海氏腸球菌Qaa 對重金屬鉛的吸附是一個相對快速的過程。之后隨著吸附時間的延長，吸附量和吸附率上升幅度相對較大，到240 min 時，吸附量和吸附率雖然在上升，但基本趨于穩(wěn)定，增加幅度較小。出現(xiàn)這樣的趨勢可能是由于該試驗菌株在鉛吸附過程中，胞外吸附占主要方式，通過細胞表面的官能團及大分子物質(zhì)與鉛離子結(jié)合，而使吸附量逐漸增加，當結(jié)合位點飽和時，吸附逐漸趨于平衡[8]。綜合考慮選擇吸附量和吸附率都相對較高時，并結(jié)合試驗實際操作，選擇240 min 做后續(xù)試驗。

2.2.4 不同濕菌體質(zhì)量濃度對海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的影響 海氏腸球菌Qaa 的濕菌體質(zhì)量濃度對其吸附Pb2+能力的影響如圖5所示。隨著菌體質(zhì)量濃度的升高，吸附率也隨之增大，吸附效果顯著提升。當濕菌體質(zhì)量濃度達到5 g/L 后，海氏腸球菌Qaa 對Pb2+的吸附率趨于平緩。當濕菌體質(zhì)量濃度為25 g/L 時，海氏腸球菌Qaa 的吸附率變化幅度較小，差異不顯著（P＞0.05）。觀察菌株的吸附量柱狀圖可以看到，隨著濕菌體質(zhì)量濃度的升高，吸附量出現(xiàn)明顯的下降趨勢。這樣的現(xiàn)象可能是在Pb2+質(zhì)量濃度一定時，隨著菌體質(zhì)量濃度的升高，菌體能提供給Pb2+的吸附位點也增加[13]，因此吸附率會逐漸上升，而菌體質(zhì)量濃度在逐漸增大時，菌體會聚集成團，使部分結(jié)合位點減少，因此單位菌體的吸附量會下降。綜合以上結(jié)果，權(quán)衡吸附量和吸附率的結(jié)果，選擇5 g/L 的濕菌體質(zhì)量濃度做后續(xù)試驗。

圖4 不同吸附時間對海氏腸球菌Qaa吸附Pb2+的影響Fig.4 Effect of different adsorption time on Pb2+ adsorption of E.hirae Qaa

圖5 不同的濕菌體質(zhì)量濃度對海氏腸球菌Qaa吸附Pb2+的影響Fig.5 Effect of different wet cell mass concentration on Pb2+ adsorption of E.hirae Qaa

2.2.5 不同Pb2+質(zhì)量濃度對海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的影響 由圖6可知，隨著Pb2+質(zhì)量濃度的升高，吸附率出現(xiàn)明顯下降?？赡苁钱擯b2+質(zhì)量濃度較低時，菌體的表面結(jié)合位點大于Pb2+的量，結(jié)合位點未達到飽和，因此吸附率較高。然而隨著Pb2+質(zhì)量濃度的升高，菌體表面的結(jié)合位點逐漸飽和，因此吸附率逐漸降低。然而隨著鉛質(zhì)量濃度的增加，該菌株的吸附量呈逐漸升高而后下降的趨勢。這可能是由于Pb2+質(zhì)量濃度的升高，靜電作用使Pb2+與菌體表面吸附位點的碰撞機率增大，使單位菌體吸附量增加[14]。然而菌體表面的結(jié)合位點飽和后，吸附量會出現(xiàn)下降趨勢。考量吸附量和吸附率2 個指標的交互變化，選擇Pb2+質(zhì)量濃度為100 mg/L 做后續(xù)試驗。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的最佳條件

通過單因素試驗，選取吸附時間（A）240 min，濕菌體質(zhì)量濃度（B）5 g/L，Pb2+初始質(zhì)量濃度（C）100 mg/L，pH 值（D）6 為影響因子，利用響應(yīng)面模型進行4 因素3 水平的響應(yīng)面設(shè)計，從而優(yōu)化海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的最佳吸附條件。

2.3.1 海氏腸球菌Qaa 回歸模型的建立及方差分析 將表2中海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的試驗結(jié)果進行多項式回歸分析，經(jīng)擬合回歸，得到吸附量R1對自變量A、B、C、D 的回歸方程為：

R1=7.29+0.30A+0.14B-1.57C+0.43D-0.12AB+0.18AC-0.67AD-0.17BC-0.064BD+0.62CD-1.01A2+0.24B2-0.20C2-1.11D2。

試驗?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)為R2=0.8970，驗證模型擬合較好。將表2中的響應(yīng)面試驗結(jié)果利用Design-Expert 軟件進行響應(yīng)面模型的回歸方程方差分析，結(jié)果如表3。

圖6 不同Pb2+質(zhì)量濃度對海氏腸球菌Qaa吸附Pb2+的影響Fig.6 Effect of different Pb2+ mass concentration on Pb2+ adsorption of E.hirae Qaa

由表3可知，回歸模型的P 值為0.0001＜0.01，表明回歸模型極顯著。失擬項P 值0.2312＞0.05，模型失擬度不顯著。表明該模型有較好的擬合度，可用該模型來分析和預測各因素對海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的影響。

表2 海氏腸球菌Qaa 的響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface of E.hirae Qaa

表3 海氏腸球菌Qaa 響應(yīng)面模型ANOVO 顯著性水平分析Table 3 ANOVO significant level analysis of response surface of E.hirae Qaa

（續(xù)表3）

通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的最佳吸附條件為吸附時間230 min，濕菌體質(zhì)量濃度6 g/L，Pb2+質(zhì)量濃度80 mg/L，pH 值為5.6，此模型預測吸附量為8.24 mg/g。在此吸附條件下，利用48 深孔板吸附法進行吸附試驗，測得吸附量為8.19 mg/g，接近預測值，說明該模型具有一定的參考價值。

3 結(jié)論

微生物吸附重金屬是一個較為復雜的過程，海氏腸球菌Qaa 在吸附Pb2+的過程中，受到pH值、吸附時間、濕菌體初始質(zhì)量濃度、Pb2+質(zhì)量濃度及吸附溫度的影響，使得吸附率和吸附量呈現(xiàn)不同的變化趨勢。而且在吸附過程中，各因素之間的相互作用，也會共同影響海氏腸球菌Qaa 對Pb2+的吸附作用。通過單因素試驗及響應(yīng)面法對海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的吸附條件進行優(yōu)化，得出海氏腸球菌Qaa 吸附Pb2+的最佳吸附條件為吸附時間230 min，濕菌體質(zhì)量濃度6 g/L，Pb2+質(zhì)量濃度80 mg/L，pH 值為5.6，此模型預測吸附量為8.24 mg/g。同時經(jīng)過驗證，證實了該模型具有一定的參考價值，為接下來對海氏腸球菌Qaa 的深入研究及應(yīng)用打下基礎(chǔ)。