董樺,杜書浩,榮兵
天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,天津300193
滑膜炎是滑膜組織因急性創(chuàng)傷或慢性勞損等刺激導(dǎo)致的一種非感染性炎癥,臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)局部疼痛、腫脹,活動能力受限,嚴(yán)重影響患者的生活[1]。滑膜炎的發(fā)生與關(guān)節(jié)炎癥因子的表達(dá)密切相關(guān),腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素6(IL-6)作為促炎因子,能促使炎癥發(fā)生,加重患者關(guān)節(jié)功能障礙[2]。同時炎癥使體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡,導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生。Nod 樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體能夠調(diào)節(jié)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)活化,誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥,是各種炎癥性疾病治療的靶點。在膝骨關(guān)節(jié)炎組織中,NLRP3、Caspase-1 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著降低[3]。另外,阻斷NLRP3/Caspase-1 通路可下調(diào)Caspase-1、IL-1、IL-18蛋白表達(dá),減輕呼吸道炎癥[4]。仙方活命飲出自《校注婦人良方》,具有清熱解毒、消腫潰堅、活血止痛的功效,常用于膿皰瘡、癤腫、蜂窩組織炎、乳腺炎、化膿性扁桃體炎等屬熱毒實證者。研究顯示,仙方活命飲口服結(jié)合關(guān)節(jié)鏡下清理術(shù)可明顯縮短化膿性膝關(guān)節(jié)炎的治療療程[3]。但其對NLRP3/Caspase-1 通路及關(guān)節(jié)炎癥因子表達(dá)影響的研究未見報道。我們于2020年6月—2020年8月通過皮下注射脂多糖(LPS)法建立大鼠背部氣囊滑膜炎模型,觀察仙方活命飲對滑膜炎大鼠炎癥和氧化應(yīng)激水平的影響,并探討其與NLRP3/Caspase-1 通路的關(guān)系。
1.1 材料
1.1.1 動物 清潔級健康SD 大鼠95 只,雄雄各半,體質(zhì)量180~220 g,購自山東大學(xué)實驗動物中心。符合國家實驗室動物倫理保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法律規(guī)定,按照3R 原則給予實驗動物人道的關(guān)懷照顧。飼養(yǎng)條件:溫度22 ℃,濕度55%,12 h/12 h 光暗循環(huán)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。
1.1.2 仙方活命飲藥液 藥材飲片來自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。取白芷3 g、貝母6 g、防風(fēng)6 g、當(dāng)歸尾6 g、甘草節(jié)6 g、皂角刺(炒)6 g、穿山甲(炙)6 g、天花粉6 g、乳香6 g、沒藥6 g、金銀花9 g、陳皮9 g混合,常規(guī)方法煎煮,于恒溫水浴鍋中濃縮至含生藥2 g/mL。按照人和大鼠體表面積換算給藥劑量,則其低、中、高劑量分別對應(yīng)生藥含量4.6、9.2、18.4 g/kg。將藥液置于-20 ℃保存,給藥前復(fù)溫。
1.1.3 試劑與儀器 吲哚美辛片(每片25 mg)購自臨汾奇林藥業(yè)有限公司,使用蒸餾水配置,現(xiàn)配現(xiàn)用。LPS 購自北京百奧萊博科技有限公司,使用無菌平衡鹽溶液配制成10 mg/mL 溶液,4 ℃保存?zhèn)溆谩1∕DA)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、TNF-α、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;蘇木精—伊紅(HE)染液購自北京四正柏生物科技有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)和β-actin鼠抗均購自美國Sigma 公司;蛋白提取試劑盒、ECL顯色試劑盒和BCA 蛋白定量試劑盒均購自北京中山金橋生物科技有限公司;TNF-α、IL-6、NLRP3 和Caspase-1 鼠抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗均購自美國Abcam 公司;Fax-20100型酶標(biāo)儀購自美國INStat 公司;尼康SMZ745 型光學(xué)顯微鏡購自上海普赫生物科技有限公司;ChemiDoc-MP 全能型凝膠成像分析儀購自美國Bio-Rad公司。
1.2 滑膜炎動物模型制備 80 只大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉,背部朝上固定于手術(shù)臺,用8%硫化鈉溶液脫去背部被毛備用。用鑷子挑起背部肩胛正中區(qū)皮膚,皮下注射20 mL 無菌空氣(0.22 μm 微孔濾膜過濾針筒內(nèi)空氣)形成氣囊;第3 天再次注射10 mL 無菌空氣,以維持氣囊,第6 天注射10 mL 無菌空氣后,接著向氣囊中注射LPS 20 μg/kg,待背部氣囊皮膚出現(xiàn)紅腫且大鼠出現(xiàn)瘙癢不安、撓耳舔足癥狀,證明造模成功[6]。另取15只大鼠作為對照組,按上述方法制備氣囊,于實驗第6天向氣囊中注射等體積無菌平衡鹽溶液。
1.3 動物分組與干預(yù) 將造模成功的75 只大鼠使用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、吲哚美辛組、低、中、高劑量仙方活命飲組,每組各15 只,另取15 只正常大鼠作為對照組。吲哚美辛組給予5 mg/kg 吲哚美辛10 mL/kg 灌胃,低、中、高劑量仙方活命飲組分別給予含生藥4.6、9.2、18.4 g/kg 的仙方活命飲藥液10 mL/kg 灌胃,對照組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃,于造模完成后,每天給藥1次,連續(xù)7 d。
1.4 標(biāo)本采集 各組最后一次給藥24 h后,腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg 麻醉處死,股動脈取血,-80 ℃冰箱保存待用。將大鼠背部朝上固定于手術(shù)臺上,切開背部氣囊皮膚,用4 mL 無鈣鎂Hank"s 液灌洗氣囊,收集灌洗液,4 ℃冰箱保存待用。切取背部滑膜組織,每組取5 份滑膜組織放入4%多聚甲醛固定,用于HE 染色;其余滑膜組織放入凍存管中-80 ℃保存,用于Western blotting檢測。
1.5 氣囊滲出液量測算和灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量檢測 收集氣囊灌洗液于10 mL 帶刻度的試管中,準(zhǔn)確記錄灌洗液量,滲出液量=灌洗液量-4 mL。然后用移液器吸取0.02 mL 灌洗液,加入3%冰醋酸0.38 mL,生物顯微鏡下計數(shù)白細(xì)胞。
1.6 氣囊灌洗液中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、CAT、SOD、GSH檢測 采用ELISA法。取氣囊灌洗液,3 000 r/min離心15 min(離心半徑15 cm),取上清。使用ELISA試劑盒檢測MDA、CAT、SOD、GSH含量,按照試劑盒說明書操作,使用酶標(biāo)儀讀取吸光度值,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各自含量。
1.7 氣囊灌洗液和血清中TNF-α、IL-6 水平檢測 采用ELISA 法。取股動脈血和氣囊灌洗液,以13 000 r/min 離心15 min,取上清。使用ELISA 試劑盒檢測TNF-α、IL-6水平,按照試劑盒說明書操作。
1.8 滑膜組織病理檢查 采用HE 染色。取滑膜組織,加入梯度乙醇逐級脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片機(jī)作約5 μm厚切片。HE染色,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。
1.9 滑膜組織中TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1 蛋白檢測 采用Western blotting 法。取滑膜組織,加入蛋白提取液提取總蛋白,使用BCA 試劑盒對蛋白進(jìn)行定量。取蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,脫脂牛奶封閉。分別加入一抗(稀釋比例為1∶2 000),4 ℃孵育過夜。加入含辣根過氧化物酶的二抗(稀釋比例為1∶5 000),室溫孵育2 h。使用ECL顯色試劑盒顯色,全能型凝膠成像分析系統(tǒng)分析灰度值。以β-actin 為參照,計算目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。
1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s 表示,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩間比較行SNK-q 檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 各組氣囊滲出液量和灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量比較 見表1。
表1 各組氣囊滲出液量和白細(xì)胞數(shù)量比較(±s)
表1 各組氣囊滲出液量和白細(xì)胞數(shù)量比較(±s)
注:與對照組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與仙方活命飲低劑量組相比,cP<0.05;與仙方活命飲中劑量組相比,dP<0.05。
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2.2 各組氣囊灌洗液中MDA、CAT、SOD、GSH 含量比較 見表2。
2.3 各組氣囊灌洗液和血清中TNF-α、IL-6 水平比較 見表3。
2.4 各組滑膜組織病理特征情況 對照組滑膜組織規(guī)則,幾乎無炎癥細(xì)胞浸潤;模型組滑膜細(xì)胞大量增生,滑膜組織紊亂并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤聚集,組織周邊可見缺損;吲哚美辛組滑膜組織細(xì)胞排列相對整齊,炎癥細(xì)胞浸潤較少;仙方活命飲低、中、高劑量組滑膜組織細(xì)胞排列逐漸整齊,炎癥細(xì)胞浸潤椎間減少,且高劑量組與吲哚美辛組相近。
2.5 各組滑膜組織中TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)比較 見表4。
表2 各組氣囊灌洗液中MDA、CAT、SOD、GSH含量比較(±s)
表2 各組氣囊灌洗液中MDA、CAT、SOD、GSH含量比較(±s)
注:與對照組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與仙方活命飲低劑量組相比,cP<0.05;與仙方活命飲中劑量組相比,dP<0.05。
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表3 各組氣囊灌洗液和血清中TNF-α、IL-6水平比較(ng/L,-x±s))
表4 各組滑膜組織中TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1蛋白相對表達(dá)量比較(±s)
表4 各組滑膜組織中TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1蛋白相對表達(dá)量比較(±s)
注:與對照組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與仙方活命飲低劑量組相比,cP<0.05;與仙方活命飲中劑量組相比,dP<0.05。
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滑膜炎不僅導(dǎo)致滑膜組織受損,引起分泌液失調(diào)形成積液,加大關(guān)節(jié)承受壓力;同時炎癥因子刺激軟骨,嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)的正常功能,給患者帶來痛苦。本研究結(jié)果顯示,滑膜炎大鼠滑膜組織嚴(yán)重增生、結(jié)構(gòu)紊亂并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤聚集,表明滑膜炎大鼠的滑膜組織存在嚴(yán)重?fù)p傷;氣囊灌洗液中SOD、GSH 含量顯著降低,滲出液量顯著升高,灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量、MDA、CAT 含量以及灌洗液和血清中TNF-α、IL-6 水平顯著升高,表明滑膜炎大鼠體內(nèi)炎癥因子水平嚴(yán)重增加,導(dǎo)致上述病理改變。
中醫(yī)認(rèn)為,滑膜炎的主要病機(jī)是氣血痹阻不通,筋脈關(guān)節(jié)失于濡養(yǎng)所致。抑制炎癥因子產(chǎn)生能夠改善動物模型中滑膜炎大鼠關(guān)節(jié)疼痛及炎癥反應(yīng)[7]。目前,采用中醫(yī)辨證治療滑膜炎已取得顯著成果。趙澤軍等[8]報道,板藍(lán)根可降低氣囊滑膜炎滲出液中MDA 含量,提高血清SOD 水平,進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng),減少中性粒細(xì)胞浸潤,降低TNF-α等促炎介質(zhì)水平,具有明顯的抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用。YANG 等[9]報道,白藜蘆醇可降低滑膜炎大鼠血清MDA 含量,提高SOD 活性,具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛和抗炎、抗氧化活性。方婷婷[10]報道,仙方活命飲加減輔助布洛芬口服液治療能提高小兒髖關(guān)節(jié)滑膜炎的臨床療效,降低髖關(guān)節(jié)疼痛評分。本研究結(jié)果顯示,與模型組相比,仙方活命飲低、中、高劑量組背部灌洗液中SOD 和GSH 含量依次升高,滑膜組織中炎癥細(xì)胞浸潤逐漸緩解;大鼠氣囊滲出液量、灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量、MDA、CAT 含量以及灌洗液和血清中TNF-α、IL-6 含量依次降低,提示仙方活命飲對滑膜炎大鼠有積極的治療作用。
NLRP3/Caspase-1通路是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵通路,NLRP3 抑制劑和Caspase-1 抑制劑均可降低促炎因子含量[11]。研究顯示,抑制NLRP3/Caspase-1 信號通路能夠抑制小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化應(yīng)激反應(yīng),改善缺血再灌注引起的心肌功能障礙[12];下調(diào)NLRP3 表達(dá)可顯著減弱異氟醚對NLRP3 炎癥小體的激活,減少細(xì)胞中IL-18、IL-1 分泌[13]。SUN 等[14]報道,異丙酚可通過NLRP3 炎癥小體直接誘導(dǎo)Caspase-1 依賴的巨噬細(xì)胞焦亡。WANG 等[15]報道,豆蔻素可通過抑制NLRP3 炎癥小體的激活,下調(diào)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸中IL-1β、TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1 水平,改善小鼠結(jié)腸炎。本研究結(jié)果顯示,與模型組相比,仙方活命飲低、中、高劑量組大鼠滑膜組織TNF-α、IL-6、NLRP3 和Caspase-1 蛋白表達(dá)量依次降低,呈劑量依賴性,提示仙方活命飲可能通過抑制NLRP3/Caspase-1 通路,降低炎癥因子TNF-α 和IL-6 表達(dá),緩解滑膜炎大鼠滑膜組織損傷,減少背部滲出液。
綜上所述,仙方活命飲可降低炎癥因子表達(dá),抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),緩解滑膜炎大鼠滑膜組織損傷,減少背部滲出液;其機(jī)制可能與抑制NLRP3/Caspase-1信號通路相關(guān),為臨床上使用仙方活命飲治療滑膜炎提供了理論依據(jù)。