占江凡 裴宏謙 李科靜 皮 杰 曾 聰 李德亮

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410128;2.湖南應(yīng)用技術(shù)學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院,常德 415000)

蜆屬(Corbicula)貝類(簡(jiǎn)稱蜆)原產(chǎn)于亞洲、非洲、澳洲和中東地區(qū),自 1924 年首次在不列顛哥倫比亞省溫哥華島被發(fā)現(xiàn)后[1,2],逐步開始在北美、南美和歐洲大陸迅速擴(kuò)散[3—6]。目前蜆已經(jīng)成為廣布世界各地咸淡水水域的底棲動(dòng)物優(yōu)勢(shì)類群,且對(duì)入侵地的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)均造成嚴(yán)重危害[7]。但由于形態(tài)的多樣性和高度可塑性,導(dǎo)致蜆屬的分類仍未得到準(zhǔn)確厘定[5,8—10],蜆屬基于形態(tài)的分類體系中被證實(shí)存在大量同物異名種[11,12],亟需更為準(zhǔn)確和有效的分類鑒定方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,以傳統(tǒng)形態(tài)分類方法為基礎(chǔ),采用基于DNA 條形碼的系統(tǒng)分類方法,結(jié)合倍性、生殖方式等基礎(chǔ)生物學(xué)特征的綜合方法被認(rèn)為是準(zhǔn)確厘定蜆屬分類的最有效方法[13,14]。

入侵地蜆的形態(tài)和遺傳多樣性均顯著地低于原產(chǎn)地[4,15]。歐洲和美洲均分布有三種形態(tài)的蜆,分別為形態(tài) R、Rlc、S 及形態(tài) A、B、C。形態(tài) R 與A、S 與 C 蜆?lè)謩e共有相同的線粒體COⅠ基因單倍型,形態(tài) Rlc 和 B 蜆COⅠ基因單倍型僅相差 1個(gè)堿基[15]。因在基于COⅠ基因單倍型構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中,形態(tài) R 與 A、Rlc 與 B 及 S 與 C 蜆聚成相互獨(dú)立的三支而分別被稱為譜系 RA、RlcB、SC[15]。分別采用線粒體COⅠ基因標(biāo)記和 Cytb基因標(biāo)記對(duì)洞庭湖區(qū)蜆屬進(jìn)行系統(tǒng)分類,均證實(shí)譜系RA 和 RlcB 共存于洞庭湖區(qū),且不同譜系蜆殼長(zhǎng)、殼寬和和高之間沒(méi)有顯著差異[16,17]。洞庭湖[17]和洪澤湖[18,19]流域河蜆的遺傳多樣性要顯著地高于歐美等入侵地國(guó)家。這種遺傳多樣性的差異推測(cè)主要是由生殖方式的差異所造成[14,17,20]。

蜆存在雌雄同體和雌雄異體兩種性別系統(tǒng),其中入侵地蜆均為雌雄同體,通過(guò)自體或異體受精營(yíng)無(wú)性生殖(專性雄核生殖),而原產(chǎn)地蜆則雌雄同體和雌雄異體共存,且兩性生殖與無(wú)性生殖共存[5,21]。我國(guó)蜆屬貝類性別特征存在較大的地域差異性。黃河三角洲徒駭河[22]的河蜆為雌雄異體。遼寧大洋河河蜆在性別分化尚未完全時(shí)有少量雌雄同體,性成熟后完全是雌雄異體且性比為1﹕1[23]。淀山湖[24]、珠江[25]和修河[26]以雌雄異體為主,并存雌雄同體個(gè)體。但洞庭湖[17]、大通湖[27]、湘江支流撈刀河[20]、贛江[26]及太湖流域的麻漾[28]卻均以雌雄同體為主,并存一定比例的雄性和雌性個(gè)體。此外,閩江河蜆為雌雄同體和雄性個(gè)體共存[29]。蜆屬貝類的倍性具有多態(tài)性,存在有二倍體、三倍體和四倍體三種倍性[30—32]。黃勤通過(guò)分析比較發(fā)現(xiàn),雖然均棲息于淡水生境,但福州閩江河蜆為二倍體且雌雄異體,日本的(C. leana)則為三倍體且雌雄同體,而棲息于海水生境的日本蜆C. japonica為二倍體,雌雄異體[33]。此外,蜆屬貝類的譜系、倍性和性別特征之間的關(guān)系尚未有全面的分析和報(bào)道,而這些問(wèn)題的梳理對(duì)于全面厘定蜆屬的系統(tǒng)分類,掌握其生殖特征具有重要意義。

本研究以沅江常德段蜆為研究對(duì)象,采用線粒體COⅠ基因標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行譜系構(gòu)建,分析其形態(tài)、倍性、性別和遺傳多樣性特征,重點(diǎn)梳理譜系與上述特征之間的關(guān)系,以期為蜆屬的系統(tǒng)分類和生殖特征研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 形態(tài)測(cè)量

蜆采集于洞庭湖支流-沅江常德鼎城區(qū)段(111.693°E,28.987°N)。樣品殼長(zhǎng)(SL)、殼寬(SW)和殼高(SH)采用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量。分離外殼與軟組織后,用電子天平稱量外殼濕重(W),剪取少量外套膜、性腺和閉殼肌用于后續(xù)分析。

1.2 COⅠ基因擴(kuò)增

采用組織基因組 DNA 提取試劑盒提取新鮮樣品外套膜 DNA,測(cè)定其光密度,確定其濃度后,保存于-20℃ 條件備用。COⅠ基因序列擴(kuò)增采用通用引物 LCO 1490和HCO 2198[34]。PCR 反應(yīng)體系為 20 μL,包括:DNA模板1 μL(100 ng/μL),上下游引物各 1 μL(10 μmoL/L),PCR Mix 10 μL,ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min;94℃ 變性 1min,52℃退火45s,72℃延伸1min,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳確定為目的產(chǎn)物,純化回收送公司測(cè)序。

1.3 性別與倍性鑒定

Bouin’s 固定液保存的性腺標(biāo)本,經(jīng)酒精脫水、二甲苯透明及透蠟,于石蠟包埋和切片,HE 染色后封片,鏡檢,以確定其性別[20]。新鮮閉殼肌放入 DAPI 染料,震蕩后靜置幾分鐘,過(guò)濾,濾液用流氏細(xì)胞儀(Sysmex)測(cè)相對(duì) DNA 含量,以判斷其倍性。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

參考GenBank中其他蜆屬貝類COⅠ基因序列,使用 Geneious R11軟件[35]對(duì)測(cè)序所得序列進(jìn)行編輯、排序、校對(duì)。采用MEGA6.0軟件[36]中的Clustal W軟件包對(duì)校正后的序列(526 bp)進(jìn)行多重比對(duì),以Corbiculasp.H7COⅠ基因序列(Gen-Bank 登錄號(hào):KT373825)作為譜系構(gòu)建的外類群,采用Geneious R11構(gòu)建基于最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)單倍型進(jìn)化樹(迭代數(shù) 200 萬(wàn))。采用DNASP 5.0軟件[37]分析序列的單倍型數(shù)(H),并計(jì)算種群的單倍型變異位點(diǎn)數(shù)(S)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)和平均核苷酸差異數(shù)(k)。運(yùn)用SPSS中的交叉表及Pearson卡方檢驗(yàn),分別分析性腺、譜系及倍性之間的相關(guān)性。形態(tài)參數(shù)之間的比較采用以殼重為協(xié)變量的協(xié)方差分析方法,殼長(zhǎng)、殼寬和殼高校正后的數(shù)據(jù),以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 譜系聚類

經(jīng)分析,99 條COⅠ基因序列中存在12 個(gè)單倍型,共有 17 個(gè)變異位點(diǎn)(表1),單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)分別為 0.599、0.01236 和 6.503?；谧畲笏迫环ê拓惾~斯法構(gòu)建的單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹中,單倍型 1、4、5、6、7、10、12 聚為獨(dú)立的一支,單倍型 2、3、8、9、11 聚類為另一支,分別為對(duì)應(yīng)已報(bào)道的譜系 RlcB和譜系 RA。外源單倍型 KT373825 聚為獨(dú)立的一支,對(duì)應(yīng)譜系 SC(圖1)。

2.2 倍性與性別特征

99 個(gè)樣品中有二倍體 50 個(gè)、三倍體 49 個(gè),雌雄同體 71 個(gè)、雌性 21 個(gè)、雄性 7 個(gè)。譜系 RA中雌雄同體、雌性和雄性蜆?lè)謩e為 51、15、1,而譜系RlcB 中分別為 20、6、6;三倍體雌雄同體、雌性和雄性個(gè)體分別為 33、17、1,而二倍體分別為38、5、6(圖2)?？ǚ綑z驗(yàn)發(fā)現(xiàn),譜系與性別(P=0.004)及倍性與性別(P=0.005)之間均存在顯著的相關(guān)性。

2.3 群體形態(tài)特征

所分析蜆的殼重、殼長(zhǎng)、殼寬和殼高分別為1.63—5.45 g、20.07—32.96 mm、18.61—30.56 mm、13.28—19.16 mm(表2)。協(xié)方差分析顯示,三倍體蜆的殼長(zhǎng)和殼高均顯著大于二倍體,不同性別蜆的殼寬和殼高之間存在顯著差異(P＜0.05)。此外,不同譜系、倍性和性別蜆的殼長(zhǎng)、殼寬和殼高之間差異不顯著(P＞0.05)。

表1 12 種 COⅠ單倍型和外類群參考序列(KT373825)的核苷酸變異位點(diǎn)Tab.1 Variable nucleotide sites of 12 mitochondrial COⅠ haplotypes and outgroup reference sequence(GeneBank:KT373825)

圖1 基于最大似然法(左)和貝葉斯法(右)構(gòu)建的COⅠ基因單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹(支持率在各節(jié)點(diǎn)附近顯示)Fig.1 Phylogenetic trees for the mt COⅠhaplotypes based on the Maximum Likelihood(left)and Bayesian Inference(right,support values are showed next to the nodes)

2.4 群體遺傳多樣性

譜系RlcB的單倍型數(shù)、變異位點(diǎn)數(shù)、單倍型多樣性、核苷酸多樣和平均核苷酸變異數(shù)均高于譜系RA。三倍體的單倍型和變異位點(diǎn)低于二倍體,但其單倍型多樣性、核苷酸多樣性及平均核苷酸變異均高于二倍體。雌性蜆的核苷酸變異位點(diǎn)、核苷酸多樣性及平均核苷酸差異數(shù)均高于雌雄同體和雄性個(gè)體,但雌雄同體單倍型最多,雄性的單倍型多樣性最高(表3)。

3 討論

3.1 蜆的譜系與形態(tài)

作為原產(chǎn)地,亞洲的蜆根據(jù)以COⅠ標(biāo)記所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹,可以分為淡水和海水兩個(gè)類群,且在淡水類群中譜系 SubcladeA和B的蜆具有更廣泛的分布水域[11]。在入侵地北美、南美和歐洲,基于COⅠ標(biāo)記的系統(tǒng)進(jìn)化樹將蜆聚類為三個(gè)分支,分別對(duì)應(yīng)譜系RA、RlcB和SC[14,38]。原產(chǎn)地蜆的譜系SubcladeA和B分別對(duì)應(yīng)入侵地譜系RA和RlcB。本研究進(jìn)一步證實(shí)了譜系RA和RlcB分布區(qū)域的廣泛性[11],同時(shí)也再次證實(shí)采用COⅠ標(biāo)記[16]和采用 Cytb標(biāo)記[17]在洞庭湖蜆中的研究結(jié)果,即譜系RA和RlcB共存于洞庭湖區(qū)。入侵地不同蜆的形態(tài)特征特異,譜系 RA、RlcB和SC蜆在美洲的形態(tài)分別為A、B、C,而在歐洲分別對(duì)應(yīng)形態(tài)R、Rlc、S[5,39]。洞庭湖區(qū)兩種不同譜系蜆的殼長(zhǎng)、殼高和殼寬之間沒(méi)有顯著差異,進(jìn)一步證實(shí)之前的結(jié)果[16,17]。形態(tài)的高度多樣性和可塑性對(duì)采用傳統(tǒng)形態(tài)特征對(duì)蜆屬進(jìn)行分類帶來(lái)極大的困難,也使得以傳統(tǒng)形態(tài)分類為基礎(chǔ),采用基于 DNA 條形碼的系統(tǒng)分類方法,結(jié)合倍性、生殖方式等基礎(chǔ)生物學(xué)特征的綜合方法被認(rèn)為是準(zhǔn)確厘定蜆屬分類的最有效方法[13,14]。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)三倍體蜆的殼長(zhǎng)和殼高均顯著高于二倍體。三倍體較二倍體具有顯著生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的現(xiàn)象在魚類等高等脊椎動(dòng)物中非常常見(jiàn)[40],但這種因生殖不育給三倍體帶來(lái)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的機(jī)制似乎在蜆中并不適用,因?yàn)槿扼w蜆無(wú)論是雌性、雄性還是雌雄同體均可參與生殖。因此,其確切機(jī)制還有待與進(jìn)一步研究。

圖2 不同譜系和倍性蜆的性別組成Fig.2 Sex composition of different lineages and ploidies of Corbicula clams

3.2 蜆的譜系與性別

雖然蜆已經(jīng)成為廣布世界各地咸淡水水域的底棲動(dòng)物優(yōu)勢(shì)類群,但其性別的分布具有較大地域差異。入侵地蜆均為雌雄同體且營(yíng)無(wú)性的雄核生殖,原產(chǎn)地蜆則存在雌雄異體和雌雄同體兩種性別體系,且兩性生殖和無(wú)性生殖共存[5,21]。Corbicula sandai和C. japonica均是雌雄異體且營(yíng)兩性生殖,前者僅分布日本的琵琶(Biwa)湖,后者分布于東亞的咸淡水水域,另有少量的兩性蜆?lè)植加谟《饶嵛鱽哰41,42]。我國(guó)黃河三角洲徒駭河[22]的河蜆為雌雄異體。遼寧大洋河河蜆在性別分化尚未完全時(shí)有少量雌雄同體,性成熟后完全是雌雄異體且性別為 1﹕1[23]。淀山湖、珠江、修河以雌雄異體為主,并存雌雄同體個(gè)體[24—26]。繁殖季節(jié)洪澤湖河蜆均為雌雄異體[43],但也發(fā)現(xiàn)及少量雌雄同體[44]。但長(zhǎng)江中游流域洞庭湖[17]、大通湖[27]、湘江支流撈刀河[20]、贛江[26],長(zhǎng)江下游太湖流域的麻漾[28]卻均以雌雄同體個(gè)體為主,并存一定比例的兩性個(gè)體。此外,閩江河蜆則為雌雄同體和雄性個(gè)體共存[29]。Miyazaki[45]認(rèn)為蜆屬貝類的性別特征與其棲息生境密切相關(guān),并將蜆屬貝類分為三類:淡水生雌雄異體、淡水生雌雄同體和海水生雌雄異體。本研究結(jié)果顯示,洞庭湖區(qū)蜆屬于淡水生雌雄同體和雌雄異體共存類型,且譜系與性別之間存在顯著的相關(guān)性,但該相關(guān)性主要體現(xiàn)在性別比例方面,也不足以作為區(qū)分譜系的主要生物學(xué)特征。此外,蜆屬貝類的倍性與性別或生殖方式之間的相關(guān)性也有報(bào)道,即所有的二倍體均為雌雄異體,營(yíng)有性生殖,而營(yíng)無(wú)性生殖的蜆則二倍體、三倍體和四倍體均存在[5,15]。洞庭湖區(qū)蜆的倍性與性別之間具有顯著的相關(guān)性,但不同倍性的生殖方式還有待于進(jìn)一步地研究。

表2 蜆的殼重及矯正后的形態(tài)參數(shù)Tab.2 The shell weight and adjusted morphological parameters of Corbicula clams

3.3 蜆的譜系與倍性

美洲和歐洲等入侵地三個(gè)譜系(RA、RlcB和SC)的蜆均為三倍體,而原產(chǎn)地蜆的倍性具有多樣性。日本的C. sandai和C. japonica均為二倍體且營(yíng)兩性生殖,C. flumilea既有二倍體,也有三倍體,C.leana的雄性個(gè)體為二倍體,雌雄同體為三倍體[46]。我國(guó)福建閩江的河蜆為二倍體,但四川省安岳縣溪流中的河蜆三倍體和四倍體共存,這也是目前國(guó)際上唯一的四倍體蜆的報(bào)道[31]。沅水99個(gè)樣品中發(fā)現(xiàn)二倍體50個(gè)、三倍體49個(gè),表明二倍體和三倍體蜆共存于洞庭湖區(qū),但譜系與倍性之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性。因此,倍性也不適合作為區(qū)分洞庭湖區(qū)不同譜系蜆的生物學(xué)特征。黃勤[33]通過(guò)分析和比較日本C. japonica(2n=38)、C. leana(3n=54)和福建閩江河蜆C. fluminea(2n=36)的核型,推測(cè)三種蜆之間存在演進(jìn)關(guān)系,即:從海水生演化到淡水生,由雌雄異體發(fā)展到雌雄同體;相應(yīng)地,單倍體數(shù)由n=19演化為n=18,染色體倍數(shù)由二倍體發(fā)展為三倍體。該假說(shuō)為從生殖和倍性兩個(gè)方面著手研究蜆屬貝類的演化提供了思路。

表3 蜆線粒體COⅠ單倍型的遺傳多樣性Tab.3 The genetic diversity of mitochondrial COⅠgene of Corbicula clams

3.4 蜆的譜系與遺傳多樣性

入侵地蜆的遺傳多樣性極低,譜系RA和SC個(gè)體分別共有其譜系所特有的唯一的線粒體COⅠ基因單倍型,譜系RlcB雖然有兩個(gè)COⅠ基因單倍型,但兩個(gè)單倍型僅相差1個(gè)堿基[5,14,15]。中國(guó)、越南、日本172條COⅠ序列中共發(fā)現(xiàn)44個(gè)單倍型,單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別在 0.284—1.000、0.00001—0.00346[15,47]。沅水99條COⅠ基因序列共發(fā)現(xiàn) 12個(gè)單倍型,17 個(gè)變異位點(diǎn),單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)分別為0.599、0.01236 和6.503,與前期研究結(jié)果相似[17]。譜系RlcB的單倍型數(shù)、變異位點(diǎn)數(shù)、單倍型多樣性、核苷酸多樣和平均核苷酸變異數(shù)均高于譜系 RA,這種差異可能與兩個(gè)譜系不同的生殖方式有關(guān),同時(shí)也說(shuō)明譜系與COⅠ單倍型遺傳多樣性之間相關(guān)性不強(qiáng)。