周新桐 郭青青 陳 雪 李加納 王 瑞,*

GBS高密度遺傳連鎖圖譜定位甘藍型油菜粉色花性狀

周新桐1,2,**郭青青1,2,**陳 雪1,2李加納1,2王 瑞1,2,*

1西南大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學院, 重慶 400715;2西南大學農(nóng)學與生物科技學院/ 重慶市油菜工程技術研究中心, 重慶 400715

甘藍型油菜花瓣顏色是重要的觀賞性狀, 花瓣顏色的選育和改良已成為材料創(chuàng)制的主要研究方向。目前對甘藍型油菜粉色花性狀定位研究未見報道。本研究以甘藍型油菜純系黃花62和甘藍型油菜純系粉花77為親本構建雙單倍體(doubled haploid, DH)群體。利用簡化基因組測序技術(genotyping-by-sequencing, GBS)篩選出3253個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)標記, 構建了全長1766.06 cM甘藍型油菜連鎖圖譜, 標記間平均遺傳距離為0.54 cM; 使用WinQTL Cartographer復合區(qū)間作圖方法對粉色花性狀進行數(shù)量性狀座位(quantitative trait locus, QTL)定位, 檢測到位于A07和C03染色體上各1個QTL; 將定位區(qū)間內(nèi)基因與甘藍和白菜同源基因進行線性比對, 在這些區(qū)間中找到了一些存在于3個物種的同源基因; 對粉色花定位區(qū)間內(nèi)基因進行可變剪切分析發(fā)現(xiàn), 2個花色相關基因和在親本粉色花瓣中發(fā)生內(nèi)含子保留可變剪切。上述研究結果為甘藍型油菜粉色花相關基因精細定位和分子連鎖標記開發(fā)提供了更多線索。

甘藍型油菜; 粉色花性狀; 遺傳連鎖圖譜; QTL定位

油菜屬于十字花科(Cruciferace)蕓薹屬()植物, 在中國古代被稱為“蕓薹”, 是一種栽培歷史悠久、適應性強、用途廣、經(jīng)濟價值高的油料作物。油菜在世界油料作物生產(chǎn)中產(chǎn)量僅次于大豆, 居第2位, 是中國重要油料作物[1]。近幾年隨著油菜不同花色品種的示范與推廣, 帶動了鄉(xiāng)村觀光旅游, 促進了農(nóng)民增收。目前已知的油菜花色主要有金黃色、粉色、檸檬黃色、鮮黃色、乳黃色、土黃色、紅黃色、桃紅色、橘紅色、粉白色、粉紅色、乳白色、純白色、微紫絲白花以及黃白嵌合體等。因此, 構建花色分子育種策略和選育不同花色新品種尤為重要, 而對油菜花色性狀基因進行定位是最主要的研究內(nèi)容。

已有一些文獻對花色性狀基因做了定位研究。早期Chen等[2]利用白花芥藍與白菜雜交獲得甘藍型油菜白花品系“No 7076”發(fā)現(xiàn), 控制白花性狀基因位于C組染色體上。戚存扣等[3]也推測控制白花性狀基因位于C組染色體上。分子連鎖標記輔助選擇花色是選育花色新材料的重要技術手段, 同時也可以用來驗證花色性狀基因所在區(qū)間。董育紅等[4]利用集團分離分析法(bulked segregant analysis, BSA)發(fā)現(xiàn)與甘藍型油菜白花基因連鎖的隨機擴增多態(tài)性DNA (random amplified polymorphism DNA, RAPD)標記。通過RAPD標記又發(fā)現(xiàn)白花性狀基因與高芥酸性狀基因具有連鎖關系[5]。Huang等[6]證實1個擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)標記和2個簡單重復序列(simple sequence repeats, SSR)標記與甘藍型油菜白花基因連鎖。利用試驗獲得的6對AFLP引物擴增151個單株, 確定了離白花基因兩側最近的2個分子標記[7]。張豹[8]結合SSR技術和QTL分析, 將甘藍型油菜白花基因定位到了C03染色體上。之后又有研究將白花基因定位在了白菜參考基因組A02染色體約162 kb物理區(qū)間內(nèi)[9]?；诙鷾y序的BSA分析技術為質(zhì)量性狀或主效基因快速準確定位提供了強大工具。淡亞彬[10]推測桔紅花基因HS1位于甘藍型油菜A9連鎖群上, 而Yao等[11]用BSA重測序方法將桔紅花基因精細定位在甘藍型油菜C09染色體151 kb區(qū)間。利用BSA和全基因組重測序技術, 甘藍型油菜橙花性狀隱性基因定位到A09染色體41.5 kb區(qū)間[12]; 桔黃花性狀基因定位在C09染色體區(qū)域[13], 并獲得了2個連鎖的分子標記BnaC09_19和BnaC09_34; 白花性狀基因定位在C03染色體52 Mb~55 Mb區(qū)間[14], 在此區(qū)間760 kb范圍內(nèi)篩選出6個與白花性狀基因緊密連鎖共分離的SSR標記。盡管甘藍型油菜花色定位研究較多, 但對于粉色花性狀相關基因定位還未見研究報道。

隨著高通量測序技術的發(fā)展, 測序方法不斷更新, 測序成本不斷降低。近年來發(fā)展的簡化GBS測序方法通過與參考組比對獲得海量SNP標記, 此類標記易于進行頻率估計和基因分型, 已經(jīng)在柑橘[15]、煙草[16]、玉米[17]、棉花[18]、棗樹[19]等植物中應用于聚類分析和基因定位研究。但GBS在甘藍型油菜圖譜構建和基因定位中的應用報道很少。因此, 本研究利用花色分離DH群體, 采用二代簡化測序GBS、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可變剪切、共線性與傳統(tǒng)QTL分析方法交叉結合, 期望為甘藍型油菜粉色花性狀相關基因定位與分子標記輔助選擇提供新的視角和思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃花親本62和粉花親本77都是小孢子加倍后的純系材料。DH群體為(黃花62×粉花77) F1花粉小孢子加倍成功的114個基因型株系。2018年9月至2019年5月將親本和DH群體種植于重慶市北碚區(qū)歇馬鎮(zhèn)西南大學油菜生物學團隊育種基地。每個材料種植3行, 每行8株, 行距40 cm, 株距30 cm, 田間管理按常規(guī)方式進行。

1.2 DH群體GBS測序和數(shù)據(jù)處理

2018年12月采集親本和DH群體植株嫩葉,-20℃保存?zhèn)溆谩?019年1月送北京諾禾致源生物信息科技有限公司測序。2個親本DNA建庫類型為DNA-350 bp, 以Illumina HiSeq PE150方法測序, 測序深度為30×。DH子代進行GBS簡化基因組測序。利用GBS-SNP-CROP[20]分析流程通過barcode文件一步得到114個DH子代系的雙末端測序文件。以法國甘藍型油菜Darmor-bzh為參考組, BWA-mem軟件比對測序reads到參考組, SAMtools 軟件參數(shù)mpileup 獲得114個DH子代系的SNP數(shù)據(jù)。

1.3 花色性狀考察和數(shù)據(jù)分析

油菜盛花期采用分光測色儀(YS3060)測定DH群體花瓣顏色(flower color, FC)。DH群體中每個基因型株系測量5株, 每株測量3次。采用SPSS統(tǒng)計花色性狀基本參數(shù)。采用R3.6.1制作花色表型數(shù)據(jù)密度分布直方圖。

1.4 連鎖圖譜構建和花色QTL定位

結合甘藍型油菜62和77兩親本之間變異SNP位點, 對DH群體的SNP位點過濾, 統(tǒng)計DH群體子代SNP多態(tài)型并進行基因分型。利用JoinMap 4.0[21]計算DH群體內(nèi)SNP位點間遺傳距離, perl SVG模塊繪制遺傳連鎖圖譜。使用WinQTL Cartographer 2.5 (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)復合區(qū)間作圖法對花色進行QTL定位。具體參數(shù)如下: LOD閾值設置為2.5, 掃描步長設置為1 cM, Permutation設置為1000, Significance為0.01。QTL的命名標準為: q+性狀名稱英文縮寫-染色體編號-QTL個數(shù)。如表示甘藍型油菜A07染色體上檢測到的第1個花色性狀QTL。

1.5 共線性分析

使用Python版MCScan (JCVI包)(https://gsthub. com/tanghaibao/jcvi/Mcscan)對甘藍型油菜花色定位區(qū)間內(nèi)基因與白菜、甘藍的同源基因進行共線性分析。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測序與可變剪切分析

于初花期采集甘藍型油菜純系粉花77和甘藍型油菜純系黃花62這2個親本花瓣樣品, 裝入2 mL無RNA酶的離心管并迅速置于液氮中, 取樣后保存于-80℃?zhèn)溆?。提取樣品總RNA送北京諾禾致源生物信息科技有限公司, 在Illumina HiSeq 2000平臺上完成轉(zhuǎn)錄組測序。利用bwa軟件將轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)與法國甘藍型油菜參考組Darmor-bzh比對, 獲得sam文件, 啟動Splicing Grapher[22]分析流程, 依據(jù)法國甘藍型油菜基因序列文件和注釋文件構建剪切位點模型, 結合R包繪制花色定位區(qū)間內(nèi)花色相關基因的可變剪切視圖。

2 結果與分析

2.1 遺傳圖譜構建

過濾篩選后獲得3253個作圖SNP標記(表1), 利用JoinMap軟件構建花色DH群體遺傳連鎖圖譜。19個遺傳連鎖群總遺傳距離為1766.06 cM, 平均每個標記的覆蓋范圍為0.54 cM, 標記在A和C染色體組上都有分布, 但分布不均勻。lg14 (chrC04)上有最多的410個SNP標記, 平均遺傳距離為0.29 cM; lg19 (chrC09)上標記數(shù)目最少, 僅含有33個SNP標記, 平均遺傳距離為0.60 cM。lg2 (chrA02) 42.469 cM~60.984 cM處出現(xiàn)了18.52 cM最大間距。大區(qū)域的標記缺失, 增加了標記的平均遺傳距離。SNP標記連鎖群分布如圖1。

表1 遺傳連鎖群信息統(tǒng)計

X軸表示連鎖群; Y軸表示遺傳距離(單位: cM); 藍色為有效SNP標記。

X-axis represents linkage groups; Y-axis represents genetic distance (cM); blue is a valid SNP marker.

2.2 親本62、77和DH群體花瓣色澤表型觀察

甘藍型油菜純系黃花62和甘藍型油菜純系粉花77花瓣色澤如圖2, 62為鮮黃色, 77粉色花瓣上脈絡明顯。由于是小孢子加倍材料, 62和77自交仍保持鮮黃色和粉色, 花瓣色澤不會發(fā)生分離, 花色相關基因為高度純合狀態(tài)。62×77雜交組合F1花瓣顏色為粉白色。粉色花對黃花為部分顯性。F1植株花粉小孢子培養(yǎng)秋水仙堿加倍, DH群體花瓣顏色發(fā)生了各種分離(圖3), 表現(xiàn)為桔紅、桔黃、鮮黃、淡黃、暗黃、純白、淡白、粉白等多種花色表型, 但DH群體中每種基因型都為純合狀態(tài), 自交后花瓣色沒有出現(xiàn)分離。與親本62純黃色花瓣顏色一樣的DH株系比例極少。沒有和親本77粉色花瓣顏色一樣的DH株系, 有部分株系表現(xiàn)出粉白色。因而本研究用分光測色儀對DH群體花瓣顏色表型進行數(shù)據(jù)化采集。

A1與A2: 母本62; B1與B2: 父本77。

A1 and A2: female parent 62; B1 and B2: male parent 77.

2.3 DH群體花色表型數(shù)據(jù)分析

對DH群體花色性狀進行統(tǒng)計分析(表2), 使用R包制作概率密度曲線頻率直方圖(圖4)。通過Kolmogorov-Smirnov方法檢驗花色(flower color)表型數(shù)據(jù), 花色變異范圍為6.21~53.04, 平均數(shù)為24.47, 中位數(shù)為22.89; 四分位距、偏斜度和峰度分別為12.78、0.85和0.09。顯著性Sig值< 0.05, 結果顯示花色表型偏正態(tài)分布, 表明花色受多個主效基因控制。

2.4 花色性狀QTL定位

采用WinQTL Cartographer復合區(qū)間作圖法對花色性狀進行QTL定位分析(圖5)。當LOD值>2.5時, 共檢測到2個QTL, 分別位于chrA07 (chr7)和chrC03 (chr13) 2條染色體上(表3)。所在定位區(qū)間內(nèi)包含287個基因, LOD值最高為6.62, 位點的加性效應為4.58, 解釋表型貢獻率為14.29%。而所在定位區(qū)間內(nèi)含有308個基因, LOD峰值最高為14.01, 位點加性效應為6.61, 解釋表型變異為34.02%。

表2 甘藍型油菜花色性狀統(tǒng)計參數(shù)

X軸代表花色表型組中值, Y軸代表分布密度。

X-axis represents the petal color phenotype; Y-axis represents the distribution density.

2.5 甘藍型油菜粉色花定位區(qū)間基因與甘藍、白菜同源基因共線性分析

WinQTL Cartographer復合區(qū)間作圖法確定的QTL區(qū)間為遺傳圖譜區(qū)間。GBS測序數(shù)據(jù)與參考組比對獲得的SNP標記具有準確的染色體物理位置, 花色QTL區(qū)間兩端的SNP標記比對到法國甘藍型油菜參考組和注釋文件上, SNP標記區(qū)間內(nèi)就能得到參考組對應的注釋基因。根據(jù)基因序列同源性, Python (https://gsthub.com/tanghaibao/jcvi/Mcscan)流程對花色定位區(qū)間內(nèi)基因與甘藍、白菜同源基因進行共線性分析。1個花色QTL區(qū)間比對到甘藍型油菜A07染色體13.27 Mb~14.95 Mb區(qū)間共有287個注釋基因, 244個同源基因共線性比對到白菜A02染色體17.39 Mb~22.05 Mb區(qū)間, 183個同源基因共線性比對到甘藍C06染色體0.65 Mb~12.85 Mb區(qū)間。另一個花色QTL區(qū)間比對到甘藍型油菜C03染色體51.00 Mb~54.25 Mb區(qū)間, 共308個注釋基因, 113個同源基因共線性比對到白菜A08染色體55.10 Mb~57.89 Mb區(qū)間, 230個同源基因共線性比對到甘藍C03染色體10.58 Mb~14.99 Mb區(qū)間(圖6)。

表3 WinQTL復合區(qū)間作圖花色QTL結果

圖A中, X軸表示19條染色體, Y軸分別表示LOD值和加性效應a (H1); 橫線表示LOD閾值線。圖B、圖C分別表示在7號染色體和13號染色體檢測到的一個花色QTL位點; X軸表示對應染色體上的遺傳距離, Y軸分別表示LOD值和加性效應a (H1); 橫線表示LOD閾值線。

X-axis represents 19 chromosomes, and Y-axis represents the LOD value and the additive effect a (H1) in Figure A; the horizontal line represents the LOD threshold line. Figure B, there is a represent QTL of petal color in figure C detected on chromosome 7 and chromosome 13, respectively; X-axis represents the genetic distance on the corresponding chromosome, and is marked with the corresponding linkage marker position, Y-axis represents the LOD value and the additive effect a (H1), respectively; the horizontal line indicates the LOD threshold line.

白菜和甘藍進行種間雜交可以人工合成甘藍型油菜, 3個物種基因共線性分析反映了花色定位區(qū)間內(nèi)基因由二倍體物種到四倍體物種的同源進化關系。

2.6 親本花色定位區(qū)間內(nèi)基因可變剪切比較

利用hisat2軟件處理親本77粉色花瓣和親本62黃色花瓣轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù), 整理成sam文件, 使用SpliceGrapher分析流程, 統(tǒng)計兩親本花色定位區(qū)間內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄本的剪切情況(表4)。在A07染色體花色定位區(qū)間內(nèi)共有287個基因, 親本77和62發(fā)生可變剪切的基因數(shù)都為26個, 親本77比親本62內(nèi)含子保留、外顯子跳躍、3￠端可變剪接都多1個, 5￠端可變剪接少2個; 在C03染色體花色定位區(qū)間內(nèi)共有308個基因, 親本77有14個基因發(fā)生可變剪切, 而親本62有11個基因可變剪切。親本77內(nèi)含子保留出現(xiàn)10次, 3￠端可變剪接出現(xiàn)5次, 5￠端可變剪接僅出現(xiàn)1次。親本62共有11個基因發(fā)生可變剪切, 其中內(nèi)含子保留出現(xiàn)8次, 3￠端可變剪接出現(xiàn)5次, 5￠端可變剪接出現(xiàn)2次; 這些結果顯示花色定位區(qū)間內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄本在2個親本花瓣中多數(shù)為正常剪切, 基因轉(zhuǎn)錄本可變剪切所占的比例約為10%~20%, 多種可變剪切類型并存。

已有研究表明, 花色素苷的合成代謝受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[9], 目前已鑒定了MYB家族成員、bHLH蛋白和WD40因子3類轉(zhuǎn)錄因子參與花色素苷代謝合成。花色定位區(qū)間內(nèi)基因、、與轉(zhuǎn)錄因子MYB有關;、和為3個WD40重復蛋白基因; 基因參與轉(zhuǎn)錄因子bHLH調(diào)控; 基因參與類胡蘿卜素合成途徑?；ㄉㄎ粎^(qū)間內(nèi)的8個花色相關基因在2個親本花瓣中有6個基因轉(zhuǎn)錄本都是正常剪切。而基因在親本62黃色花瓣中正常剪切(圖7-A)、在親本77粉色花瓣中為1個內(nèi)含子保留可變剪切(圖7-B);基因在親本62黃色花瓣中正常剪切(圖7-C)、在親本77粉色花瓣中為2個內(nèi)含子保留可變剪切(圖7-D)。因此, 考察花色定位區(qū)間內(nèi)花色相關基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和剪切類型可為分析推定花色候選基因提供更多線索和信息。

表4 甘藍型油菜親本花色定位區(qū)間內(nèi)基因可變剪切類型

IR: 內(nèi)含子保留; ES: 外顯子跳躍; A3SS: 3'端可變剪接; A5SS: 5'端可變剪接。

IR: intron retention; ES: exon skipping; A3SS: alternative 3' splice site; A5SS: alternative 5' splice site.

3 討論

本研究采用GBS技術對DH花色分離群體進行簡化測序, 與全基因組重測序比較, GBS測序操作簡單、成本低廉、省工省時。通過barcode[20]接頭文件從總測序數(shù)據(jù)中一次分出114個DH子代株系測序數(shù)據(jù), 將這些數(shù)據(jù)與法國甘藍型油菜參考組序列比對, 結合親本重測序之間SNP變異位點, 快速獲得具有染色體物理位置的SNP基因型分型數(shù)據(jù)。GBS與SNP芯片相比較, 芯片設計開發(fā)成本相對較高并且檢測位點固定, 部分SNP無法被檢測導致檢測位點過少。但是GBS測序也存在一些局限性, 如酶切反應有一定偏好性, 一種限制性內(nèi)切酶進行酶切時只能識別特定核苷酸序列, 測序覆蓋范圍受到一定程度影響。GBS測序過程聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)可能產(chǎn)生非特異性擴增使測序錯誤增多; 接頭二聚體過濾不完全也會在測序中造成一定損失[23]。然而在遺傳圖譜構建和QTL定位分析研究中, 通過GBS測序獲得的SNP標記完全能夠滿足要求。

A:在黃花親本62花瓣中轉(zhuǎn)錄本剪切視圖; B:在粉花親本77花瓣中轉(zhuǎn)錄本剪切視圖; C:在黃花親本62花瓣花瓣中轉(zhuǎn)錄本剪切視圖; D:在粉花親本77花瓣中轉(zhuǎn)錄本剪切視圖。灰色五邊形為外顯子, 白色區(qū)域為內(nèi)含子, 連線表示不同剪接方式。圖片包含4個區(qū)域, 第1部分為注釋文件基因模型, 第2部分是測序結果, 第3部分為測序結果與注釋文件比較基因剪切模型(帶有代表性的isoform同源蛋白異構體), 第4部分為測序文件中支持外顯子reads數(shù)目。左下角、右下角數(shù)字為該基因的起始位點和終止位點。

A: splice graph forin 62 petals; B: splice graph forin 77 petals; C: splice graph forin 62 petals; D: splice graph forin 77 petals. The gray pentagons represent exons, the white region represent introns, the lines between them represent different ways of splicing. The picture is split into four parts, the first part is the gene model from the annotation file, the second part is the sequencing result, the third part is the gene splicing model between the sequencing result and the annotation file (with a representative protein isoform), the fourth part is the number of reads supporting each exon in the sequencing file. The numbers in the lower left and right corners represent the start and stop sites of the gene, respectively.

Landry等[24]用103個限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)標記構建甘藍型油菜遺傳連鎖圖譜。Mahmood等[25]用108個插入缺失標記(Insertion-Deletion, InDel)和89個SSR標記, 劉雪平[26]用255個SSR、相關序列擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)和RAPD標記, Wang等[27]用11,458個SNP和57個SSR標記分別構建了甘藍型油菜標記連鎖圖譜。而本研究應用GBS簡化測序技術避免了以往人工全染色體設計引物跑標記計算標記遺傳距離構建連鎖圖譜的繁瑣弊端, 且GBS測序數(shù)據(jù)與法國甘藍型油菜參考組比對獲得的SNP標記有準確的染色體對應物理位置, 定位QTL更為準確直觀, 定位區(qū)間可以直接利用法國甘藍型油菜參考組注釋文件基因染色體物理位置信息。

WinQTL Cartographer是美國北卡羅來納州立大學開發(fā)的一款軟件, 在DH、F2群體基因定位中廣泛應用。結合連鎖圖譜SNP標記染色體物理位置, 此方法通過復合區(qū)間作圖定位1個花色QTL區(qū)間在甘藍型油菜A07染色體13.27 Mb~14.95 Mb, 另一個花色QTL區(qū)間在甘藍型油菜C03染色體51.00 Mb~ 54.25 Mb。很多研究者已將甘藍型油菜白花基因定位于C03染色體上。劉雪平[26]將甘藍型油菜白花基因定位于C03染色體; Zhang等[28]通過圖位克隆在甘藍型油菜C03染色體上鑒定到一個白花性狀QTL;陳雪等[14]應用二代測序技術把白花基因定位在甘藍型油菜C03染色體52 Mb~55 Mb區(qū)間內(nèi)。本研究利用WinQTLCart復合區(qū)間作圖法定位1個花色主效QTL在C03染色體的結果與陳雪等[14]一致, 且區(qū)間部分重合。

根據(jù)基因序列同源性, 對花色定位區(qū)間內(nèi)基因進行甘藍型油菜、白菜、甘藍3個物種之間共線性分析。白菜A02染色體17.39 Mb~22.05 Mb區(qū)間與甘藍型油菜A07染色體花色QTL區(qū)間具有基因同源共線性, 與楊曉剛[29]定位的白菜白花基因位于A02染色體20.99 Mb~22.97 Mb區(qū)間存在重合, 與趙君偉[9]定位的白菜白花基因位于A02染色體21.69 Mb~21.86 Mb區(qū)間也部分重合。甘藍C03染色體10.58 Mb~14.99 Mb區(qū)間與甘藍型油菜C03染色體花色QTL區(qū)間具有基因同源共線性。而楊茹涵等[30]將白花基因定位于甘藍C03染色體48.08 Mb~ 48.92 Mb區(qū)間。本課題組利用重測序BSA方法將甘藍型油菜桔紅花基因定位于A07染色體19 Mb~20 Mb區(qū)間(結果待發(fā)表), 與WinQTL Cartographer定位另一個花色QTL區(qū)間在甘藍型油菜A07染色體13.27 Mb~14.95 Mb結果十分相近。因此, 粉色花性狀主效基因QTL染色體定位區(qū)間與已報道的文獻基本一致, 定位區(qū)間部分重疊以及蕓薹屬共線性區(qū)間展示了花色定位區(qū)間內(nèi)基因由二倍體物種到四倍體物種的基因同源關系。尤其是C03染色體上的粉色花主效基因QTL與前人定位的甘藍型油菜白花基因C03染色體區(qū)間基本一致, 因此猜測C03染色體粉色花主效基因和前人定位的白花基因是同一個基因。

田間花色育種實踐中, 甘藍型油菜粉色花純系自交不分離。但粉色花與甘藍型黃花雜交構建F2群體或DH群體時, 花瓣色會有純白和桔紅2種主要花色的分離, 還有大量的淡紅、淡黃、粉白等中間色, 花色表型數(shù)據(jù)呈多峰特點, 表現(xiàn)出主效-微效基因控制的數(shù)量性狀遺傳特點。而通過WinQTL Cartographer定位2個粉色花QTL分別分布在C03和A07染色體上, 推測甘藍型油菜粉色花性狀至少有2個主效基因, 粉色花與黃花雜交分離世代中, 2個主效基因分離, 多個微效基因作用, 從而導致F2和DH群體呈現(xiàn)多種花瓣顏色的分離。

對甘藍型油菜親本77粉色花瓣和親本62黃色花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行可變剪切事件分析發(fā)現(xiàn), 花色定位區(qū)間6個花色相關基因、、、、、的轉(zhuǎn)錄本在親本62黃色花瓣和親本77粉色花瓣中都為正常剪切。而花色相關基因和在親本粉色花瓣中都發(fā)生內(nèi)含子保留可變剪切。直接參與類胡蘿卜素合成,參與花色苷代謝。轉(zhuǎn)錄本的可變剪切增加了基因表達的復雜程度與蛋白質(zhì)功能的多樣性, 可能是影響甘藍型油菜發(fā)育過程中花瓣顏色發(fā)生改變的因素之一。

傳統(tǒng)QTL區(qū)間定位方法和二代簡化測序、共線性比對、轉(zhuǎn)錄組測序和可變剪切等分析技術相結合, 有助于進一步縮小和鎖定甘藍型油菜粉色花相關基因的范圍, 為粉色花候選基因精細定位和開發(fā)甘藍型油菜花色基因分子連鎖標記提供更多信息。

4 結論

GBS測序技術分析DH群體篩選出3253個SNP標記, 構建了全長1766.06 cM甘藍型油菜連鎖圖譜, 標記間平均遺傳距離為0.54 cM; 粉色花性狀2個QTL分別定位到A07和C03染色體上; 定位區(qū)間內(nèi)基因與甘藍和白菜線性比對, 找到一些存在于3個物種的同源基因; 定位區(qū)間花色相關基因可變剪切分析發(fā)現(xiàn), 2個花色相關基因在粉花親本花瓣中發(fā)生內(nèi)含子保留可變剪切。

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Construction of a high-density genetic map using genotyping by sequencing (GBS) for quantitative trait loci (QTL) analysis of pink petal trait inL.

ZHOU Xin-Tong1,2,**, GUO Qing-Qing1,2,**, CHEN Xue1,2, LI Jia-Na1,2, and WANG Rui1,2,*

1Academy of Agricultural Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China;2College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University / Chongqing Engineering Research Center for Rapeseed, Chongqing 400715, China

Petal color is an important ornamental trait in, and the breeding and improvement of petal color have become the main goal in breeding and genetic research. To date, the research about interval location of pink petal trait inis very less yet. In this study, the genetic basis of petal phenotype was examined in the 62 (yellow petal) and 77 (pink petal) parents as well as 114 individuals comprising the doubled haploid (DH) mapping population. This DH population was examined using genotyping by sequencing (GBS) with 6065 high-density polymorphism single nucleotide polymorphism (SNP) markers to construct a genetic linkage map comprised of 3253 polymorphic markers. The genetic map spanned 1766.06 cM, with an average distance of 0.54 cM between markers. The complete interval mapping method identified two quantitative trait loci (QTL) for petal color located on chromosomes A07 and C03, respectively. Synteny analysis showed that some homologous genes in the interval ofwere located inand. Also, eight genes related to flower color were analyzed between inbred line 77 and inbred line 62, the splice junctions ofandwere belong to intron retention type in pink petal of 77 parent. This study lays a foundation for further research on fine mapping of pink petal trait and molecular marker-assisted selection inL.

L.; pink petal trait; genetic linkage map; QTL mapping

10.3724/SP.J.1006.2021.04115

本研究由西南大學校創(chuàng)項目(106352020478)資助。

This study was supported by the Innovation Project of Southwest University Students (106352020478).

王瑞, E-mail: ruiwang71@163.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

周新桐, E-mail: wjzxt22@163.com; 郭青青, E-mail: 1833266719@qq.com

2020-05-30;

2020-09-13;

2020-12-01.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201201.1534.002.html