楊志軒，方 冰，任發(fā)政，冷小京

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系 教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室 北京100083）

癌癥是世界范圍內(nèi)主要的公共衛(wèi)生問題[1-2]，全球91 個國家的首要死因之一[3]。近年來，雖然有關(guān)癌癥的預(yù)防、治療研究進展迅猛，但其發(fā)病率亦居高不下，據(jù)報道，2006—2016年，全球癌癥的發(fā)病率增加了28%[4]，我國每年有1 萬多人被診斷為新發(fā)癌癥[5]。開發(fā)有效的、毒副作用小的抗腫瘤藥物仍是國內(nèi)外研究的熱點[6-7]，針對腫瘤細胞的分子靶向藥物得到廣泛關(guān)注[8]。

靶向藥物是指一類能夠與致癌因子特異性結(jié)合，通過一系列的生化反應(yīng)使腫瘤細胞特異性凋亡或壞死，而不傷害腫瘤周圍正常組織細胞的藥物[9]。目前的分子靶向藥物的設(shè)計靶點主要包括：表皮生長因子受體家族、血管生成相關(guān)、細胞膜特異性抗原等[10]。然而，在臨床上，這類藥物進入體內(nèi)后，很可能造成治療靶點發(fā)生基因突變而產(chǎn)生耐藥性，還會激活腫瘤分子的其它信號通路，從而使藥物失效[10]，因此在臨床上通常采用多種靶點藥物聯(lián)合治療的手段[11]。由不同藥物的相互作用而產(chǎn)生的副作用還待進一步研究[12]。有研究表明，腫瘤細胞具有能量代謝旺盛的特點，靶向抗腫瘤藥物也常以此為靶點進行藥物設(shè)計，從而從根本上抑制腫瘤細胞的“生命源泉”[13]，并且不會產(chǎn)生耐藥性，因此腫瘤細胞的能量代謝，成為近年來的分子靶向藥物研發(fā)的熱點[14-15]。

細胞可以利用葡萄糖、脂肪酸、氨基酸等底物進行氧化供能產(chǎn)生ATP[16-17]，目前針對能量代謝這一靶點開發(fā)出的藥物，基本上都是通過切斷這些能量底物的供給，起到抑制腫瘤細胞的能量代謝，如2-脫氧葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose，2-DG）能夠阻止葡萄糖轉(zhuǎn)換為6-磷酸葡萄糖[14]，紫草素（Shikonin）或者奧利司他（Orlistat）能夠阻止磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸[14]。然而，這些藥物僅能夠切斷某一條功能通路，在臨床應(yīng)用時，往往不能夠真正實現(xiàn)細胞內(nèi)ATP 總量的降低。需開發(fā)一種能夠直接降低ATP 含量的抗腫瘤藥物，才能夠從根本上切斷腫瘤細胞的能量供給。

人乳中發(fā)現(xiàn)的乳白蛋白-油酸抗腫瘤復(fù)合物（α-LA-OA），在細胞和動物水平均證明其有良好的抗腫瘤效果。近年來研究發(fā)現(xiàn)，α-LA-OA 能夠影響腫瘤細胞能量代謝的相關(guān)蛋白和基因，但其能否對腫瘤細胞的能量代謝產(chǎn)生影響仍缺乏直接證據(jù)。α-LA-OA 可選擇性殺死腫瘤細胞而不影響健康分化細胞的活性，不僅在人膠質(zhì)母細胞瘤[18]和膀胱癌的小鼠模型[19]中得到驗證，還在人皮膚乳頭狀瘤[20]和膀胱癌患者[21]身上得到證實。α-LAOA 的抗腫瘤機制研究早期多集中于其激活凋亡[22]、自噬[23]等程序性死亡通路上。近年來研究發(fā)現(xiàn)，其抗腫瘤機制可能是通過干擾腫瘤細胞能量代謝，最終引發(fā)細胞死亡。Storm 等[24]發(fā)現(xiàn)，增強糖酵解和氧化磷酸化水平的基因——c-Myc，能夠促進α-LA-OA 對腫瘤細胞的致死作用，并且通過抑制己糖激酶和丙酮酸激酶同功酶M2，將糖酵解轉(zhuǎn)移至磷酸戊糖途徑。Fang 等[25]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，α-LA-OA 能夠顯著影響腫瘤細胞中參與能量代謝的相關(guān)蛋白的表達。然而，現(xiàn)有研究并未直接評估α-LA-OA 處理腫瘤細胞后，腫瘤細胞糖酵解、線粒體有氧呼吸這2 個能量代謝主要途徑的變化。鑒于此，本文利用能量代謝儀研究α-LA-OA 處理肝癌細胞對肝癌細胞糖酵解及線粒體有氧呼吸過程的影響，為探明α-LA-OA 的抗腫瘤機制以及腫瘤靶向藥物的開發(fā)，提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要細胞及培養(yǎng)條件 人肝癌細胞（HepG2），中國科學(xué)院細胞庫。HepG2 培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細胞長至單層時，用含0.25%EDTA 的胰酶37 ℃消化處理2 min，按照1∶2 的體積比進行傳代培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 牛α-乳白蛋白（α-LA，純度≥85%）、油酸（Oleic acid，OA，C18∶1∶9，順式結(jié)構(gòu)，純度≥99.0%），Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；葡萄糖（Glucose，1.0 mol/L）、L-谷氨酰胺（L-glutamine，200 mmol/L）、丙酮酸（Pyruvate，100 mmol/L），安捷倫科技（中國）有限公司；胎牛血清，美國Gibco 公司；其它化學(xué)試劑均為分析純級。

1.2 儀器及設(shè)備

3111 二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo 公司；DK-98-II2KW 潔凈工作臺，天津泰斯特儀器公司；ZDX35BI 自動高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；Sigma 3K30 低溫高速離心機，德國Satorious 公司；KS260 電熱恒溫水浴搖床，德國IKA公司；Infinite M200 Pro 全波長酶標儀，瑞士TECAN 公司；XFe24 Seahorse 細胞能量代謝分析儀，安捷倫科技貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 α-LA-OA 制劑的配制

根據(jù)Fang 等[26]改進的方法制備，將α-LA 溶于磷酸鹽緩沖液中，加入OA 后，于45 ℃加熱使二者結(jié)合。同時將不添加OA 的α-LA 溶液作為對照；將不含α-LA 的溶液作為對照緩沖液。

1.4 細胞培養(yǎng)和細胞活力測定

將生長在對數(shù)期的HepG2 細胞以1x104個細胞/孔的密度接種在96 孔板中，生長24 h。分3組，分別加入對照緩沖液、α-LA 和α-LA-OA，使培養(yǎng)基終濃度分別為10，20，60，80 μmol/L，每個處理設(shè)置4 個副孔。在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后，每孔加入10 μL 細胞計數(shù)試劑盒-8（Cell counting kit-8，CCK-8） 溶液，37 ℃孵育1 h 后在波長450 nm 下讀取每個孔的OD 值。細胞活力按式（1）計算。

1.5 糖酵解能力測定

細胞的操作如圖1所示，將生長在對數(shù)期的HepG2 細胞以2×104個細胞/孔的密度接種在Seahorse XF24 專用細胞板中，其中設(shè)置4 個空白校正孔，將探針板用水化液在37 ℃活化12～72 h。專用細胞板在37 ℃，5%CO2下培養(yǎng)24 h 后，對細胞做3 種處理：分別加入對照緩沖液、α-LA、α-LA-OA，使終濃度均為0.4 μmol/L，每組設(shè)置6～7個副孔。24 h 后用只含有4 mmol/L L-谷氨酰胺的XF24 海馬培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，在無CO2、37 ℃條件下饑餓1 h，同時在XF24 探針板中的A，B，C孔中依次添加56 μL 葡萄糖溶液（10 mmol/L），62 μL 的寡霉素溶液（Olipomycin，1 μmol/L）和69 μL 2-脫氧葡萄糖溶液（50 mmol/L）。在Seahorse 能量代謝儀上測量HepG2 細胞中的胞外酸化率（ECAR），用以表征細胞的糖酵解能力。測定結(jié)束后，對每孔細胞進行消化、計數(shù)，用于均一化。

圖1 細胞能量代謝儀的操作流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the operation flow of the cell energy metabolism instrument

1.6 線粒體耗氧率（OCR）的測定

在能量代謝儀上測量HepG2 細胞中的線粒體耗氧率，用含有25 mmol/L 葡萄糖、4 mmol/L L-谷氨酰胺和1 mmol/L 丙酮酸的XF24 海馬培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，在XF24 探針板的A，B，C 孔中依次添加56 μL 寡霉素（1 μmol/L），62 μL 的三氟甲氧基苯腙羰基氰化物（1 μmol/L），69 μL 魚藤酮（0.5 μmol/L）及抗霉素A（0.5 μmol/L）混合溶液。其它操作步驟同1.5 節(jié)。

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)值表示為至少3 次獨立試驗的平均值±標準差。數(shù)據(jù)用SPSS 統(tǒng)計軟件（版本18.0）進行分析，使用單因素方差分析（ANOVA），然后進行Duncan’s 檢驗，其中P＜0.05 視為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-LA-OA 的抗腫瘤活性

不同濃度的α-LA-OA 和α-LA 處理HepG2細胞24 h 后，細胞活力如圖2所示。從圖中可以看出，α-LA-OA 能夠劑量依賴性的殺死腫瘤細胞，其劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線為y=-0.0111x+1.0924，R2=0.9776。而經(jīng)過同樣處理的α-LA 在所有測試劑量下，對腫瘤細胞的活性并無顯著影響（P＜0.05）。

2.2 α-LA-OA 對糖酵解的影響

用40 μmol/L 的α-LA-OA、α-LA 和對照組處理HepG2 細胞24 h 后，細胞的胞外酸化率如圖3所示。糖酵解的終產(chǎn)物為乳酸及二氧化碳（CO2），二者含量可以通過測定細胞中的酸化水平來評估，因此，糖酵解過程的變化可以通過胞外酸化率的變化反映。不同藥物處理后的細胞，經(jīng)過1 h 的饑餓處理，胞外酸化率會降低至基礎(chǔ)水平，由圖3可以看出，α-LA-OA 處理細胞24 h 后，細胞內(nèi)的基礎(chǔ)糖酵解水平已低于其它2 個處理組。隨著10 mmol/L 葡萄糖溶液的加入（圖3Ⅰ），葡萄糖迅速被分解代謝為丙酮酸，產(chǎn)生乳酸或者CO2，導(dǎo)致細胞的胞外酸化率（ECAR）顯著增加。待其穩(wěn)定后，通過加入抑制劑寡霉素抑制細胞線粒體有氧呼吸的供能途徑（圖3Ⅱ），使細胞的氧化磷酸化被抑制，所有的葡萄糖及能量底物均進行糖酵解供能，釋放出乳酸和CO2，因此胞外酸化率會進一步升高。最后通過加入糖酵解第1 步的抑制劑2-脫氧葡萄糖（圖3Ⅲ），完全抑制細胞的糖酵解過程，使胞外酸化率降低到初始水平。

圖2 CCK-8 法檢測α-LA-OA 處理后HepG2細胞的活力Fig.2 CCK-8 assay for the viability of HepG2 cells after α-LA-OA treatment

圖3 α-LA-OA 處理腫瘤細胞后的胞外酸化率變化曲線圖Fig.3 Curve of extracellular acidification rate of tumor cells treated with α-LA-OA

根據(jù)圖3及試劑盒方法可以計算出細胞的糖酵解能力，結(jié)果如圖4所示?？梢钥闯觯?LA-OA顯著降低了細胞的糖酵解能力（P＜0.05），而經(jīng)過同樣處理的α-LA 和對照組對細胞的糖酵解能力并無顯著影響（P＞0.05）。

圖4 α-LA-OA 處理腫瘤細胞后的糖酵解及糖酵解能力Fig.4 Glycolytic and glycolysis ability of tumor cells treated with α-LA-OA

2.3 α-LA-OA 對線粒體有氧呼吸的影響

用40 μmol/L 的α-LA-OA、α-LA 和對照組處理HepG2 細胞24 h 后，細胞的耗氧量如圖5所示。有氧呼吸是指細胞在氧氣參與下的一系列生化反應(yīng)過程，因此有氧呼吸過程的變化可以通過耗氧率的變化反映。不同藥物處理后的細胞，經(jīng)過1 h 的饑餓，細胞耗氧量降低至其基礎(chǔ)水平，由圖5可以看出，α-LA-OA 及α-LA 處理細胞24 h后，細胞內(nèi)的基礎(chǔ)糖酵解水平均低于對照組。隨著ATP 合酶抑制劑，寡霉素（圖5Ⅰ）的加入，使細胞用于ATP 合成的耗氧量減少，即此時減少的耗氧是機體用于ATP 合成的耗氧量；待其穩(wěn)定后，通過加入線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)劑——三氟甲氧基苯腙羰基氰化物（圖5Ⅱ），破壞線粒體內(nèi)膜，使大量質(zhì)子回流，使氧被最大程度的消耗，因此細胞的耗氧率會進一步升高[27]；最后加入呼吸鏈抑制劑——魚藤酮-抗霉素A 復(fù)合溶液（圖5Ⅲ），使線粒體呼吸作用停止，并使其耗氧率降低至由非線粒體呼吸作用產(chǎn)生的水平。

根據(jù)圖5及試劑盒方法可以計算出基礎(chǔ)呼吸值、ATP 產(chǎn)生量，結(jié)果如圖6所示。可以看出，雖然圖5中α-LA-OA 及α-LA 處理組的細胞耗氧率曲線均低于對照組，但經(jīng)過計算發(fā)現(xiàn)，僅α-LAOA 處理組能夠顯著降低細胞的基礎(chǔ)呼吸（P＜0.05），而經(jīng)過同樣處理的α-LA 和對照組對細胞的基礎(chǔ)呼吸并無顯著影響（P＞0.05）；α-LA-OA 顯著降低了線粒體ATP 產(chǎn)生量（P＜0.05），而經(jīng)過同樣處理的α-LA 和對照組對細胞的ATP 產(chǎn)生量并無顯著影響（P＞0.05）。

圖5 α-LA-OA 處理腫瘤細胞后的耗氧率變化曲線圖Fig.5 Curve of oxygen consumption rate of tumor cells treated with α-LA-OA

圖6 α-LA-OA 處理腫瘤細胞后的基礎(chǔ)耗氧及ATP 產(chǎn)生量Fig.6 Basic oxygen consumption and ATP production of tumor cells treated with α-LA-OA

3 結(jié)論

綜上所述，本研究證明了α-LA-OA 能夠顯著降低人肝癌細胞的糖酵解能力和線粒體有氧呼吸能力，并降低ATP 的產(chǎn)生量和基礎(chǔ)呼吸（P＜0.05），而經(jīng)過相同處理的蛋白本身（α-LA）和溶劑對照組均無上述作用。因此，α-LA-OA 能夠干預(yù)腫瘤細胞的能量代謝過程，通過降低腫瘤細胞基礎(chǔ)代謝能力阻斷其ATP 供應(yīng)，為今后抗腫瘤藥物的開發(fā)提供了新的機遇。