徐潤灝，鄒 琛，張 潔，李 敏，張舒林

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200001）

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，占惡性腫瘤死亡人數(shù)的25%[1]。血清學(xué)檢查相對(duì)于其他檢查手段，具有簡(jiǎn)單、快速、無痛、微創(chuàng)等特點(diǎn)，適用于肺癌的初篩及輔助診斷。膽汁酸按結(jié)構(gòu)可分為游離膽汁酸和結(jié)合膽汁酸，按來源又可分為初級(jí)膽汁酸和次級(jí)膽汁酸。初級(jí)膽汁酸是肝細(xì)胞以膽固醇為原料直接合成的膽汁酸，包括膽酸（cholic acid，CA）、鵝脫氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）及相應(yīng)的結(jié)合膽汁酸；次級(jí)膽汁酸由初級(jí)膽汁酸隨膽汁進(jìn)入腸道，在回腸、結(jié)腸上段由腸道菌、酶催化，脫去羥基轉(zhuǎn)化而成，包括脫氧膽酸（deoxycholicacid，DCA）、石膽酸（lithocholic acid，LCA）、熊脫氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）及相應(yīng)的結(jié)合膽汁酸。根據(jù)以往的認(rèn)知，由于膽汁酸主要存在于腸肝循環(huán)系統(tǒng)中，因此關(guān)于膽汁酸譜的研究多與肝膽疾病、腸道疾病相關(guān)，與肺部疾病相關(guān)的報(bào)道極少。近年來，有研究結(jié)果顯示，在一些呼吸系統(tǒng)疾病患者中，其支氣管肺泡灌洗液內(nèi)含有較高水平的膽汁酸[2]，且合并胃食管反流病的概率也相當(dāng)高[3]。還有研究結(jié)果顯示，法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）、G蛋白偶聯(lián)受體5（takeda G protein-coupled receptor 5，TGR5）等膽汁酸受體在肺組織中有不同程度地表達(dá)[4-5]，這些膽汁酸受體在肺部參與多種信號(hào)通路的激活[6-9]，且在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)[8-9]。為此，本研究擬探討血清膽汁酸譜在肺癌中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年9月—2019年6月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌的患者108例（肺癌組），其中男75例、女33例，年齡39～84歲；根據(jù)臨床進(jìn)展分為早中期（Ⅰ～Ⅲ期53例）、晚期（Ⅳ期51例）；根據(jù)病理分期分為鱗癌（34例）、腺癌（74例）；排除已知伴有肝、腸等消化道器官轉(zhuǎn)移的患者。選取經(jīng)檢查排除肺部腫瘤，診斷為肺炎的患者80例（肺炎組），其中男41例、女39例，年齡25～92歲。所有患者均排除肝功能異常、腸道炎癥、膽囊結(jié)石以及腸道切除等病癥，并排除服用過膽汁酸受體激動(dòng)劑及免疫抑制劑者。另選取上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院體檢中心健康體檢者106名（正常對(duì)照組），其中男62名、女44名，年齡41～84歲，入組標(biāo)準(zhǔn)：胃腸道功能未見異常，且排除糖尿病、高血壓、慢性肝膽疾病及肝、腎功能等異常。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采用含促凝劑的真空采血管采集所有對(duì)象空腹靜脈血4 mL，2 h內(nèi)16 000×g離心10 min，分離血清。

1.2.2 膽汁酸譜檢測(cè) 采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography tandemmass spectrometry，LC-MS/MS）檢測(cè)膽汁酸譜，包括5種游離膽汁酸（CA、CDCA、DCA、LCA、UDCA）及10種結(jié)合膽汁酸[甘氨膽酸（glycocholic acid，GCA）、甘氨鵝脫氧膽酸（glycochenodeoxycholic acid，GCDCA）、甘氨脫氧膽酸（glycodeoxycholic acid，GDCA）、甘氨石膽酸（glycolithocholic acid，GLCA）、甘氨熊脫氧膽酸（glycoursodeoxycholic acid，GUDCA）、?；悄懰幔╰aurocholic acid，TCA）、?；蛆Z脫氧膽酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA）、?；敲撗跄懰幔╰aurodeoxycholic acid，TDCA）、?；鞘懰幔╰aurolithocholic acid，TLCA）、?；切苊撗跄懰幔╰auroursodeoxycholic acid，TUDCA）]，檢測(cè)儀器為API3200MD三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國ABSciex公司）及Shimadzu 20AD液相色譜儀（日本島津公司），試劑購自上海可力梅塔生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2.3 總膽汁酸（total bile acid，TBA）檢測(cè) 采用酶循環(huán)法檢測(cè)TBA。檢測(cè)儀器為7600全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司），試劑購自四川邁克生物股份有限公司。

1.2.4 腫瘤標(biāo)志物檢測(cè) 采用cobas e801全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學(xué)發(fā)光法）檢測(cè)糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）125、CA19-9、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細(xì)胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment，CYFRA 21-1）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件及MedCalc 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用K-S檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性分布檢驗(yàn)。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。采用逐步法二元Logistic回歸分析進(jìn)行相關(guān)性分析并篩選優(yōu)化診斷指標(biāo)，根據(jù)Logistic回歸分析結(jié)果，以訓(xùn)練樣本建立診斷模型；以模型Y為新變量，采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估診斷模型鑒別診斷肺炎與肺癌的效能，以驗(yàn)證樣本加以驗(yàn)證。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺炎組、肺癌組及正常對(duì)照組之間血清膽汁酸譜的比較

與正常對(duì)照組比較，肺炎組血清游離膽汁酸DCA、LCA、UDCA水平及結(jié)合膽汁酸GDCA、GLCA、TDCA、TLCA水平降低（P＜0.01），血清結(jié)合膽汁酸GCDCA、TCDCA水平升高（P＜0.01）；肺癌組血清游離膽汁酸CA、CDCA水平及結(jié)合膽汁酸GCDCA、TCDCA水平升高（P＜0.01），血清結(jié)合膽汁酸TDCA、TLCA水平降低（P＜0.01）。血清TBA水平3組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。肺癌組血清游離膽汁酸CA、CDCA、DCA、LCA、UDCA及結(jié)合膽汁酸GDCA、GLCA高于肺炎組（P＜0.01）。見表1、表2。

2.2 不同類型及不同分期肺癌患者血清膽汁酸譜的比較

早中期肺癌組與晚期肺癌組之間、肺鱗癌組和肺腺癌組之間血清TBA及5種游離膽汁酸、10種結(jié)合膽汁酸差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3～表6。

2.3 肺炎組與肺癌組血清腫瘤標(biāo)志物的比較

肺癌組血清CEA、CYFRA21-1、NSE水平均明顯高于肺炎組（P＜0.01、P＜0.05），2個(gè)組之間血清CA125、CA19-9水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表7。

2.4 膽汁酸譜及腫瘤標(biāo)志物鑒別診斷肺炎與肺癌的價(jià)值

采用ROC曲線分析肺炎組與肺癌組之間有差異的7種膽汁酸和2種腫瘤標(biāo)志物。結(jié)果顯示，DCA、UDCA、CEA鑒別診斷肺炎與肺癌的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.781、0.707、0.704，敏感性分別為73.2%、86.1%和62.0%，特異性分別為77.5%、50.0%和72.5%。其他指標(biāo)的AUC均＜0.7。見表8。

表1 肺炎組、肺癌組及正常對(duì)照組之間血清TBA及5種游離膽汁酸水平的比較 M（P25～P75）

表2 肺炎組、肺癌組及正常對(duì)照組之間血清結(jié)合膽汁酸水平的比較 M（P25～P75）

表3 早中期肺癌組及晚期肺癌組之間血清TBA及游離膽汁酸水平的比較 M（P25～P75）

表4 早中期肺癌組及晚期肺癌組之間血清結(jié)合膽汁酸水平的比較 M（P25～P75）

表5 肺鱗癌組及肺腺癌組之間血清TBA及游離膽汁酸水平的比較 M（P25～P75）

表6 肺鱗癌組及肺腺癌組之間血清結(jié)合膽汁酸水平的比較 M（P25～P75）

表7 肺炎組與肺癌組血清5種腫瘤標(biāo)志物水平的比較 M（P25～P75）

表8 7種膽汁酸和2種腫瘤標(biāo)志物鑒別診斷肺炎與肺癌的價(jià)值

2.5 肺炎與肺癌鑒別診斷模型的建立

2.5.1 診斷模型建立 隨機(jī)抽取樣本量的70%組成訓(xùn)練樣本，其中肺炎患者56例、肺癌患者76例。將2個(gè)組之間有差異的9項(xiàng)指標(biāo)（CA、CDCA、DCA、LCA、UDCA、GDCA、GLCA、CEA、CYFRA21-1）納入逐步法二元Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，DCA、CDCA、CYFRA-211是鑒別診斷肺炎和肺癌的主要影響因素，見表9。據(jù)此建立診斷模型Y=1/（1+e-LogitP），式中LogitP=0.007×DCA+0.001×CDCA+0.176×CYFRA21-1-2.293，模型系數(shù)綜合檢驗(yàn)和Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)結(jié)果顯示，模型擬合度良好（χ2=62.10，P＜0.05；χ2=5.58，P＞0.05）。

2.5.2 診斷模型Y鑒別診斷肺炎與肺癌的效能分析 ROC曲線分析結(jié)果顯示，診斷模型Y鑒別診斷肺炎與肺癌的AUC（95%CI）為0.873（0.804～0.925），最佳臨界值為0.52，敏感性CT）也存在過度診斷、輻射量大等不足[12]。因此，血清學(xué)標(biāo)志物對(duì)肺癌和肺炎的輔助鑒別診斷至關(guān)重要。現(xiàn)階段肺癌的血清學(xué)篩查和診斷主要依靠CEA、NSE等腫瘤標(biāo)志物，這些腫瘤標(biāo)志物在區(qū)分肺癌患者與健康人時(shí)具有較高的敏感性和特異性[11]，但由于大部分腫瘤標(biāo)志物在肺部炎癥時(shí)也會(huì)有不同程度地升高，因此在對(duì)肺癌和肺炎進(jìn)行鑒別診斷時(shí)往往不能達(dá)到令人滿意的效果[13]。

表9 訓(xùn)練樣本9項(xiàng)指標(biāo)逐步法二元logistic回歸分析結(jié)果

膽汁酸是膽汁的重要成分，各類游離膽汁酸是FXR、TGR5等膽汁酸受體的主要配體[14]，游離膽汁酸的改變會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致結(jié)合膽汁酸的改變。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，肺癌患者血清膽汁酸譜以初級(jí)游離膽汁酸CA、CDCA升高為主要特征，與LIU等[8]的研究結(jié)果基本一致。對(duì)膽汁酸受體的最新研究結(jié)果表明，肺癌患者血清游離膽汁酸水平與癌組織中膽汁酸受體的表達(dá)呈明顯正相關(guān)，一些游離膽汁酸可活化肺癌細(xì)胞中的膽汁酸受體，使其表達(dá)升高，而在高于正常水平的情況下，膽汁酸受體能進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的增殖[8]，如FXR能通過激活細(xì)胞周期蛋白-D1促進(jìn)肺部腫瘤的增殖[9]，TGR5能通過激活兩面神激酶2（janus kinase 2，JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號(hào)通路刺激肺部腫瘤細(xì)胞的增殖[8]。因此，高水平的游離膽汁酸可能是推動(dòng)肺癌進(jìn)展的原因之一。此外，本研究結(jié)果顯示，肺炎患者血清膽汁酸譜以次級(jí)游離膽汁酸DCA、LCA、UDCA降低為主要特征。在動(dòng)物模型中，膽汁酸受體激動(dòng)劑已被證實(shí)是治療肺部炎癥性纖維化的可能手段[15]，膽汁酸受體TGR5可為89.3%，特異性為75.4%，符合率為82.4%。見圖1。

2.5.3 診斷模型Y的驗(yàn)證 將剩余樣本（肺炎24例、肺癌32例）作為驗(yàn)證樣本，代入診斷模型Y進(jìn)行驗(yàn)證。共檢出18例肺炎患者和25例肺癌患者，總符合率為76.8%，與ROC曲線分析結(jié)果基本符合。

圖1 診斷模型Y鑒別診斷肺炎與肺癌的ROC曲線

3 討論

目前，臨床病理分期，即TNM分期仍是預(yù)測(cè)肺癌患者生存時(shí)間最主要的指標(biāo)[1]，而高誤診率是肺癌確診時(shí)分期晚、預(yù)后差的主要原因之一。有研究結(jié)果顯示，在我國部分地區(qū)，40歲以下人群中肺癌的誤診率可達(dá)50%以上，且主要誤診為肺炎[10]。這是由于肺癌的早期癥狀多為咳嗽、呼吸困難、發(fā)熱等，與肺炎極為相似。胸部X線檢查由于缺乏特異性，常被阻塞性肺炎和肺不張等掩蓋了肺部腫瘤病變的特征[11]。電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，通過抑制核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號(hào)通路的激活來達(dá)到抑制肺部炎癥的效果[6]，同時(shí)FXR還可通過抑制脂多糖促進(jìn)的肺部某些促炎細(xì)胞因子的分泌，達(dá)到抑制炎癥的作用，但此過程中會(huì)大量消耗膽汁酸受體[7，16]，這可能是一些游離膽汁酸水平降低的原因。

本研究對(duì)肺癌組和肺炎組的膽汁酸譜進(jìn)行了比較，同時(shí)還納入了5種臨床常用的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)膽汁酸譜和常用腫瘤標(biāo)志物的診斷效能進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，肺癌組與肺炎組之間有5種游離膽汁酸（CA、CDCA、DCA、LCA、UDCA）、2種結(jié)合膽汁酸（GDCA、GLCA）及2種腫瘤標(biāo)志物（CEA、CYFRA21-1）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），單個(gè)指標(biāo)中鑒別診斷效能最好的是DCA，AUC為0.781，敏感性為73.2%，特異性為77.5%。將上述9項(xiàng)指標(biāo)納入逐步法二元Logistic回歸分析，聯(lián)合診斷的最優(yōu)組合是CDCA、DCA、CYFRA21-1，其中CDCA是FXR最有效的內(nèi)源性配體[17]；在所有穩(wěn)定參與腸肝循環(huán)的膽汁酸中，DCA是TGR5最強(qiáng)的天然激動(dòng)劑[18]；CYFRA21-1是對(duì)非小細(xì)胞肺癌最敏感的腫瘤標(biāo)志物。3項(xiàng)指標(biāo)組成的診斷模型鑒別診斷肺炎與肺癌的敏感性為89.3%，特異性為75.4%，AUC為0.873，診斷效能明顯優(yōu)于單項(xiàng)指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，肺炎組、肺癌組與正常對(duì)照組之間血清TBA水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這可能是由于膽汁酸的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程復(fù)雜，受多種因素調(diào)節(jié)，在不同疾病狀態(tài)下膽汁酸的組分呈現(xiàn)不同的改變，而總量卻保持不變所致。肺鱗癌組與肺腺癌組之間、早中期肺癌組與晚期肺癌組之間血清膽汁酸譜差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，血清膽汁酸譜無法區(qū)分肺癌的分期和類型。

由于本研究未對(duì)小細(xì)胞肺癌與其他良性肺部疾病，如肺結(jié)核等的膽汁酸譜進(jìn)行分析，也尚未納入鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原、胃泌素釋放肽前體等與肺部腫瘤相關(guān)的標(biāo)志物，因此后續(xù)研究將進(jìn)一步擴(kuò)展驗(yàn)證，繼續(xù)揭示膽汁酸譜在肺癌和其他肺部疾病中的作用和意義。

綜上所述，血清膽汁酸譜的變化與肺部疾病的有一定關(guān)系，膽汁酸譜有成為肺癌診斷標(biāo)志物的潛能。但目前關(guān)于肺癌血清膽汁酸譜的研究很少，因此本研究的結(jié)論和診斷模型還需大樣本、多中心研究加以驗(yàn)證。