唐 容 呂紅健 付 梅 蘇勝齊 姚維志

(西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,西南大學(xué)漁業(yè)資源環(huán)境研究中心,水產(chǎn)科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400716)

中華倒刺鲃(Spinibarbus sinensisBleeker),隸屬鯉科(Cyprinidae),鲃亞科(Barbinae),倒刺鲃屬(Spinibarbus),俗稱青波。中華倒刺鲃主要分布于長(zhǎng)江上游及其主要支流中,是長(zhǎng)江上游珍稀特有經(jīng)濟(jì)魚類之一[1]。近年來(lái)由于過(guò)度捕撈、環(huán)境污染、攔河建壩及產(chǎn)卵群體資源量極端匱乏等原因,中華倒刺鲃天然資源量呈逐年下降趨勢(shì)[2—4]。因此,為了恢復(fù)野生中華倒刺鲃的自然資源量,保護(hù)其分布水域的生物多樣性,并進(jìn)一步促進(jìn)漁業(yè)資源的可持續(xù)利用,已開展了多種資源養(yǎng)護(hù)措施,例如:設(shè)立水生生物自然保護(hù)區(qū)[5],開展人工培育苗種增殖放流活動(dòng)[6—11]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),長(zhǎng)江中上游每年放流的中華倒刺鲃人工培育幼魚超過(guò)40萬(wàn)尾。為了科學(xué)有效的評(píng)估中華倒刺鲃的增殖放流效果,掌握中華倒刺鲃的移動(dòng)分布規(guī)律,開展標(biāo)志放流是重要途徑,而合理的標(biāo)記方法又是標(biāo)志放流的前提。

魚類熒光標(biāo)記技術(shù)是采用熒光染料在魚體的鈣質(zhì)或骨質(zhì)結(jié)構(gòu)上形成熒光標(biāo)記的標(biāo)記技術(shù),作為一種兼具體內(nèi)和體外標(biāo)志的標(biāo)記方法,目前已被廣泛應(yīng)用于標(biāo)記軟骨魚類[12]和硬骨魚類[13],該標(biāo)記技術(shù)具有標(biāo)記費(fèi)用低,對(duì)標(biāo)記魚的存活、生長(zhǎng)和行為影響較小,標(biāo)記保存率較高,標(biāo)記易于發(fā)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)[14,15]。目前國(guó)際上經(jīng)常使用的熒光染料主要有茜素紅S(Alizarin red S,ARS)[16]、茜素絡(luò)合物(Alizarin complexone,ALC)[17]、鹽酸四環(huán)素(Tetracycline hydrochloride,TCH)[18]和鈣黃綠素(Calcein,CAL)[19]等。此外,熒光標(biāo)記方法包括直接浸泡[20]、加強(qiáng)滲透[21]、投喂[22]和注射[23]四種。雖然有以上多種可用的熒光染料和標(biāo)記方法,但熒光標(biāo)記在魚類上的應(yīng)用也僅限于使用一種熒光染料對(duì)目標(biāo)魚種進(jìn)行單一標(biāo)記,很少有人進(jìn)行過(guò)雙重標(biāo)記或三重標(biāo)記研究。此外,當(dāng)發(fā)現(xiàn)多種熒光染料適用于一個(gè)魚種,并且在同一研究中有多個(gè)該魚種的種群必須標(biāo)記和區(qū)分時(shí),雙重標(biāo)記或三重標(biāo)記將特別有用,這樣不僅能增加標(biāo)記模式(包括單一標(biāo)記、雙重標(biāo)記和三重標(biāo)記等),還能用于區(qū)分不同標(biāo)志放流群體。

本研究采用TCH和ARS對(duì)中華倒刺鲃?dòng)佐~進(jìn)行雙重?zé)晒鈽?biāo)記,考察不同濃度TCH和ARS雙重標(biāo)記對(duì)中華倒刺鲃?dòng)佐~生長(zhǎng)和存活的影響,并探討2種熒光染料對(duì)中華倒刺鲃?dòng)佐~耳石、鱗片、倒刺、鰭條和鰭棘的標(biāo)記效果,旨在為中華倒刺鲃的標(biāo)志放流提供潛在的標(biāo)記技術(shù),并進(jìn)一步增加魚類熒光標(biāo)記的標(biāo)記模式。

1 材料與方法

1.1 中華倒刺鲃實(shí)驗(yàn)幼魚

2016年3月,從重慶靜觀養(yǎng)殖場(chǎng)采集全長(zhǎng)為70—80 mm的中華倒刺鲃?dòng)佐~約300尾,將幼魚移至200 cm×100 cm(D×H)的圓柱形養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)10d,暫養(yǎng)用水為曝氣24h以上的自來(lái)水,日換水1次,換水量為10%。暫養(yǎng)期間每天的光照周期為12L﹕12D,且定時(shí)投喂兩次浮性顆粒餌料,每次投飼率為魚體重的1%。投喂1h后,測(cè)定水質(zhì)指標(biāo),并將水質(zhì)控制在水溫16.0—17.7℃,pH 6.97—7.23,溶解氧6.91—7.42 mg/L。

1.2 雙重?zé)晒鈽?biāo)記染色實(shí)驗(yàn)

先使用TCH對(duì)中華倒刺鲃?dòng)佐~進(jìn)行浸染標(biāo)記,實(shí)驗(yàn)共設(shè)6個(gè)濃度梯度,即0、100、200、300、400和500 mg/L(表1)。各濃度梯度配制40 L熒光染液,并在配制完成后強(qiáng)曝氣24h,用以提高熒光染液的pH。然后,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取40尾中華倒刺鲃?dòng)佐~,浸染24h。在浸泡完后,將標(biāo)記魚放入曝氣自來(lái)水中2h,以洗去體表殘留熒光染料。隨后將6個(gè)實(shí)驗(yàn)組標(biāo)記幼魚轉(zhuǎn)入6個(gè)裝有等體積曝氣自來(lái)水缸中繼續(xù)飼養(yǎng)72h,并統(tǒng)計(jì)急性死亡率。最后,將每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的標(biāo)記幼魚移入6個(gè)200 cm×100 cm(D×H)的圓柱形養(yǎng)殖水槽(養(yǎng)殖水體體積為1400 L,實(shí)驗(yàn)魚養(yǎng)殖密度為0.028尾/L)中飼養(yǎng)30d。此階段為養(yǎng)殖生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的第一階段(圖1),標(biāo)記幼魚的飼養(yǎng)條件與暫養(yǎng)期間相同。

表1 使用鹽酸四環(huán)素和茜素紅S雙重浸泡標(biāo)記的順序和濃度Tab.1 The order of double immersion marking and concentration sets for TCH and ARS of experimental group

圖1 雙重標(biāo)記后6個(gè)實(shí)驗(yàn)組中華倒刺鲃平均全長(zhǎng)(a)和體重(b)Fig.1 Mean total length(a)and body weight(b)of S. sinensis from six experimental groups after double fluorescent marking

在用TCH標(biāo)記30d后,使用ARS進(jìn)行相同浸染流程的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。將先前使用TCH處理的6組中華倒刺鲃?dòng)佐~,分別對(duì)應(yīng)使用濃度為0、100、150、200、250和300 mg/L的ARS染液浸染處理24h(表1)。在浸染完成后,統(tǒng)計(jì)浸染后72h內(nèi)ARS二次浸泡標(biāo)記導(dǎo)致的急性死亡率。

1.3 生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

為了評(píng)估兩次浸泡標(biāo)記后TCH和ARS對(duì)中華倒刺鲃?dòng)佐~生長(zhǎng)和存活的復(fù)合效應(yīng),從每個(gè)處理組中隨機(jī)抽取36尾魚,用于隨后持續(xù)60d的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)(即生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的第二階段,圖1)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行組(n=12),分養(yǎng)于200 cm×100 cm(D×H)的圓柱形養(yǎng)殖水槽中(養(yǎng)殖水體體積為1400 L,實(shí)驗(yàn)魚養(yǎng)殖密度為0.028尾/L),整個(gè)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中連續(xù)充氣,日換水1次,換水率為10%。每天定時(shí)投喂兩次浮性顆粒餌料,每次投飼率為魚體重的1%。投喂1h后,測(cè)定水質(zhì)指標(biāo),并將水質(zhì)控制在水溫19.4—25.9℃,pH 7.83—8.51,溶解氧6.76—7.37 mg/L,且光照周期為12L﹕12D。

在生長(zhǎng)試驗(yàn)的第一階段開始時(shí),測(cè)量所有實(shí)驗(yàn)魚的全長(zhǎng)和體重,數(shù)據(jù)分別精確到0.1 mm和0.1 g。本研究的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)共持續(xù)90d(第一階段持續(xù)30d,第二階段持續(xù)60d,在養(yǎng)殖的第30、第60和第90天測(cè)定各處理組實(shí)驗(yàn)魚的全長(zhǎng)和體重(圖1)。此外,在整個(gè)生長(zhǎng)試驗(yàn)過(guò)程中記錄每組實(shí)驗(yàn)魚的死亡率。

1.4 標(biāo)記檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

在生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,每個(gè)平行組取10尾魚(即每個(gè)實(shí)驗(yàn)組共30尾),使用200 mg/L的MS-222(tricaine-methanesulfonate)麻醉致死后,取其矢耳石、星耳石、鱗片、倒刺和鰭條(包括背鰭、胸鰭、腹鰭、臀鰭和尾鰭)及鰭棘(包括背鰭、胸鰭、腹鰭和臀鰭)。本研究所取樣本在清洗干凈后在室溫下避光保存,并在取樣20d內(nèi)完成標(biāo)記檢測(cè)。

使用裝有Leica DFC 495高分辨率數(shù)碼相機(jī)的Leica DM IL LED熒光顯微鏡和Leica EL6000Comp體式顯微鏡對(duì)所取樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記檢測(cè)(表2)。標(biāo)記效果參照Liu等[24]的方法。將熒光標(biāo)記清晰度劃分為0至5的6個(gè)等級(jí)。將標(biāo)記質(zhì)量用n表示,當(dāng)n≥2時(shí),記作可接受標(biāo)記,即標(biāo)記質(zhì)量較好。為保證標(biāo)記等級(jí)劃分的準(zhǔn)確,所取樣品需由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的觀察者獨(dú)立觀察分析,如果結(jié)果不一致時(shí)需由第3位觀察者確定。在鑒定標(biāo)志效果期間,所有的樣品均未進(jìn)行打磨和拋光。

表2 用于檢測(cè)鹽酸四環(huán)素和茜素紅S標(biāo)記的雙色鏡和濾光片組合Tab.2 Dichromatic mirror and filter combination wavelength for visualizing TCH and ARS marks

1.5 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 19.0和Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,每尾中華倒刺鲃?dòng)佐~的標(biāo)記質(zhì)量、全長(zhǎng)及體重?cái)?shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE)表示。最終采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)進(jìn)行處理組與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)魚死亡率、全長(zhǎng)及體重的差異顯著性分析,設(shè)定差異顯著性水平P為0.05,當(dāng)P≤0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 熒光標(biāo)記對(duì)中華倒刺鲃?dòng)佐~存活和生長(zhǎng)的影響

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中各處理組標(biāo)記魚與對(duì)照組在兩次24h的浸染過(guò)程中,及浸染后72h的觀察期間均未出現(xiàn)死亡個(gè)體。在90d的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)期間,6個(gè)實(shí)驗(yàn)組也未出現(xiàn)死亡個(gè)體,各實(shí)驗(yàn)組之間的死亡率均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。經(jīng)單因素方差分析表明,處理組與對(duì)照組在0、30d、60d、90d養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)過(guò)程中全長(zhǎng)、體重也無(wú)顯著性差異(P＞0.05,圖1)。

圖2 TCH和ARS熒光染料對(duì)中華倒刺鲃?dòng)佐~矢耳石(a)和星耳石(b)的標(biāo)記質(zhì)量Fig.2 The mark quality of TCH and ARS fluorochrome dyes on the sagittae(a)and asteriscus(b)of S. sinensis

2.2 內(nèi)部骨質(zhì)結(jié)構(gòu)標(biāo)記效果

在本研究中,經(jīng)各濃度TCH和ARS標(biāo)記過(guò)的矢耳石(圖2和圖3)和星耳石(圖2和圖4)上均檢測(cè)到熒光標(biāo)記。將TCH和ARS標(biāo)記過(guò)的各內(nèi)部骨質(zhì)結(jié)構(gòu)樣品置于熒光顯微鏡下觀察,在藍(lán)光照射下有兩種熒光標(biāo)記,分別是由TCH標(biāo)記產(chǎn)生的黃色熒光環(huán)和由ARS標(biāo)記產(chǎn)生的紅色熒光環(huán),且黃色熒光環(huán)比紅色熒光環(huán)更接近于耳石(包括星耳石和矢耳石)的內(nèi)部(圖3)。而在綠光照射下僅發(fā)現(xiàn)ARS標(biāo)記產(chǎn)生的紅色熒光環(huán),且該紅色熒光環(huán)比藍(lán)光照射下的更明亮(圖3)。此外,在浸染24h后,較高濃度處理組的矢耳石(≥300 mg/L TCH和≥150 mg/L ARS)和星耳石(≥300 mg/L TCH 和 ≥200 mg/L ARS)中均能檢測(cè)到明顯的標(biāo)記環(huán)(n≥2)。結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的矢耳石和星耳石都具有可接受的TCH和ARS標(biāo)記。

2.3 外部骨質(zhì)結(jié)構(gòu)標(biāo)記效果

本研究結(jié)果顯示,各對(duì)照組魚體的各類外部骨質(zhì)結(jié)構(gòu)(鱗片、倒刺、鰭條和鰭棘)中均檢測(cè)到熒光標(biāo)記。同上述內(nèi)部骨質(zhì)結(jié)構(gòu)結(jié)果類似,將TCH和ARS標(biāo)記過(guò)的各外部骨質(zhì)結(jié)構(gòu)樣品置于熒光顯微鏡下觀察,在藍(lán)光照射下有兩種熒光標(biāo)記,分別是由TCH標(biāo)記產(chǎn)生的黃色熒光環(huán)和由ARS標(biāo)記產(chǎn)生的紅色熒光環(huán),且黃色熒光環(huán)比紅色熒光環(huán)更接近于外部骨質(zhì)結(jié)構(gòu)(包括倒刺、鰭條和鰭棘)的內(nèi)部。而在綠光照射下僅發(fā)現(xiàn)ARS標(biāo)記產(chǎn)生的紅色熒光環(huán),且該紅色熒光環(huán)比藍(lán)光照射下的更明亮(圖5、圖6和圖7)。

圖3 不同光源下中華倒刺鲃?dòng)佐~矢耳石的雙重?zé)晒鈽?biāo)記效果Fig.3 The effect of double fluorescent marking in sagittae of S. sinensis larval observed with different light sources

圖4 不同光源下中華倒刺鲃?dòng)佐~星耳石的雙重?zé)晒鈽?biāo)記效果Fig.4 The effect of double fluorescent marking in asteriscus of S. sinensis larval observed with different light sources

除100—300 mg/L TCH和100 mg/L ARS處理的側(cè)線鱗外,及100—300 mg/L TCH和100、150 mg/L ARS處理的非側(cè)線鱗外,在其余幾個(gè)處理組的側(cè)線鱗和非側(cè)線鱗上均能觀察到環(huán)形標(biāo)記,但是這些鱗片的熒光標(biāo)記效果并不明顯(0≤n≤1,圖8)。

經(jīng)400—500 mg/L TCH和150—300 mg/L ARS處理的倒刺中可以同時(shí)檢測(cè)到TCH和ARS的熒光標(biāo)記(n≥2,圖9)。結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組Ⅴ、Ⅵ的倒刺都具有可接受的TCH和ARS標(biāo)記(圖9)。

經(jīng)200—500 mg/L TCH和150—300 mg/L ARS處理的鰭條(包括背鰭、胸鰭、腹鰭、臀鰭和尾鰭),及經(jīng)300—500 mg/L TCH和200—300 mg/L ARS處理的鰭棘(除ARS濃度為100 mg/L處理后的腹鰭外)中均可以同時(shí)檢測(cè)到TCH和ARS的標(biāo)記環(huán)(n≥2,圖10和圖11)。結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的鰭條和實(shí)驗(yàn)組Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的鰭棘都具有可接受的TCH和ARS標(biāo)記。

圖5 不同光源下中華倒刺鲃?dòng)佐~倒刺的雙重?zé)晒鈽?biāo)記效果Fig.5 The effect of double fluorescent marking in barb of S. sinensis larval observed with different light sources

圖6 不同光源下中華倒刺鲃?dòng)佐~背鰭的雙重?zé)晒鈽?biāo)記效果Fig.6 The effect of double fluorescent marking in dorsal fin ray of S. sinensis larval observed with different light sources

最后,本研究中所有TCH和ARS雙重浸染處理的耳石、鱗片、倒刺、鰭條和鰭棘中均未觀察到肉眼可見(jiàn)的熒光標(biāo)記(即n＜4)。

3 討論

3.1 雙重?zé)晒鈽?biāo)記對(duì)實(shí)驗(yàn)幼魚存活與生長(zhǎng)的影響

一般而言,熒光染料對(duì)標(biāo)記動(dòng)物生長(zhǎng)和存活率的影響是衡量標(biāo)記適用性的一項(xiàng)重要指標(biāo)[25]。在2次24h浸染標(biāo)記過(guò)程中,72h標(biāo)記后的觀察期間,及90d的飼養(yǎng)期間各實(shí)驗(yàn)組存活率均為100%,養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)期間處理組與對(duì)照組的體重和全長(zhǎng)無(wú)顯著性差異(P＞0.05),這與采用TCH和ARS浸染標(biāo)記其他魚類(包括單一標(biāo)記[26]和雙重標(biāo)記[27])的研究結(jié)果保持一致。但是,Beckman和Schulz[12]研究發(fā)現(xiàn),使用較高的濃度染料或增加對(duì)魚類的浸染時(shí)間,會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記魚的死亡率在浸染期間及浸染后升高,從而降低標(biāo)記成功率。Liu等[24]認(rèn)為這些差異不僅是由高濃度染料和長(zhǎng)時(shí)間浸染造成的,還可能與標(biāo)記個(gè)體處于不同的生命階段有關(guān)。本研究結(jié)果表明,適宜濃度下TCH(濃度為100—500 mg/L)和ARS(濃度為100—300 mg/L)標(biāo)記對(duì)后續(xù)中華倒刺鲃?dòng)佐~(全長(zhǎng)為70—80 mm)生長(zhǎng)和存活均沒(méi)有顯著影響。

3.2 雙重?zé)晒鈽?biāo)記對(duì)不同骨質(zhì)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記效果與保持率

在熒光顯微鏡下觀察各類骨質(zhì)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記效果,結(jié)果顯示所有處理組側(cè)線鱗和非側(cè)線鱗的標(biāo)記效果較差(0≤n≤1),這與劉奇[28]使用ARS對(duì)褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)進(jìn)行標(biāo)記時(shí),產(chǎn)生的標(biāo)記效果基本一致。對(duì)比相同濃度下矢耳石和星耳石的雙重標(biāo)記效果,結(jié)果顯示矢耳石和星耳石的雙重標(biāo)記效果差別較小,這與付自東等[29]使用ALC標(biāo)記胭脂魚(Myxocyprinus asiaticus)耳石和何春林等[30]使用ALC和TCH標(biāo)記重口裂腹魚(Schizothorax davidi)耳石的研究結(jié)論有些出入,這可能與熒光染料種類、標(biāo)記魚體的生理階段、代謝速度及耳石形態(tài)等有關(guān)。此外,在較高濃度下浸泡的矢耳石、星耳石、倒刺、鰭條和鰭棘中均能檢測(cè)到明顯的標(biāo)記環(huán)(n≥2)。但是在透射光下,所有處理組被觀察的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)中均無(wú)肉眼可見(jiàn)的熒光標(biāo)記(即n＜4),這與Lü等[31]、劉巖等[32]的研究結(jié)果不同,Lü等[31]認(rèn)為要形成肉眼可見(jiàn)的標(biāo)記需要同時(shí)具備高劑量的染料、較長(zhǎng)的浸染時(shí)間、海水環(huán)境及相對(duì)穩(wěn)定的pH等多個(gè)條件。在不同物種間產(chǎn)生最佳標(biāo)記效果所需的染料濃度和浸染時(shí)間是不同的。因此,本研究透射光下缺乏可見(jiàn)標(biāo)記可能是由于魚類物種差異或淡水和海水環(huán)境之間的差異造成的。

圖7 不同光源下中華倒刺鲃?dòng)佐~背棘的雙重?zé)晒鈽?biāo)記效果Fig.7 The effect of double fluorescent marking in dorsal fin spine of S. sinensis larval observed with different light sources

圖8 TCH和ARS熒光染料對(duì)中華倒刺鲃?dòng)佐~側(cè)線鱗(a)和非測(cè)線鱗(b)的標(biāo)記質(zhì)量Fig.8 The mark quality of TCH and ARS fluorochrome dyes on the lateral line(a)and non-lateral line scales(b)of S. sinensis

圖9 TCH和ARS熒光染料對(duì)中華倒刺鲃?dòng)佐~倒刺的標(biāo)記質(zhì)量Fig.9 The mark quality of TCH and ARS fluorochrome dyes on the barbs of S. sinensis

能否通過(guò)標(biāo)記方法成功地評(píng)估魚類的增殖放流效果,關(guān)鍵在于是否能保證標(biāo)記的高保持率,以及在標(biāo)記過(guò)程中和放流后的低死亡率[24]。因此,標(biāo)記的保留時(shí)間是評(píng)價(jià)標(biāo)記適用性的另一項(xiàng)重要指標(biāo)[33]。Bashey[34]認(rèn)為不同保留時(shí)間可能與不同骨質(zhì)結(jié)構(gòu)、個(gè)體代謝差異、標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)(如打磨、拋光)以及環(huán)境因子(如高溫、陽(yáng)光)等有關(guān)。劉巖等[32]使用ARS對(duì)黑鯛幼魚進(jìn)行標(biāo)記并對(duì)其暫養(yǎng)2個(gè)月后,發(fā)現(xiàn)黑鯛幼魚的硬骨組織仍能保持清晰、肉眼可見(jiàn)的紫色標(biāo)記。Reinert等[35]研究發(fā)現(xiàn)條紋鱸(Morone saxatilis)耳石上的氧四環(huán)素(oxytetracycline,OTC)標(biāo)記可以持續(xù)保留3年。本研究結(jié)果顯示,在使用TCH標(biāo)記后的90d(即使用ARS標(biāo)記后的60d),除部分鱗片外,在其他被分析的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)上形成的熒光標(biāo)記仍然清晰可見(jiàn)。因此,可以推測(cè),TCH和ARS對(duì)中華倒刺鲃?dòng)佐~的雙重標(biāo)記保持時(shí)間較長(zhǎng),該標(biāo)記方法可用于中華倒刺鲃?dòng)佐~的標(biāo)志放流和增殖效果評(píng)估,為區(qū)分不同標(biāo)記放流群體提供了一定的技術(shù)手段。

圖10 TCH和ARS熒光染料對(duì)中華倒刺鲃?dòng)佐~背鰭(a)、胸鰭(b)、腹鰭(c)、臀鰭(d)和尾鰭(e)的標(biāo)記質(zhì)量Fig.10 The mark quality of TCH and ARS fluorochrome dyes on the dorsal(a),pectoral(b),ventral(c),anal(d)and caudal(e)fin rays of S. sinensis

3.3 雙重?zé)晒鈽?biāo)記的可行性和潛在應(yīng)用

近年來(lái),由于放流的苗種數(shù)量多、規(guī)模大,往往需要進(jìn)行大規(guī)模的標(biāo)志放流,熒光染料浸泡標(biāo)記魚類是其中最常用的方法。該方法不僅能在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)魚苗的大規(guī)模標(biāo)記,還能最大限度地降低人為操作對(duì)魚苗造成的傷害[29]。然而使用這種傳統(tǒng)的熒光染料浸泡標(biāo)記法來(lái)標(biāo)記魚類,可能難以區(qū)分被回捕標(biāo)記的多個(gè)同種魚類的放流群體。因此,對(duì)這一標(biāo)記方法的改進(jìn)以及對(duì)標(biāo)記模式的創(chuàng)新顯得尤其迫切。本研究結(jié)果表明,使用TCH和ARS兩種染料雙重浸泡標(biāo)記中華倒刺鲃?dòng)佐~效果良好。除處理組Ⅱ的側(cè)線鱗和處理組Ⅱ、Ⅲ的非側(cè)線鱗外(0≤n≤1),所有被分析的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)中均能檢測(cè)到熒光標(biāo)記(n≥2)。TCH標(biāo)記90d(即使用ARS標(biāo)記后的60d)后,除部分鱗片外,在其他的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)均具有高的保持率,可見(jiàn)使用TCH和ARS對(duì)中華倒刺鲃?dòng)佐~進(jìn)行快速、簡(jiǎn)便的雙重?zé)晒鈽?biāo)記是可行的?；谝陨辖Y(jié)果,可以推測(cè)TCH和ARS除了適用于雙重標(biāo)記中華倒刺鲃外,還可以用于單一標(biāo)記或三重標(biāo)記,并且有12種潛在的標(biāo)記類型,包括單一標(biāo)記(2種),雙重標(biāo)記(4種)和三重標(biāo)記(6種)。Tsukamoto[27]也曾提出當(dāng)只有一種或兩種熒光染料可用時(shí),雙重標(biāo)記或三重標(biāo)記能夠成為魚類標(biāo)記的新模式,同時(shí)還能確定上一次魚體被標(biāo)記時(shí)的大小。

圖11 TCH和ARS熒光染料對(duì)中華倒刺鲃?dòng)佐~背棘(a)、胸棘(b)、腹棘(c)和臀棘(d)的標(biāo)記質(zhì)量Fig.11 The mark quality of TCH and ARS fluorochrome dyes on the dorsal(a),pectoral(b),ventral(c)and anal(d)fin spines fin rays of S. sinensis

3.4 熒光標(biāo)記的局限性

近年來(lái),熒光染料浸染標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于魚類增殖放流效果評(píng)估中。在大多數(shù)用于魚類和水生無(wú)脊椎動(dòng)物的增殖放流的熒光標(biāo)記方案中,僅對(duì)放流群體的生長(zhǎng)和存活率進(jìn)行了評(píng)估。Tsukamoto[26]指出熒光染料對(duì)標(biāo)記生物體沒(méi)有持久不利的影響。即使采用雙重浸染熒光標(biāo)記,當(dāng)前研究的結(jié)論也支持這一觀點(diǎn)。但是,Bumguardner和King[36]研究發(fā)現(xiàn),使用較高濃度OTC和CAL浸染標(biāo)記條紋鱸,結(jié)果會(huì)對(duì)其產(chǎn)生較大的毒性。此外,少數(shù)研究也已經(jīng)報(bào)道了熒光染料標(biāo)記具有潛在的不利影響,Meyer等[37]使用ALC對(duì)早期生命階段的波羅的海鱈(Gadus morhua)進(jìn)行批次標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)標(biāo)記物不僅會(huì)對(duì)鱈存活率產(chǎn)生顯著的急性影響,而且還會(huì)對(duì)其他重要參數(shù)(如生長(zhǎng))具有亞致死作用。基于這些研究,Lü等[31]推斷熒光染料的毒性跟染料種類、染料濃度、魚的生命階段及環(huán)境因子(如溫度)等有關(guān)。本研究采用TCH和ARS對(duì)中華倒刺鲃進(jìn)行雙重浸染標(biāo)記,兩種熒光標(biāo)記的保留時(shí)間分別為90d和60d。對(duì)于熒光標(biāo)記,標(biāo)記保留時(shí)間的延長(zhǎng)也意味著相應(yīng)結(jié)構(gòu)中熒光染料殘留的時(shí)間延長(zhǎng)。因此,魚類組織中熒光染料的化學(xué)殘留物(如鱗片、肌肉、血液、肝臟和腎臟)可能會(huì)影響到食品安全。特別是對(duì)于一些經(jīng)濟(jì)魚類而言。到目前為止,盡管已經(jīng)有研究者對(duì)魚體內(nèi)熒光染料的代謝進(jìn)行檢測(cè),但是關(guān)于檢測(cè)不同魚類組織中CAL、ALC、ARS、TCH和OTC等熒光染料殘留的文獻(xiàn)報(bào)道甚少。綜上所述,在未來(lái)的研究中,使用熒光標(biāo)記前必須先研究熒光染料對(duì)目標(biāo)標(biāo)記魚的毒性,并進(jìn)一步量化熒光染料在魚體組織中的代謝速度和殘留量。

綜上所述,TCH和ARS的雙重浸染適用于中華倒刺鲃?dòng)佐~的大批量標(biāo)記,我們推薦把TCH和ARS的單一或雙重浸染作為中華倒刺鲃?dòng)佐~的一種標(biāo)記手段。此外,除部分鱗片以外,熒光染料對(duì)倒刺、鰭條和鰭棘的標(biāo)記效果良好,可以在不殺死標(biāo)記魚的情況下獲得標(biāo)記信息,這些標(biāo)記將會(huì)在生物標(biāo)記實(shí)驗(yàn)或增殖放流標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮重要作用。但是出于對(duì)食品安全的考慮,在未來(lái)的研究中,使用TCH和ARS標(biāo)記評(píng)估中華倒刺鲃增殖放流的項(xiàng)目成功之前,應(yīng)先對(duì)熒光染料的毒性進(jìn)行研究,并且需要進(jìn)一步量化組織中熒光染料的殘留量和研究熒光染料在標(biāo)記魚體內(nèi)的代謝情況。