陳戀戀，朱春凱，鄭培明

CHEN Lianlian1 ,ZHU Chunkai2 ,ZHENG Peiming2

1.Department of Laboratory,Affiliated Hospital of He'nan Academy of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450000,China; 2.Department of Laboratory,He’nan People's Hospital,Zhengzhou 450000,China

0 引言

食管癌是臨床常見(jiàn)消化道腫瘤之一，其發(fā)生與遺傳、飲食習(xí)慣、環(huán)境等多種因素有關(guān)[1]。此疾病患病情況在中國(guó)呈地域性差異，一定區(qū)域絕對(duì)高發(fā)率與附近地區(qū)相對(duì)低發(fā)率形成鮮明對(duì)比，是中國(guó)食管癌典型的流行病學(xué)特征[2]。盡管近年食管癌診斷、治療技術(shù)不斷進(jìn)步，但預(yù)后仍較差，中晚期患者5年生存率不足20%[3]。因此，繼續(xù)加強(qiáng)食管癌早期診斷、預(yù)后評(píng)估，為臨床完善針對(duì)性治療方案提供客觀依據(jù)是當(dāng)前研究熱點(diǎn)、重點(diǎn)之一。已有研究顯示，食管癌病因、機(jī)制與細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)等多種因素協(xié)同作用有關(guān)[4]。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）是凋亡相關(guān)基因家族主要成員之一，在惡性細(xì)胞增殖、凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，參與多種惡性腫瘤的演變過(guò)程[5]；微小RNA-451（miR-451）是病理狀態(tài)下機(jī)體組織細(xì)胞重要組成部分，已有研究表明，其在食管癌中存在異常表達(dá)情況[6]；輔助性T細(xì)胞17（Th17細(xì)胞）是近年新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群成員，能特異性分泌IL-17介導(dǎo)機(jī)體炎性反應(yīng)，可能與炎性反應(yīng)相關(guān)性腫瘤形成有關(guān)[7]。目前鮮見(jiàn)外周血Bcl-2、miR-451和Th17細(xì)胞在食管癌患者中表達(dá)的相關(guān)研究，本研究旨在為臨床完善診斷機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年10月—2018年10月河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院收治的101例食管癌患者作為研究組，另選取95例健康體檢者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理初次確診，未經(jīng)任何免疫治療、抗腫瘤治療；健康體檢者經(jīng)查體無(wú)器質(zhì)性病變疾病，健康狀態(tài)良好；所有患者的簽署知情研究同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性食管癌患者；存在免疫系統(tǒng)疾病者；伴感染性疾病者。研究組男62例，女39例，年齡38～75歲，平均61.89±5.26歲，體質(zhì)量指數(shù)18～24 kg/m2，平均20.96±1.13 kg/m2；對(duì)照組男58例，女37例，年齡39～76歲，平均62.16±5.08歲，體質(zhì)量指數(shù)18～24 kg/m2，平均21.03±1.08 kg/m2。兩組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)基礎(chǔ)資料均衡可比（均P＞0.05）。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 方法

檢測(cè)方法：（1）Th17細(xì)胞檢測(cè)：乙二胺四乙酸抗凝管取靜脈血2 ml，全自動(dòng)流式細(xì)胞儀（貝克曼庫(kù)爾特，CytoFLEX型）檢測(cè)Th17細(xì)胞水平；（2）Bcl-2檢測(cè)：非抗凝管取靜脈血2 ml，離心15 min（半徑8 cm，轉(zhuǎn)速3 500 r/min）取上清液，Bcl-2酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒（上海滬震生物科技有限公司）檢測(cè)Bcl-2水平；（3）miR-451檢測(cè)：取上清液，熒光測(cè)量法試劑盒提取RNA，脫洗后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成目的基因，采取熒光測(cè)量法檢測(cè)miR-451水平。

治療方法：根據(jù)不同患者食管癌分期、侵犯程度選取不同的治療方法，包括食管癌根治術(shù)、食管癌根治術(shù)聯(lián)合放化療治療或單純放化療治療。

隨訪方法：隨訪1年，患者自治療周期結(jié)束開(kāi)始隨訪計(jì)時(shí)1年隨訪終止，采用電話或門診形式進(jìn)行隨訪。研究組失訪5例，18例復(fù)發(fā)，78例未復(fù)發(fā)。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）對(duì)比兩組外周血Bcl-2、miR-451和Th17細(xì)胞水平；（2）對(duì)比研究組不同臨床病理特征患者外周血Bcl-2、miR-451和Th17水平；（3）Pearson相關(guān)性系數(shù)分析分化程度、臨床分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與外周血Bcl-2、miR-451、Th17細(xì)胞水平相關(guān)性；（4）受試者工作特征（ROC）曲線分析外周血Bcl-2、miR-451、Th17細(xì)胞水平單一或聯(lián)合診斷食管癌的價(jià)值；（5）隨訪1年，對(duì)比復(fù)發(fā)、未復(fù)發(fā)患者外周血Bcl-2、miR-451、Th17細(xì)胞水平；（6）ROC曲線分析外周血Bcl-2、miR-451、Th17細(xì)胞單一或聯(lián)合預(yù)測(cè)食管癌復(fù)發(fā)的價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。Pearson相關(guān)性系數(shù)分析相關(guān)性；ROC曲線分析診斷及預(yù)測(cè)價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血指標(biāo)水平

研究組外周血Bcl-2、miR-451、Th17細(xì)胞水平高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組各外周血指標(biāo)水平 ()Table 1 Peripheral blood index levels of two groups ()

表1 兩組各外周血指標(biāo)水平 ()Table 1 Peripheral blood index levels of two groups ()

2.2 研究組不同臨床病理特征與外周血指標(biāo)水平的關(guān)系

隨分化程度降低、臨床分期升高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑增加外周血Bcl-2、miR-451、Th17細(xì)胞水平呈升高趨勢(shì)（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3 研究組不同臨床病理特征與外周血指標(biāo)水平相關(guān)性分析

研究組患者分化程度、臨床分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與外周血Bcl-2、miR-451、Th17細(xì)胞水平呈正相關(guān)（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.4 各外周血指標(biāo)單一或聯(lián)合診斷食管癌的價(jià)值

ROC曲線分析得到，外周血Bcl-2、miR-451、Th17細(xì)胞聯(lián)合診斷食管癌的AUC值最大，為0.850（95%CI:0.792～0.897），敏感度及特異性分別為73.27%、90.53%；其次為Th17細(xì)胞，AUC為0.803（95%CI:0.741～0.857），當(dāng)臨界值＞3.63%時(shí)，敏感度及特異性分別為59.41%、88.42%；Bcl-2的AUC為0.792（95%CI:0.729～0.847），當(dāng)臨界值＞6.40 ng/ml時(shí)，敏感度及特異性分別為57.43%、55.79%；miR-451的AUC為0.717（95%CI:0.649～0.779），當(dāng)臨界值＞1.17時(shí)，敏感度及特異性分別為78.22%、55.79%，見(jiàn)圖1。

2.5 復(fù)發(fā)及未復(fù)發(fā)患者各外周血指標(biāo)水平

復(fù)發(fā)患者外周血Bcl-2、miR-451、Th17細(xì)胞水平高于未復(fù)發(fā)患者（均P＜0.05），見(jiàn)表4。

2.6 各外周血指標(biāo)與復(fù)發(fā)關(guān)系

控制分化程度、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等其他因素后，外周血Bcl-2、miR-451、Th17細(xì)胞水平與復(fù)發(fā)顯著相關(guān)（均P＜0.05），見(jiàn)表5。

圖1 各外周血指標(biāo)單一(A)及聯(lián)合(B)診斷食管癌的價(jià)值Figure 1 Value of each peripheral blood index for single(A) and combined(B) diagnoses of esophageal cancer

表2 研究組不同臨床病理特征與外周血指標(biāo)水平的關(guān)系 ()Table 2 Relation between different clinicopathological characteristics and peripheral blood index levels in experimental group ()

表2 研究組不同臨床病理特征與外周血指標(biāo)水平的關(guān)系 ()Table 2 Relation between different clinicopathological characteristics and peripheral blood index levels in experimental group ()

表3 研究組不同臨床病理特征與外周血指標(biāo)水平相關(guān)性分析Table 3 Correlation of different clinicopathological characteristics and peripheral blood index levels in experimental group

表4 復(fù)發(fā)及未復(fù)發(fā)患者各外周血指標(biāo)水平 ()Table 4 Peripheral blood index levels of relapsed and nonrelapsed patients ()

表4 復(fù)發(fā)及未復(fù)發(fā)患者各外周血指標(biāo)水平 ()Table 4 Peripheral blood index levels of relapsed and nonrelapsed patients ()

表5 各外周血指標(biāo)與復(fù)發(fā)關(guān)系Table 5 Relation between peripheral blood parameters and recurrence

3 討論

食管癌屬我國(guó)多發(fā)惡性腫瘤之一，早期隱匿性強(qiáng)，多數(shù)患者確診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，喪失最佳根治時(shí)機(jī)[8]。從細(xì)胞分子生物學(xué)層面加強(qiáng)食管癌早期篩查、診斷機(jī)制對(duì)臨床具有重要意義。

miR-451是外周血中小分子非編碼RNA，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞凋亡過(guò)程。病理研究顯示，miR-451結(jié)合靶信使RNA后可控制、影響mRNA翻譯過(guò)程，繼而加快機(jī)體健康細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)癌性因子釋放，同時(shí)還參與惡性腫瘤生物學(xué)行為及耐藥基因調(diào)控[9]。本研究顯示，研究組外周血miR-451水平高于對(duì)照組，提示外周血miR-451水平升高可能與食管癌發(fā)病、發(fā)展有關(guān)。但榮忠厚等[10]檢測(cè)107例胃癌組織中miR-451表達(dá)，發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)miR-451表達(dá)下調(diào)患者生存時(shí)間較上調(diào)患者顯著縮短。本研究結(jié)論與此不一致，分析可能是因檢測(cè)靶部位不同，miR-451主要介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程，隨細(xì)胞凋亡、裂解會(huì)釋放入血，而在外周血中miR-451能逃避RNA酶降解而長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在，并隨凋亡細(xì)胞增多呈升高趨勢(shì)。陳志平等[11]報(bào)道中也表明，miR-451在結(jié)腸癌患者外周血中呈高表達(dá)，診斷早期原位結(jié)腸癌的陽(yáng)性率為88%。進(jìn)一步ROC曲線分析顯示，外周血miR-451診斷食管癌的敏感度為78.22%，特異性為55.79%，提示其可為臨床診斷提供一定參考依據(jù)。

Bcl-2是當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)與凋亡密切相關(guān)的原癌基因之一，阻滯細(xì)胞凋亡的作用主要體現(xiàn)在延長(zhǎng)細(xì)胞生存期，而非刺激細(xì)胞增殖。目前研究已證實(shí)，在多種惡性組織內(nèi)Bcl-2過(guò)表達(dá)，采取Bcl-2小分子抑制劑可提高腫瘤細(xì)胞放療敏感度，其機(jī)制是阻斷Bcl-2所參與線粒體途徑細(xì)胞凋亡過(guò)程而提高放療效果[12]。有研究顯示，胃癌組織Bcl-2陰性表達(dá)患者經(jīng)放化療完全緩解率較高[13]。本研究顯示，研究組外周血Bcl-2水平高于對(duì)照組，提示外周血Bcl-2可能參與食管癌發(fā)病過(guò)程。有研究采用三維適形精確放射治療50例食管癌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外周血Bcl-2水平與療效無(wú)相關(guān)性，得出結(jié)論外周血Bcl-2可能與食管癌發(fā)病發(fā)展無(wú)密切關(guān)系[14]。進(jìn)一步對(duì)比發(fā)現(xiàn)，隨分化程度降低、臨床分期升高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑增加外周血Bcl-2水平呈升高趨勢(shì)，Pearson相關(guān)性系數(shù)分析，外周血Bcl-2水平與分化程度、臨床分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.05），證實(shí)外周血Bcl-2水平與食管癌患者發(fā)病發(fā)展關(guān)系密切。與上述研究結(jié)論不一致，可能是因其例數(shù)較少，缺乏代表性，本研究進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量可客觀反映不同患者Bcl-2表達(dá)的差異。

Th17細(xì)胞是近年腫瘤免疫層面研究的熱點(diǎn)方向。研究證實(shí)，Th17細(xì)胞及其效應(yīng)因子IL-17能促進(jìn)腫瘤病理進(jìn)展，導(dǎo)致患者生存期縮短，預(yù)后較差[15-16]。有研究報(bào)道了Th17細(xì)胞在惡性腫瘤中的特征及表現(xiàn)，進(jìn)展期黑色素瘤鼠模型中Th17表現(xiàn)高水平，除病灶引流淋巴結(jié)外，在骨髓、脾臟、外周血中Th17細(xì)胞占比顯著升高[17]。進(jìn)一步研究證實(shí)，在人體惡性腫瘤內(nèi)Th17分布與鼠模型一致[18]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，食管癌患者外周血Th17細(xì)胞水平顯著升高，且隨分化程度降低、臨床分期升高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑增加其水平呈升高趨勢(shì)。分析原因可能是：（1）食管癌微環(huán)境內(nèi)惡性細(xì)胞可分泌促Th17細(xì)胞增殖必需因子，促進(jìn)Th17細(xì)胞增殖、分化；（2）惡性細(xì)胞所分泌CCL20趨化因子可特異性結(jié)合Th17細(xì)胞表面受體CCR6，刺激Th17細(xì)胞在病灶局部增殖，并致外周血Th17細(xì)胞水平升高。相關(guān)性分析顯示，外周血Th17細(xì)胞水平與食管癌分化程度、臨床分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，證實(shí)外周血Th17細(xì)胞與食管癌發(fā)病發(fā)展關(guān)系密切，可為臨床診斷提供參考依據(jù)。

此外，食管癌患者預(yù)后5年生存率較低，其預(yù)后評(píng)價(jià)亦是臨床重點(diǎn)內(nèi)容之一，本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)患者外周血Bcl-2、miR-451、Th17細(xì)胞水平高于未復(fù)發(fā)患者，且在控制分化程度、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等其他因素后，外周血Bcl-2、miR-451、Th17細(xì)胞水平仍與復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，說(shuō)明外周血Bcl-2、miR-451、Th17細(xì)胞異常表達(dá)可能是預(yù)后復(fù)發(fā)率高的主要原因之一，可能與三者均具有介導(dǎo)健康細(xì)胞凋亡、促進(jìn)惡性組織生長(zhǎng)、降低惡性細(xì)胞分化能力等原因有關(guān)。

綜上，食管癌患者存在外周血B c l-2、miR-451、Th17細(xì)胞水平異常表達(dá)情況，且表達(dá)水平與分化程度、臨床分期及復(fù)發(fā)等關(guān)系密切，聯(lián)合檢測(cè)可為臨床診斷、預(yù)后評(píng)估提供客觀依據(jù)，以便臨床針對(duì)性制定治療方案。