楊琦 林輝 吳國(guó)水 毛櫻 池菊芳 郭航遠(yuǎn)

冠心病致死、致殘率高，給家庭、社會(huì)均帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]。動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎(chǔ)，內(nèi)皮功能障礙是始動(dòng)因素[2]，臨床研究觀察發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮功能障礙與冠心病高危患者近期心血管事件發(fā)生（如急性心肌梗死）顯著相關(guān)[3]。因此，早期發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙并進(jìn)行有效干預(yù)，對(duì)于延緩冠心病進(jìn)展有重要意義。目前已有大量研究指出經(jīng)典名方瓜蔞薤白半夏湯在治療冠心病上的獲益[4]。本研究應(yīng)用Endo-PAT 無創(chuàng)血管內(nèi)皮功能檢測(cè)系統(tǒng)評(píng)估瓜蔞薤白半夏湯對(duì)冠心病患者內(nèi)皮功能的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2018 年9 月至2019 年12 月在紹興市人民醫(yī)院住院并經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診為冠心病的患者85 例，按隨機(jī)數(shù)字表法分成兩組，觀察組45例，男27 例，女18 例，年齡51～88（62.07±4.58）歲；對(duì)照組40 例，男29 例，女11 例，年齡53～81（63.46±5.81）歲。兩組患者性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05），見表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～75 歲；（2）冠狀動(dòng)脈造影顯示左冠狀動(dòng)脈中左主干、左前降支、左旋支或右冠狀動(dòng)脈中1 支以上血管狹窄程度≥50%。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重心力衰竭、心臟瓣膜病、心肌病、重度心律失常、重度高血壓或血壓偏低者；（2）合并其他臟器嚴(yán)重原發(fā)病，重要臟器功能不全，運(yùn)動(dòng)障礙及精神病患者；（3）妊娠、哺乳期患者；（4）過敏體質(zhì)及已知對(duì)研究所用藥物過敏或不能耐受者。本研究經(jīng)紹興市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：2017026），患者或家屬均簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料比較[例（%）]

1.2 方法

1.2.1 治療方法 對(duì)照組患者接受阿司匹林100 mg/d（拜阿司匹林，北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司，規(guī)格：100 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20171021），阿托伐他汀20 mg/d（立普妥，大連輝瑞制藥有限公司，規(guī)格：20 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20051408）口服，根據(jù)患者病情使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（angiotensin receptor blocker，ARB）和β 受體阻滯劑等。觀察組患者在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上，于入院第2 天開始服用瓜蔞薤白半夏湯，湯劑均請(qǐng)紹興市人民醫(yī)院中藥房代煎，真空包裝，每劑含瓜蔞實(shí)12 g，薤白9 g，半夏9 g，分成2 包，每包150 mL，2 次/d，飯后溫服，服用6 周后停用[5]。兩組患者均隨訪6 個(gè)月。

1.2.2 血脂及內(nèi)皮因子指標(biāo)測(cè)定 于入院24 h 內(nèi)、治療6 周時(shí)和治療6 個(gè)月時(shí)，采集外周靜脈血，離心后冷凍保存，測(cè)定低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）水平。采用ELISA 法測(cè)定一氧化氮（nitric oxide，NO）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、內(nèi) 皮 素-1（endothelin-1，ET-1）水平。

1.2.3 CD31+/CD42-內(nèi)皮微粒（endothelial microparticles，EMPs）水平、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞（circulating endothelial cells，CECs）數(shù)量測(cè)定 采用流式細(xì)胞技術(shù)：（1）測(cè)定CD31+/CD42-EMPs 水平：于入院24 h內(nèi)、治療6 周和治療6 個(gè)月時(shí)，分別采集肘靜脈血5 mL，枸櫞酸鈉抗凝管收集，通過兩步離心法取上清液，獲得貧血小板血漿后于室溫下溶解，取50 μL加入特異性熒光標(biāo)記抗體CD42、CD31 0.5 μg。在室溫下孵育20 min 后依次加入1 mL PBS 液，采用流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter 公司，Navios 型）檢測(cè)，上機(jī)前用直徑為1.0 μm 的標(biāo)準(zhǔn)微球定位設(shè)門。（2）CECs 分離和計(jì)數(shù)：參考Mancuso 等[6]的研究將CD45-/CD146+/CD31+定義為CECs，收集EDTA 抗凝血液，取其中200 μL 與PBS 緩沖液（500 μL）混勻后，加入熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD45、CD146、CD31，室溫下避光孵育30 min，待抗體和CECs 充分結(jié)合后，加入紅細(xì)胞裂解液（FACSTM lysing solu tion，F(xiàn)ACS 溶液），室溫下繼續(xù)孵育15 min，待紅細(xì)胞被充分裂解，使用FACS 溶液洗滌兩次后離心，離心后的細(xì)胞沉淀再次使用FACS 溶液重懸，0.5 h 內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.4 內(nèi)皮功能指標(biāo)測(cè)定 檢測(cè)前禁食8 h，禁止吸煙。采用Endo-PAT 2000 無創(chuàng)血管內(nèi)皮功能檢測(cè)系統(tǒng)（以色列Itamar Medical 公司，ZX7M-Endo-pat 2000 型）檢測(cè)內(nèi)皮功能?；颊咂脚P于檢查床上休息30 min，雙上肢置于身體兩側(cè)，將充氣袖帶佩戴在一側(cè)上臂，將兩個(gè)Endo-PAT 指套狀探針分別佩戴在雙手食指上，開啟Endo-PAT，指套自動(dòng)充氣，探針內(nèi)傳感器將指端血管床血流信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)軟件。首先記錄5 min 指端血管床血流作為基線信號(hào)，然后袖帶快速充氣使壓力維持在200 mmHg 以上，軟件顯示該側(cè)血流信號(hào)消失，保持記錄5 min，袖帶快速放氣使壓力歸零，被阻斷的指端血流信號(hào)恢復(fù)后再記錄5 min，檢測(cè)結(jié)束，獲得該側(cè)血流信號(hào)與基線血流信號(hào)的比值，將這個(gè)比值標(biāo)準(zhǔn)化，并與另一側(cè)的對(duì)照手臂信號(hào)的變化相比較，利用儀器專用軟件計(jì)算反應(yīng)性充血指數(shù)（reactive hyperemia index，RHI）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)，組間治療前后比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Kruskalwallis 秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療前后血脂水平比較 見表2。

由表2 可見，治療前，兩組患者血脂水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。治療6 周及6 個(gè)月時(shí)，觀察組LDL-C 及TC 水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），兩組治療6 周時(shí)HDL-C 與TG 水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。治療6 個(gè)月時(shí)，觀察組TG 水平較對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 兩組患者治療前后血脂水平比較（mmol/L）

2.2 兩組患者治療前后內(nèi)皮因子指標(biāo)比較 見表3。

由表3 可見，治療前，兩組患者內(nèi)皮因子指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。治療6 周及6 個(gè)月時(shí)，觀察組NO 和eNOS 水平高于對(duì)照組，ET-1 水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 兩組患者治療前后EMPs、CECs 和內(nèi)皮功能指標(biāo)的比較 見表4

由表4 可見，治療前，兩組CD31+/CD42-EMPs水平、CECs 數(shù)量及RHI 值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。治療6 周及6 個(gè)月時(shí)，觀察組CD31+/CD42-EMPs 水平、CECs 數(shù)量較對(duì)照組低，RHI值較對(duì)照組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 兩組患者治療6 個(gè)月時(shí)RHI 與CECs 的相關(guān)性分析 見圖1。

由圖1 可見，觀察組、對(duì)照組RHI 與CECs 數(shù)量均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.495、-0.371，均P＜0.05）。

表3 兩組患者治療前后內(nèi)皮因子指標(biāo)比較

表4 兩組患者治療前后EMPs、CECs 和內(nèi)皮功能指標(biāo)的比較

圖1 兩組患者治療6 個(gè)月后RHI 與CECs 的相關(guān)性（A：觀察組，B：對(duì)照組；RHI 為反應(yīng)性充血指數(shù)，CECs 為循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞）

3 討論

隨著老齡化進(jìn)程的加劇，我國(guó)冠心病發(fā)病率及死亡率仍處于上升階段[7]。目前治療冠心病的藥物存在出血風(fēng)險(xiǎn)、肝腎功能損害等不良反應(yīng)，一定程度上限制了藥物的運(yùn)用，搭橋手術(shù)創(chuàng)傷大，術(shù)后恢復(fù)緩慢，介入治療也面臨著術(shù)后再狹窄、心絞痛復(fù)發(fā)等問題。因此，許多研究學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向祖國(guó)醫(yī)學(xué)，挖掘中醫(yī)藥對(duì)冠心病的治療效果及機(jī)制。冠心病在中醫(yī)學(xué)中屬于“胸痹”范疇。瓜蔞薤白半夏湯是《金匱要略》中治療胸痹的代表方劑，研究發(fā)現(xiàn)瓜蔞可調(diào)節(jié)血糖、血脂及血壓，薤白有抗血小板活性，半夏可抗血栓形成，瓜蔞薤白半夏湯整副湯劑能夠改善冠心病患者心絞痛癥狀[4]，但其在血管內(nèi)皮功能改善方面的報(bào)道仍較少。

血管內(nèi)皮功能障礙參與了心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展、惡化和預(yù)后的全過程，而血管內(nèi)皮功能障礙是可診斷、可逆和可治愈的，因此在早期檢測(cè)血管內(nèi)皮功能，是降低各種嚴(yán)重心血管不良事件和改善患者遠(yuǎn)期預(yù)后的根本措施[8]。目前常檢測(cè)的內(nèi)皮功能指標(biāo)包括NO 和ET-1。NO 是內(nèi)皮功能內(nèi)源性的保護(hù)物質(zhì)，拮抗ET-1，從某種程度上可反映出血管內(nèi)皮的損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)與觀察組比較，接受瓜蔞薤白半夏湯治療的患者eNOS 及NO 水平上升及ET-1水平下降顯著，這提示了瓜蔞薤白半夏湯具有舒張血管作用且為內(nèi)皮依賴性舒張，與內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，拮抗ET-1 有關(guān)，這與先前研究的結(jié)論一致[9]。

目前許多研究仍在尋找更合適的血管內(nèi)皮標(biāo)志物。內(nèi)皮細(xì)胞是多種心血管疾病或危險(xiǎn)因子作用的靶器官，不受抑制的內(nèi)皮細(xì)胞活化可能導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，造成不可逆的內(nèi)皮損傷和內(nèi)皮功能障礙[10]。已有研究指出包含黃芪、瓜蔞、薤白、半夏的“補(bǔ)氣化痰方”對(duì)經(jīng)氧化低密度脂蛋白損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，并可能是通過上調(diào)Bcl-2 及下調(diào)Bax 蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)[11]。EMPs 是一種在內(nèi)皮細(xì)胞激活或凋亡狀態(tài)下釋放的膜樣結(jié)構(gòu)微泡，是檢測(cè)內(nèi)皮功能潛在的生物學(xué)標(biāo)志物[12]。有研究證實(shí)，CD31+是心血管疾病的危險(xiǎn)因素，CD31+EMPs 水平越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相應(yīng)增加[13]。CECs 是內(nèi)皮損傷/功能障礙的特異性和直接細(xì)胞標(biāo)志物，與心血管風(fēng)險(xiǎn)增加和心血管預(yù)后差相關(guān)[14]。本研究檢測(cè)到觀察組患者EMPs 數(shù)量較對(duì)照組減少，同樣為瓜蔞薤白半夏湯能夠減少血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡提供了證據(jù)。此外，本研究檢測(cè)兩組的CECs 數(shù)量，發(fā)現(xiàn)觀察組CECs 數(shù)量較對(duì)照組明顯下降，提示瓜蔞薤白半夏湯對(duì)內(nèi)皮損傷有保護(hù)作用。

血脂異常是冠心病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，因此調(diào)節(jié)血脂也是冠心病治療的目標(biāo)之一[15]。臨床上常用的他汀類藥物如阿托伐他汀具有調(diào)節(jié)血脂，穩(wěn)定斑塊，改善血管內(nèi)皮功能的作用。我們?cè)诎⑼蟹ニ≈委熁A(chǔ)上使用瓜蔞薤白半夏湯，發(fā)現(xiàn)患者血脂下降較對(duì)照組更顯著，也提示了瓜蔞薤白半夏湯與阿托伐他汀有協(xié)同作用，進(jìn)一步加強(qiáng)調(diào)節(jié)血脂的能力，但兩組患者的HDL-C 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，研究者考慮存在隨訪時(shí)間較短的原因。

Endo-PAT 2000 無創(chuàng)血管內(nèi)皮功能診斷系統(tǒng)可以探測(cè)出血管造影尚不能發(fā)現(xiàn)的早期病變，對(duì)心血管疾病的預(yù)防和治療具有重大的臨床意義。RHI-PAT 指數(shù)1.67 被認(rèn)為是區(qū)分正常和異常血管內(nèi)皮功能的最佳閾值。RHI 值越高，提示內(nèi)皮功能越好，反之亦然。有研究報(bào)道RHI 與年齡、BMI、腰圍、血壓、TG 呈明顯負(fù)相關(guān)[16-17]，與HDL-C 呈正相關(guān)。有研究指出RHI 與頸動(dòng)脈的內(nèi)中膜厚度（carotid intima-media thickness，IMT）呈負(fù)相關(guān)，IMT＞1.2 mm且部分存在突起為頸動(dòng)脈斑塊形成，提示RHI 可用于評(píng)估冠狀動(dòng)脈病變程度[18]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)瓜蔞薤白半夏湯治療6 周，觀察組患者的RHI 值較對(duì)照組上升明顯，6 周療程結(jié)束，比較6 個(gè)月時(shí)兩組的RHI，仍能得到相同的結(jié)果，這反映了早期服用瓜蔞薤白半夏湯能夠有效改善患者血管內(nèi)皮功能。本研究選擇CECs 作為此次研究的內(nèi)皮功能標(biāo)志物，進(jìn)一步對(duì)RHI 和內(nèi)皮功能進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩組患者的RHI 與CECs 數(shù)量均存在負(fù)相關(guān)。CECs 是診斷及評(píng)估冠狀動(dòng)脈疾病預(yù)后的一種有前途的生物標(biāo)志物，其數(shù)量越多，心血管風(fēng)險(xiǎn)越高，提示RHI 能夠有效評(píng)估瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病的療效。本研究存在一定局限性，首先隨訪時(shí)間僅6 個(gè)月，無法評(píng)估瓜蔞薤白半夏湯對(duì)冠心病的遠(yuǎn)期影響，其次納入患者數(shù)量較少，未能進(jìn)行亞組分析，深入研究。

早期運(yùn)用瓜蔞薤白半夏湯能夠改善冠心病患者血管內(nèi)皮功能，這可能是通過調(diào)節(jié)患者血脂這一危險(xiǎn)因子，促進(jìn)保護(hù)因子NO 的合成，減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而進(jìn)一步發(fā)揮內(nèi)皮功能保護(hù)作用。Endo-PAT無創(chuàng)血管內(nèi)皮功能檢測(cè)系統(tǒng)能夠有效評(píng)估瓜蔞薤白半夏湯對(duì)冠心病患者血管內(nèi)皮功能的影響，且無創(chuàng)安全，值得臨床推廣。