劉姍, 孫蓉, 高靜雷

三角梅基因的克隆和光照對(duì)其表達(dá)的影響

劉姍, 孫蓉, 高靜雷

(攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，干熱河谷特色生物資源開(kāi)發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 攀枝花 617000)

為了解光照對(duì)三角梅()葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的影響，從其苞片中克隆了環(huán)多巴5-糖基轉(zhuǎn)移酶基因()。結(jié)果表明，三角梅基因的cDNA全長(zhǎng)為1 446 bp，編碼482個(gè)氨基酸，生物信息學(xué)分析表明cDOPA 5GT蛋白的等電點(diǎn)(PI)為5.77，具有糖基轉(zhuǎn)移酶的特征基序，為酸性親水跨膜蛋白，不含信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)以-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，氨基酸序列保守性較差。qRT-PCR分析表明，遮光處理基因表達(dá)量和植株的甜菜紅素含量均顯著下降。這表明三角梅的色素合成受糖基轉(zhuǎn)移酶基因調(diào)控，并與光照呈正相關(guān)關(guān)系。

三角梅；葡糖基轉(zhuǎn)移酶；基因表達(dá)；光照

三角梅()是紫茉莉科(Nyctaginaceae)三角梅屬植物, 為常綠攀援狀灌木,原產(chǎn)于南美洲的巴西、秘魯?shù)葒?guó)，因其發(fā)現(xiàn)者法國(guó)探險(xiǎn)家、植物學(xué)家Louis-antoine de Bougainville而得名，意思為“寶巾”[1]。三角梅屬中只有葉子花()、三角梅和秘魯三角梅()具有觀賞價(jià)值[2–3]。三角梅喜光不耐寒，主要觀賞部位是苞片，色素通過(guò)甜菜色素途徑合成, 主要為甜菜紅素和甜菜黃素，并通過(guò)兩種色素間相對(duì)含量的轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)對(duì)花色的調(diào)節(jié)，使苞片呈現(xiàn)不同顏色[4–5]。

甜菜色素途徑的起始物是酪氨酸，中間產(chǎn)物多巴在不同酶的催化下分別合成環(huán)狀多巴和甜菜醛氨酸，兩者再自發(fā)形成甜菜紅素，與甜菜黃素的積累不在同一個(gè)分支。葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferases, GTs)是甜菜色素代謝過(guò)程中重要的關(guān)鍵酶，該途徑涉及的糖基轉(zhuǎn)移酶分為2類(lèi)：5-、6-糖基轉(zhuǎn)移酶和環(huán)多巴5-糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclo-DOPA-5-glucosyltrans- ferase, cDOPA 5GT)，其中環(huán)多巴糖苷在合成末端把糖基轉(zhuǎn)移至甜菜苷配基上[6–7]，產(chǎn)物在甜菜紅素的總含量中占比較大，該過(guò)程可以是環(huán)狀多巴先被cDOPA 5GT催化形成環(huán)多巴葡萄糖，再與甜菜醛氨酸結(jié)合，也可以是環(huán)狀多巴先結(jié)合甜菜醛氨酸，再催化連接糖基形成甜菜苷。三角梅的優(yōu)勢(shì)色素是甜菜紅素，在苞片表皮和對(duì)紫外線較為敏感的組織中積累[8–9]，其積累量與葡糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量相關(guān)。葡糖基轉(zhuǎn)移酶目前已在植物類(lèi)黃酮生物合成中被大量鑒別，但在甜菜色素代謝途徑的生物合成中還較少報(bào)道，本研究對(duì)三角梅的基因進(jìn)行了同源克隆，并對(duì)cDOPA 5GT蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，同時(shí)對(duì)三角梅基因的表達(dá)和甜菜紅素的積累進(jìn)行了分析，初步探討了甜菜紅素的積累與光照的相關(guān)性，為研究三角梅甜菜紅素的生物合成提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)用三角梅()購(gòu)買(mǎi)后于實(shí)驗(yàn)室中培育，由同一母本扦插批量培養(yǎng)。挑選花期花蕾數(shù)量較多且生長(zhǎng)一致的三角梅植株，在花芽發(fā)育初期，將植株分成二組，一組正常日照(對(duì)照)，另一組用黑色塑料膜包裹進(jìn)行遮光處理(試驗(yàn)組)。2周后，選取大小和形態(tài)一致的苞片作為試驗(yàn)材料。

1.2 cDOPA 5GT基因的克隆

按照柱式植物RNAout 2.0試劑盒說(shuō)明書(shū)提取三角梅花期苞片總RNA[10]。按照Thermo公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)NCBI中植物基因同源比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物GUTBDS (5?-CGGGGT- ACCATGGAGTATAACTCAGAAACAGAGCACA-3?,引入I酶切位點(diǎn))和UGTBDX (5?-CCGCTCGA- GTCATTTATCCTTACTCGTTTTAGCTGAG-3?，引入I酶切位點(diǎn))，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板擴(kuò)增三角梅苞片基因，反應(yīng)體系總體積為30L，包含Max DNA Polymerase 15L、cDNA 1L、UDPBDS和UDPBDX引物各0.5L和ddH2O 13L,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段在末端添加多聚A尾，連接pMD19-T載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5感受態(tài)中，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序，將序列命名為。

1.3 生物信息學(xué)分析

采用BLAST P軟件(https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)進(jìn)行氨基酸同源序列比對(duì)分析；采用ProtParam軟件(http://expasy.org/tools/protparam/html)進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析；采用PSIPRED軟件 (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；采用SWISS MODEL軟件(https://swissmodel. expasy.org/interactive)進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè); 采用Signal P 4.1軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；采用TMHMM軟件(http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

根據(jù)全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)1對(duì)熒光定量引物cDOPA 5GTqS和cDOPA 5GTqX，以18S rRNA基因作為內(nèi)參[11]，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析遮光處理對(duì)基因表達(dá)量的影響。PCR反應(yīng)體系總體積為15L，包含SYBR Premix ExII 7.5L、cDNA 1.0L、引物各0.5L和ddH2O 5.5L，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 3 min，95℃ 10 s, 64.5℃(cDOPA 5GT)/55.7℃(18s rRNA) 30 s, 72℃ 40 s, 72℃ 10 min, 共39次循環(huán)。

1.5 甜菜紅素含量的測(cè)定

甜菜紅素含量的測(cè)定采用改進(jìn)的Stintzing等[12]方法，稱(chēng)取0.15 g三角梅苞片干粉于預(yù)冷的研缽中，加入預(yù)冷的甲醇2 mL研磨，全部轉(zhuǎn)入10 mL離心管中；置于4℃冰箱中30 min；然后在16 099.2×下離心10 min并收集沉淀，加入4 mL ddH2O重懸沉淀，置于4℃冰箱中30 min；在16 099.2×下離心10 min后收集上清液；重復(fù)操作1次，合并上清液用ddH2O定容至10 mL，在波長(zhǎng)536 nm處測(cè)定吸光值，甜菜紅素含量(, mg/g)=(×M××1000)/ (×)[6,13]，式中,為536 nm下的吸光度, M為甜菜紅素的相對(duì)摩爾質(zhì)量(550.47 g/mol)，為溶液的總體積(L)，為甜菜紅素的摩爾消光系數(shù)[5.66× 104L/(mol·cm)]，為樣品質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果和分析

2.1 cDOPA 5GT基因的克隆

以三角梅苞片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 獲得了一條長(zhǎng)為1 446 bp的片段(圖1)，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期吻合。經(jīng)Blast P序列比對(duì)分析表明該片段序列與葉子花葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因的相似度高達(dá)99%，命名為，GeneBank登錄號(hào)為MT239387。

圖1 cDOPA 5GT基因的PCR擴(kuò)增。M: DNA Marker; U: cDOPA 5GT。

2.2 cDOPA 5GT的生物信息學(xué)分析

理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)基因編碼482個(gè)氨基酸，BLAST分析表明cDOPA 5GT氨基酸序列的保守性相對(duì)較差，與同科植物紫茉莉(，登錄號(hào)BAD91803.1)的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列相似度為65%，而與奎奴亞藜(,登錄號(hào)XP021748306.1)和馬齒莧(,登錄號(hào)XP021847933.1)的相似度為63%和62%。cDOPA 5GT的相對(duì)分子質(zhì)量為54.66 kD，蛋白等電點(diǎn)(PI)為5.77，為酸性穩(wěn)定親水性蛋白，推測(cè)的分子式為C2463H3779N655O712S22;同時(shí)，該蛋白中含有22種氨基酸，其中47個(gè)帶正電荷，61個(gè)帶負(fù)電荷，含量較多的為亮氨酸(Leu,10%), 而酪氨酸(Tyr)和半胱氨酸(Cys)較少，僅為1.7%和1%。利用PSIPRED預(yù)測(cè)cDOPA 5GT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，還有一定量的折疊結(jié)構(gòu)。應(yīng)用SWISS MODEL預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖2。采用在線工具Signal P4.1分析結(jié)果表明，cDOPA 5GT蛋白不具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu); TMHMM預(yù)測(cè)cDOPA 5GT蛋白可能為跨膜蛋白。

圖2 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

序列分析 通過(guò)BLAST P比對(duì)，cDOPA 5GT蛋白存在1個(gè)Glycosyltransferase-GTB-type超家族成員PLN02863結(jié)構(gòu)區(qū)域(圖3)。不同植物基因編碼的氨基酸序列差異很大，保守性較差。三角梅cDOPA 5GT的C-端具有UGTs家族的44個(gè)氨基酸高度保守序列PSPG (圖4)，說(shuō)明三角梅基因編碼的蛋白是可溶性的酶，葡糖基結(jié)合位點(diǎn)可能是WGPQLEILNHESTGGFLSHCGWNSVLE SLREGVPILGWPLAAEQ。

將cDOPA5GT蛋白的氨基酸序列與NCBI上已知的其他植物UTGs蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，三角梅cDOPA 5GT蛋白與紫茉莉(, 登錄號(hào)AB182643.1)、甜菜(subsp., 登錄號(hào)XP010681653.1)的親緣關(guān)系較近，而與擬南芥(, 登錄號(hào)AF196777.1)、菊花(, 登錄號(hào)MN364678.1)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖5)。

圖3 BLAST P序列比對(duì)結(jié)果

圖4 cDOPA 5GT氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。At: 擬南芥; Atcd: 莧菜; Bg: 三角梅; Bv: 甜菜; Cc: 雞冠花; Vv: 葡萄。

2.3 cDOPA 5GT的表達(dá)和甜菜紅素積累量的相關(guān)性

熒光定量分析結(jié)果表明(圖6)，遮光處理后,基因表達(dá)量明顯下降(<0.01)，而且遮光處理的三角梅甜菜紅素含量也下降(<0.01)。這表明三角梅苞片中的基因表達(dá)受光照的調(diào)節(jié)，其表達(dá)量和甜菜紅素含量的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.9998，呈極顯著正相關(guān)，表明基因在其甜菜紅素合成通路中作用重要。

3 結(jié)論和討論

糖基化反應(yīng)是植物體內(nèi)重要的次生代謝反應(yīng),糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase)催化特定位點(diǎn)的糖基化反應(yīng)合成糖苷。GTs被分為99個(gè)家族[14]，其中以尿嘧啶核糖基轉(zhuǎn)移酶苷二磷酸-葡萄糖(UDP-sugar)為供體的UGTs屬于家族1，是植物主要的糖基轉(zhuǎn)移酶。本研究獲得的糖基轉(zhuǎn)移酶在C-末端含有該家族特有的植物次生產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶(PSPG)基序，因此推測(cè)cDOPA 5GT蛋白屬于UGT-1家族。UGT表達(dá)量的提高能夠促進(jìn)重要次生代謝產(chǎn)物的合成，在大腸桿菌BL21中表達(dá)紅景天()的基因，獲得了8種酚苷類(lèi)天然產(chǎn)物[15]; 擬南芥() UGT的異位表達(dá)提高了花青素和原花青素的含量，并賦予擬南芥較高的耐光性[16]。糖基轉(zhuǎn)移酶是分歧較多的多源基因家族，目前的研究表明UGTs與糖基受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域沒(méi)有顯著保守性，尚未有某個(gè)特定的氨基酸可以決定UGTs的酶學(xué)特征，盡管已有研究表明甜菜色素積累與糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄量正相關(guān)[17–19]，但三角梅植物的基因組序列尚未公布，其還有待深入研究。

圖5 基于UTGs氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖6 cDOPA 5GT的相對(duì)表達(dá)量(■)和甜菜紅素含量(□)。**: P<0.01。

甜菜紅素在多數(shù)石竹目植物中替代花青素使植物產(chǎn)生艷麗的顏色，目前尚未發(fā)現(xiàn)同一種植物同時(shí)存在這兩種色素，但有報(bào)道表明參與兩種色素途徑的酶和轉(zhuǎn)錄因子可以在不含此色素的植物中相互表達(dá)[20–22]，可能是甜菜紅素和花青素具有相同的進(jìn)化起源，合成途徑相類(lèi)似[7,23]。甜菜紅素合成受多種因素的影響，其中光對(duì)色素的累積影響較大[24], 而藍(lán)光比紅光更有利于甜菜紅色素的積累[25]。本研究結(jié)果表明，遮光會(huì)影響糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá),相對(duì)表達(dá)量降低了38.3%，同時(shí)甜菜紅素的合成也降低36.3%，這表明光照與三角梅色素合成呈極顯著相關(guān)。本試驗(yàn)是自然光照培養(yǎng)植物，雖然有報(bào)道探討了光質(zhì)、光強(qiáng)對(duì)甜菜紅素合成的影響，但光改變后上游代謝物的流向未見(jiàn)報(bào)道研究，同時(shí)遮光并非必然降低基因表達(dá)量，在適當(dāng)?shù)恼诠饴氏拢P(guān)鍵酶基因的表達(dá)量可能還比全光照高，如30%的遮陰處理，珠子參(var.)皂苷合成關(guān)鍵酶的表達(dá)量和皂苷的積累都得到提升[26]，可能光照率對(duì)不同關(guān)鍵酶的活性影響不一樣，造成目標(biāo)代謝物合成受多因素影響，因此在三角梅甜菜色素合成的光照條件上還需要進(jìn)一步摸索。對(duì)于三角梅而言，艷麗的色彩中缺少了藍(lán)色系，而藍(lán)色是甜菜紅色素途徑不產(chǎn)生的下游產(chǎn)物，顯示藍(lán)色的是黃酮類(lèi)化合物，為花青素代謝途徑，而有研究表明花青素代謝途徑和甜菜色素代謝途徑有相同的起源，結(jié)合本研究結(jié)果，甜菜紅色素代謝重要關(guān)鍵酶之一的糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)和甜菜紅素含量成正相關(guān)關(guān)系，那么今后是否可以利用基因工程手段將編碼類(lèi)黃酮-3?5?-羥化酶(F3?,5?H)的基因引入下調(diào)某些甜菜色素途徑關(guān)鍵酶基因，從而達(dá)到內(nèi)源表達(dá)花青素代謝途徑的下游產(chǎn)物，促使花色素苷的合成轉(zhuǎn)向翠雀素糖苷的合成方向[27]，使三角梅苞片顏色更豐富,是未來(lái)值得深入探討的課題。

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Cloning of Cyclo-DOPA-5-glucosyltransferase Gene fromand Effect of Illumination on Its Expression

LIU Shan, SUN Rong, GAO Jing-lei

(Key Laboratory of Dry-hot Valley Characteristic Bio-Resources Development at University of Sichuan Province, Department of Biological and Chemical Engineering, Panzhihua University,Panzhihua 617000, Sichuan, China)

In order to understand the effect of illumination on the expression of glucosyltransferase gene in, the cyclo-DOPA-5-glucosyltransferase gene () was cloned from bracts. The results showed that the full length cDNA ofwas 1 446 bp, encoding 482 amino acids. The bioin- formatics analysis showed that isoelectric point of cDOPA 5GT was 5.77, showing an acidic and hydrophilic transmembrane protein without signal peptide. The cDOPA 5GT protein had characteristic motifs of glucosyl- transferase, and the secondary structure was dominant of α-helices and random coils, and the amino acid sequence was less conserved. The results of qRT-PCR and spectrophotometry showed that the expression ofgene and betacyanin accumulation in plants decreased significantly under shading by qRT-PCR and spectro- photometry. Therefore, it was suggested that the synthesis of betacyanin was regulated by glucosyltransferase gene, and positively correlated with light time.

; Cyclo-DOPA-5-glucosyltransferase; Gene expression; Illumination

10.11926/jtsb.4233

2020–04–10

2020–06–10

四川省國(guó)際科技合作項(xiàng)目(2019YFH0136)資助

This work was supported by the Cooperation Project of International Science and Technology in Sichuan (Grant No. 2019YFH0136).

劉姍(1980~ )，女，博士，副教授，從事植物生物技術(shù)研究。E-mail: liushan@pzhu.edu.cn