黃曉燕 王英 廉姜芳

遺傳性長(zhǎng)QT 綜合征（hereditary long QT syndrome，hLQTs）是因編碼心肌離子通道蛋白基因突變導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜離子通道功能障礙的一組臨床綜合征，常于青少年發(fā)病，是青少年猝死的主要原因。其中Ⅱ型長(zhǎng)QT 綜合征（long QT syndrome 2，LQT2）的發(fā)生與快激活延遲整流鉀電流（rapidly activating component of delayed rectifier potassium current，IKr）的減少有關(guān)，這是由于編碼IKr通道α 亞單位的人類(lèi)ether-a-go-go 相關(guān)基因（human ether-a-go-gorelated gene，hERG）的突變引起[1]。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)了500 多個(gè)hERG 基因突變位點(diǎn)，其中大多為錯(cuò)義突變[2-3]，G572R 突變是其中之一。已知G572R 突變導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，突變蛋白滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜上形成有功能的離子通道，導(dǎo)致編碼的IKr電流減少和心室復(fù)極延遲。目前對(duì)LQT2 患者缺乏特異性診斷及有效治療方法。本研究探討藥物E-4031 對(duì)WT/G572R-hERG雜合型通道功能的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific 公司；轉(zhuǎn)染試劑（LipofectaminTM2000）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；兔抗hERG 多克隆抗體購(gòu)自以色列Alomone 公司；E-4031 購(gòu)自德國(guó)Calbiochem 公司；膜片鉗系統(tǒng)及分析軟件為美國(guó)Axon 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞常規(guī)用含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑提供的實(shí)驗(yàn)步驟，將2.5 μg pcDNA3-WT-hERG 質(zhì)粒和2.5 μg pcDNA3-G572R-hERG 質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，構(gòu)建WT/G572R-hERG 細(xì)胞株。同時(shí)共轉(zhuǎn)染0.8 μg綠色熒光蛋白以監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 藥物干預(yù) 構(gòu)建WT/G572R-hERG 細(xì)胞株后，將其分為兩組，觀(guān)察組加入E-4031 孵育24h，作用濃度為5 μmol/L。對(duì)照組用含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 hERG 通道蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot 法檢測(cè)兩組hERG 通道蛋白的表達(dá)。收集兩組細(xì)胞，加入預(yù)冷蛋白裂解液。取裂解上清液加樣，經(jīng)7.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜。一抗兔抗hERG 多克隆抗體1∶400 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜。二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體1∶1 000 稀釋?zhuān)覝胤跤? h，最后在化學(xué)發(fā)光成像儀中觀(guān)察拍照。

1.2.4 hERG 通道激活電流和尾電流的檢測(cè) 采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀(guān)察兩組hERG 通道激活電流和尾電流的電流幅度、半激活最大電壓和斜率因子。電極外液配方：NaCl 137 mmol/L，KCl4mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，MgCl2·6H2O 1 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，HEPES 10 mmol/L（最后加入NaOH 將pH 調(diào)至7.4）。電極內(nèi)液配方：KCl 130 mmol/L，MgCl21 mmol/L，EGTA 5 mmol/L，Mg-ATP 6 mmol/L，HEPES 10 mmol/L（最后加入KOH 將pH 調(diào)至7.2）[4-5]。灌注電極內(nèi)液后電極入水電阻為3～7 mΩ；刺激程序由Clampex 9.2 軟件和Axon 700B 放大器共同完成，信號(hào)經(jīng)過(guò)Axon 700B 放大器和A/D 轉(zhuǎn)換后儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)中。將細(xì)胞鉗制在-80 mV，測(cè)試電壓以10 mV 階躍從-60 mV 刺激到+60 mV，持續(xù)時(shí)間2 s；然后去極化到-40 mV，持續(xù)4 s；最后回到-80 mV[4-5]，記錄hERG通道激活電流和尾電流的電流幅度。對(duì)在-40 mV記錄到的尾電流經(jīng)最大電流標(biāo)準(zhǔn)化，用Boltzmann方程擬合，得出兩組半激活最大電壓和斜率因子并進(jìn)行比較。

1.2.5 hERG 通道穩(wěn)態(tài)失活電流的檢測(cè) 方法同hERG 通道激活電流和尾電流。測(cè)試電壓以10 mV階躍從-130 mV 刺激到20 mV，持續(xù)時(shí)間20 ms；然后測(cè)試電壓鉗制在20 mV 時(shí)記錄hERG 通道穩(wěn)態(tài)失活電流，經(jīng)最大電流標(biāo)準(zhǔn)化，用Boltzmann 方程擬合，得出兩組半失活最大電壓和斜率因子并進(jìn)行比較。

1.2.6 hERG 通道失活恢復(fù)電流的檢測(cè) 方法同hERG 通道激活電流和尾電流。電壓鉗制在-80 mV，復(fù)極至50 mV 使通道失活，接著以10 mV 的階躍從-30 mV 刺激到-120 mV，持續(xù)時(shí)間3 s，記錄兩組hERG 通道失活恢復(fù)電流，用單指數(shù)方程進(jìn)行擬合得到失活恢復(fù)時(shí)間常數(shù)并進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel 和Origin7.5 軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、擬合和作圖。計(jì)量資料以表示，兩樣本比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組hERG 通道蛋白表達(dá)的比較 見(jiàn)圖1。

圖1 兩組hERG 通道蛋白表達(dá)的比較（A：兩組hERG 蛋白條帶的變化，B：兩組hERG 蛋白的灰度值比較；與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

由圖1 可見(jiàn)，對(duì)照組在135 kDa 和155 kDa 出現(xiàn)兩條蛋白質(zhì)條帶，而觀(guān)察組155 kDa 的蛋白質(zhì)條帶明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 兩組hERG 通道激活電流和尾電流的電流幅度、半激活最大電壓和斜率因子的比較 見(jiàn)圖2。

由圖2 可見(jiàn)，對(duì)照組hERG 通道激活電流和尾電流的最大電流幅度分別是（219.34±28.98）pA 和（566.61±121.60）pA，而觀(guān)察組hERG 通道激活電流和尾電流的最大電流幅度分別是（416.32±90.37）pA和（897.25±92.05）pA。與對(duì)照組比較，觀(guān)察組hERG 通道激活電流和尾電流的最大電流幅度分別增加了89.81%和58.35%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外對(duì)照組尾電流擬合后半激活最大電壓和斜率因子分別是（4.51±0.41）mV 和（8.99±0.37），觀(guān)察組分別是（6.37±1.09）mV 和（10.40±0.99），兩組尾電流擬合后半激活最大電壓和斜率因子比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 兩組hERG 通道穩(wěn)態(tài)失活電流半失活最大電壓和斜率因子的比較 見(jiàn)圖3。

由圖3 可見(jiàn)，觀(guān)察組和對(duì)照組hERG 通道穩(wěn)態(tài)失活電流半失活最大電壓分別為（-83.39±1.45）mV和（-69.05±2.58）mV，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；斜率因子分別為（24.99±1.18）和（28.94±2.90），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

2.4 兩組hERG 通道電流失活恢復(fù)時(shí)間常數(shù)比較見(jiàn)圖4。

由圖4 可見(jiàn)，兩組hERG 通道電流失活恢復(fù)時(shí)間常數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

圖2 兩組hERG 通道激活電流和尾電流的電流幅度、半激活最大電壓和斜率因子的比較（A：兩組hERG 通道激活電流和尾電流圖；B：兩組激活電流的電流幅度；C：兩組尾電流的電流幅度；D：兩組尾電流經(jīng)擬合得出半激活最大電壓和斜率因子）

3 討論

LQT2 是由于hERG 基因突變引起的一組心臟離子通道病。hERG 基因編碼的蛋白是由4 個(gè)亞基組成的四聚體，每個(gè)亞基有6 個(gè)跨膜片段（S1-S6），其中S5-S6 之間的疏水性環(huán)為最保守的區(qū)域，向膜內(nèi)折疊形成離子孔道的孔區(qū)。正常的hERG 通道蛋白有兩種形式：一種是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未完全糖基化的135 kDa 大小前體；另一種是經(jīng)高爾基體復(fù)雜糖基化修飾后，插入細(xì)胞膜上的成熟的155 kDa 大小通道蛋白。G572R 錯(cuò)義突變位于hERG 通道的S5跨膜片段末端，572 位的甘氨酸被精氨酸所取代。G572R 突變發(fā)生時(shí)，突變的通道蛋白會(huì)與野生型蛋白結(jié)合形成雜合型通道（Western blot 表現(xiàn)為155 kDa和135 kDa 兩個(gè)蛋白條帶，但155 kDa 的蛋白質(zhì)條帶明顯弱于野生型細(xì)胞），滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，從而減少野生型蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)，使細(xì)胞膜上有功能的離子通道減少[6]。這些突變蛋白尤其是雜合型通道，并非功能完全喪失，若對(duì)其調(diào)控后能部分糾正或者恢復(fù)正常轉(zhuǎn)運(yùn)，仍能發(fā)揮一定的代償功能[7-9]。

藥物分子對(duì)突變蛋白的改善和糾正作用一直以來(lái)都是研究的熱點(diǎn)[10]。E-4031 屬于Ⅲ類(lèi)抗心律失常藥。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，G601S、R534C、A422T、V630L和N407D 突變，其編碼的HERG 鉀通道存在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，可以被E-4031 所部分糾正或恢復(fù)，但A561V、H562P、R752W、F805C 和R823W 突變體則不能被E-4031 所糾正[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，觀(guān)察組hERG 通道蛋白質(zhì)條帶明顯增強(qiáng)；全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，hERG 通道激活電流幅度和尾電流幅度較干預(yù)前分別增加了89.81%和58.35%?？梢?jiàn)E-4031 對(duì)G572R 突變導(dǎo)致的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)障礙起到了部分改善和糾正作用。此外，E-4031 干預(yù)使得hERG 通道穩(wěn)態(tài)失活電流的電向明顯負(fù)向移動(dòng)14.34 mV，可見(jiàn)E-4031 干預(yù)還加速了通道電流的穩(wěn)態(tài)失活速度。

對(duì)于不同的hERG 基因突變位點(diǎn)，E-4031 處理有著不同的反應(yīng)，這提示不同突變位點(diǎn)的蛋白構(gòu)象及功能缺失的機(jī)制存在不同。本研究發(fā)現(xiàn)E-4031能改善WT/G572R-hERG 通道功能。因此，通過(guò)藥物分子對(duì)HERG 通道功能的調(diào)節(jié)作用，以期從調(diào)控蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)角度，為改善HERG 通道功能提供有效方法。

圖3 兩組hERG 通道穩(wěn)態(tài)失活電流半失活最大電壓和斜率因子的比較（A：兩組hERG 通道穩(wěn)態(tài)失活電流圖；B：穩(wěn)態(tài)失活電流經(jīng)擬合得出半失活最大電壓和斜率因子）

圖4 兩組hERG 通道電流失活恢復(fù)時(shí)間常數(shù)比較（A：兩組hERG通道失活恢復(fù)電流圖；B：通道電流失活恢復(fù)時(shí)間常數(shù)圖）