程 磊 何蘋萍 韋嬪媛 魯翠云 吳鐵軍 彭金霞

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150070;2.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530021)

鯉(Cyprinus carpio)養(yǎng)殖歷史悠久,至今仍是許多國(guó)家的重要水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象[1,2]。目前,鯉在中國(guó)的年養(yǎng)殖產(chǎn)量約3×109kg,是產(chǎn)量第四位的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種[3]。鯉經(jīng)歷了長(zhǎng)期的養(yǎng)殖和選育,形成許多極具特色的品種或品系,如現(xiàn)在廣泛養(yǎng)殖的鏡鯉、建鯉、荷包紅鯉等[4,5]。中國(guó)南方地區(qū)有在稻田中養(yǎng)殖鯉的傳統(tǒng),形成獨(dú)特的“稻魚(yú)共作”文化,其中浙江省青田縣的“稻魚(yú)共生系統(tǒng)”于2005年6月被聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)列為首批全球重要農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)(Globally Important Agricultural Heritage Systems,GIAHS),是我國(guó)的第一個(gè)該類型項(xiàng)目[6]。

在廣西壯族自治區(qū)的西北部,稻田養(yǎng)殖禾花鯉(又名禾花魚(yú))的歷史也已經(jīng)有上千年,是最具廣西地方特色的“稻魚(yú)共作”品種。禾花鯉(Cyprinus carpio)體型粗短、鱗細(xì)皮薄、肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美,因食稻田禾花而得名,清代乾隆年間曾成為宮廷貢品,現(xiàn)在也深受當(dāng)?shù)鼐用窈陀慰偷那嗖A[7]。廣西壯族自治區(qū)西北部經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展相對(duì)滯后,少數(shù)民族人口眾多,是扶貧攻堅(jiān)戰(zhàn)中任務(wù)最重的地區(qū)之一。禾花鯉價(jià)格高于普通淡水魚(yú),在當(dāng)?shù)赜休^好的養(yǎng)殖傳統(tǒng)和基礎(chǔ),發(fā)展禾花鯉“稻魚(yú)共作”生態(tài)養(yǎng)殖是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收和山區(qū)精準(zhǔn)脫貧的有效途徑之一。

鯉在歐亞大陸有廣泛的分布,《中國(guó)鯉科魚(yú)類志》記載中國(guó)分布有4個(gè)鯉亞種:西鯉(Cyprinus carpio carpio),分布于中亞與歐洲的廣大地區(qū),在中國(guó)僅見(jiàn)于新疆;遠(yuǎn)東鯉(Cyprinus carpio haematopterus),分布區(qū)北至黑龍江,南至閩江;華南鯉(Cyprinus carpio rubrefusus),則分布于珠江、沅江、海南島等地[8];杞麓鯉(Cyprinus chilia),僅分布于我國(guó)云南省的一些湖泊中。杞麓鯉與其他三個(gè)亞種差異較大,現(xiàn)在已被視為一個(gè)有效物種[9]。不難發(fā)現(xiàn),廣西禾花鯉的傳統(tǒng)養(yǎng)殖區(qū)恰好是鯉與華南鯉分布區(qū)的交匯處[10]。

長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)于禾花鯉的種質(zhì)資源狀況缺乏研究,至今仍然有相當(dāng)一部分科研人員將禾花鯉歸入原鯉屬(Procyprinus)[11—13],種質(zhì)資源不清已經(jīng)成為廣西禾花鯉保護(hù)利用及相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要制約因素。魚(yú)類線粒體DNA結(jié)構(gòu)緊湊,具有進(jìn)化快、缺乏重組、母系遺傳的特點(diǎn)[14],被廣泛用作魚(yú)類群體遺傳與系統(tǒng)進(jìn)化研究中的分子標(biāo)記[15,16]。本研究收集了廣西全州、環(huán)江和融水三地的禾花鯉,測(cè)定了其線粒體D-loop區(qū)和Cytb基因的部分序列,在此基礎(chǔ)上分析了廣西禾花鯉的群體遺傳結(jié)構(gòu),旨在為禾花鯉種質(zhì)資源保護(hù)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源及DNA提取

禾花鯉樣本采集自廣西壯族自治區(qū)全州(QZ)、融水(RS)和環(huán)江(HJ)三地稻田養(yǎng)殖禾花鯉,樣本數(shù)量分別為45、47和39尾。剪取魚(yú)鰭組織貼在濾紙上干燥保存,用蛋白酶K消化/苯酚-氯仿抽法提取魚(yú)鰭組織的總DNA。獲得的DNA沉淀,用適量去離子水溶解,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 線粒體DNA分析

基于已知鯉線粒體DNA序列(GenBank登錄號(hào):X61010),設(shè)計(jì)L15239(5′-TTTAACCGAGACCA ATGACT-3′)和H16230(5′-CGTTGTTTAGAGGT GTGTAGTA-3′)引物對(duì),L16500(5′-AGCGCCCA GAAAAGAGAGAT-3′)和H1091(5′-GGGCATA TTCACTGGGTTGCGGA-3′)引物對(duì),分別擴(kuò)增禾花鯉Cytb基因和D-loop區(qū)序列。PCR反應(yīng)體系體積為50 μL,含有1× ExTaqmix(康為世紀(jì)),約50 ng DNA模板,正反向引物各20 pmol。PCR擴(kuò)增程序如下:94℃預(yù)變性2min;94℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min,35個(gè)循環(huán);最終72℃延伸10min。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),確認(rèn)目的條帶有效擴(kuò)增并切膠回收后,用ABI 3730XL平臺(tái)測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

測(cè)序結(jié)果用ClusterW軟件[17]進(jìn)行排序(alignment),并輔以人工檢查校正。排序?qū)R后的序列截取相同長(zhǎng)度,依據(jù)樣品的個(gè)體來(lái)源將Cytb序列與D-loop序列串聯(lián),形成組合序列。用Arlequin 3.5軟件[18]統(tǒng)計(jì)單倍型數(shù)(Number of haplotypes,H)、單倍型多樣性(Haplotype diversity,Hd)、核苷酸多樣性(Nucleotide diversity,π)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目(Number of polymorphic sites,S)和平均核苷酸差異(Mean number of pairwise differences,K)等遺傳參數(shù)。以Arlequin 3.5軟件[18]進(jìn)行變異分析(Analysis of Molecular Variance,AMOVA)檢測(cè)遺傳變異來(lái)源,并計(jì)算群體間的分化系數(shù)Fst。利用MEGA7軟件[19]計(jì)算群體內(nèi)和群體間的遺傳距離,并構(gòu)建不同單倍型間的Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 禾花鯉線粒體DNA序列變異

本研究測(cè)定了禾花鯉Cytb基因中795 bp序列,序列中T、C、A和G四種堿基的平均比例分別為26.7%、30.4%、28.7%和14.2%。A+T的含量高于G+C的含量,堿基組成具有明顯的偏倚性。在131條Cytb序列中,檢測(cè)到15種Cytb單倍型,共有24個(gè)變異位點(diǎn),占總位點(diǎn)數(shù)的3.02%,均為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。

獲得了131尾樣本線粒體D-loop區(qū)5′端約698 bp的序列,序列中T、C、A、G四種堿基的平均比例分別為35.6%、17.1%、32.9%和14.3%。A+T的含量為68.5%,明顯高于G+C的31.5%含量,堿基明顯偏向A+T。在131條序列中,共獲得了15種D-loop區(qū)單倍型,共有25個(gè)變異位點(diǎn),占總位點(diǎn)數(shù)的3.58%,其中插入/缺失(indel)位點(diǎn)2個(gè),單突變位點(diǎn)有1個(gè),簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)有22個(gè)。

將Cytb基因序列與D-loop區(qū)序列串聯(lián)后,共檢測(cè)到19種聯(lián)合單倍型(表1)。單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)等遺傳參數(shù)見(jiàn)表2,線粒體DNA的D-loop和Cytb基因的多樣性水平相似,都表現(xiàn)出較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性。全州群體遺傳多樣性水平最高,融水群體次之,環(huán)江群體的遺傳多樣性則最低。

2.2 禾花鯉線粒體DNA遺傳結(jié)構(gòu)

基于串聯(lián)序列的分子方差分析(AMOVA,表3)結(jié)果顯示3個(gè)禾花鯉群體之間的變異占總遺傳變異的28.46%,而群體內(nèi)的遺傳變異占71.54%。遺傳分化指數(shù)Fst=0.285,并且差異顯著(P＜0.01)。

群體間遺傳分化(Fst)和群體內(nèi)及群體間平均遺傳距離結(jié)果見(jiàn)表4,群體間的Fst數(shù)值在0.112—0.379,環(huán)江、融水和全州三地禾花鯉均有明顯的遺傳分化,并且差異顯著(P＜0.01)。相對(duì)而言,環(huán)江群體與另兩個(gè)群體差異均較大,全州與融水群體的遺傳分化較小,而全州與環(huán)江的遺傳分化最大。

2.3 禾花鯉線粒體DNA單倍型系統(tǒng)發(fā)生

如前所述,禾花鯉的傳統(tǒng)養(yǎng)殖區(qū)恰好是遠(yuǎn)東鯉(C. c. haematopterus)與華南鯉(C. c. rubrefusus)的重疊分布區(qū)[8—10]。Zhou等[20—22]曾經(jīng)研究了的遠(yuǎn)東鯉、西鯉和華南鯉三個(gè)鯉亞種線粒體D-loop和Cytb基因的序列變異。為探明禾花鯉線粒體DNA的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,我們將Zhou等[20—22]的數(shù)據(jù)一并納入系統(tǒng)發(fā)育分析,并以鯽(Carassius auratus)的同源序列為外類群,利用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。所有線粒體單倍型聚為三支,分別對(duì)應(yīng)于西鯉(C. c. carpio)、遠(yuǎn)東鯉(C. c.haematopterus)和華南鯉(C. c. rubrefusus),其中遠(yuǎn)東鯉和華南鯉的關(guān)系較近。本研究檢測(cè)到的禾花鯉19種單倍型中,分別有一種單倍型(hap1)屬于西鯉類型,一種單倍型(hap14)屬于遠(yuǎn)東鯉類型,其余17種單倍型均屬于華南鯉類型。如表1所示,西鯉類型單倍型(hap1)在環(huán)江禾花鯉中高頻出現(xiàn),同時(shí)在融水群體中也有3尾個(gè)體是該單倍型(hap1),而全州和融水群體中均有低頻的遠(yuǎn)東鯉類型單倍型(hap14)。

表1 禾花鯉線粒體Cyt b和D-loop部分序列單倍型的群體分布Tab.1 Variation sites and population distribution of mitochondrial haplotypes in rice flower carp

3 討論

基于線粒體D-loop區(qū)和Cytb基因序列的禾花鯉遺傳結(jié)構(gòu)分析表明,禾花鯉總體上遺傳多樣性較豐富,表現(xiàn)為單倍型數(shù)較多,單倍型多樣性較高。鯉在歐亞大陸有著廣泛的地理分布,養(yǎng)殖歷史悠久,形成了多個(gè)亞種和養(yǎng)殖品種,同時(shí)還被人為引入到世界各地[4,5,10],有豐富的遺傳多樣性是符合預(yù)期的。但是,本研究中三地禾花鯉的核苷酸多樣性并不高。Thai等[23]研究發(fā)現(xiàn)鯉(Cyprinus carpio)線粒體DNA的核苷酸多樣性水平較低,并推測(cè)可能是由于鯉這個(gè)物種在進(jìn)化歷史上曾經(jīng)歷過(guò)較嚴(yán)重的遺傳瓶頸。

中國(guó)的鯉(Cyprinus carpio)可以分為三個(gè)亞種,即西鯉、遠(yuǎn)東鯉、華南鯉[8—10]。Zhou等[20—22]研究了鯉3個(gè)亞種的Cytb基因和D-loop序列變異,結(jié)果證實(shí)西鯉、遠(yuǎn)東鯉和華南鯉線粒體DNA分別聚為一支,華南鯉與遠(yuǎn)東鯉的親緣關(guān)系較近。本研究中檢測(cè)到的19種單倍型中有17種屬于華南鯉類型,并且有多個(gè)單倍型為2—3個(gè)群體間共享。檢測(cè)到的19種單倍型中分別只有1種屬于西鯉或遠(yuǎn)東鯉類型。其中,西鯉類型單倍型只出現(xiàn)在環(huán)江群體中,而遠(yuǎn)東鯉類型單倍型則為全州和融水群體間共享單倍型。因此,我們認(rèn)為禾花鯉(至少母系起源上)應(yīng)屬于華南鯉亞種。

表2 禾花鯉三群體遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters of three stocks of rice flower carp

表3 基于線粒體Cyt b和D-loop聯(lián)合單倍型的分子方差分析Tab.3 Analysis of molecular variance(AMOVA)based on Cyt b and D-loop concatenated haplotypes

表4 基于線粒體Cyt b基因和D-loop區(qū)聯(lián)合單倍型群體間的遺傳分化系數(shù)Fst(對(duì)角線下方)、群體間的遺傳距離(對(duì)角線上方)及群體內(nèi)遺傳距離(對(duì)角線上)Tab.4 Population pairwise Fst(below diagonal),genetic distances among populations(above diagonal)and genetic distances within populations(on diagonal)based on combined Cyt b gene and D-loop sequences

圖1 禾花鯉線粒體DNA單倍型的NJ進(jìn)化樹(shù)Fig.1 NJ phylogenetic tree of mitochondrial DNA haplotypes in rice flower carp(Cyprinus carpio)

本研究中環(huán)江群體只檢測(cè)到4種不同的單倍型,單倍型數(shù)較少,其中的優(yōu)勢(shì)單倍型(hap1)占到所有39尾樣本的58.85%。并且該單倍型(hap1)還屬于西鯉類型。如前所述,西鯉在中國(guó)自然分布區(qū)局限于新疆的部分水系,本研究的樣本采集地并不是其分布區(qū)。但是,鯉是世界性的水產(chǎn)養(yǎng)殖種,中國(guó)曾引進(jìn)歐洲和中亞起源的鯉養(yǎng)殖品種,如德國(guó)鏡鯉和散鱗鏡鯉,并廣泛用作養(yǎng)殖品種或育種親本[4,5,24]。因此,環(huán)江禾花鯉有可能滲入西鯉的遺傳物質(zhì),可能在其繁育過(guò)程中與其他鯉品種有過(guò)雜交。雖然環(huán)江群體的單倍型多樣性較低,但是其核苷酸多樣性卻是三個(gè)群體中最高的,這與其群體中存在明顯的線粒體譜系混雜有關(guān)。融水群體中也有少量的西鯉單倍型(hap1)和遠(yuǎn)東鯉單倍型(hap14),提示融水禾花鯉也可能受到其他鯉養(yǎng)殖品種的遺傳漸滲。全州群體的遺傳多樣性最豐富,共有11種不同單倍型,其單倍型多樣性也是三個(gè)群體中最高的。全州群體的線粒體單倍型主要是華南鯉類型,但是也存在個(gè)別的遠(yuǎn)東鯉的單倍型(hap14)。全州是禾花鯉養(yǎng)殖歷史最為悠久的地區(qū),其禾花鯉遺傳多樣性較高可能與當(dāng)?shù)鼐用窳?xí)慣自繁自養(yǎng),不進(jìn)行高強(qiáng)度選育有關(guān),較好地保持了地方品種的特色。

本文研究結(jié)果表明,廣西禾花鯉具有較高的遺傳多樣性,各地禾花鯉已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的遺傳分化,同時(shí)提示在禾花鯉繁育過(guò)程中可能存在利用不同來(lái)源鯉種質(zhì)培育或生產(chǎn)禾花鯉的情況。本研究初步揭示了廣西禾花鯉的種質(zhì)資源現(xiàn)狀,為禾花鯉這一地方特色“稻魚(yú)共作”品種的選育和苗種管理提供了必要的依據(jù)。如前所述,魚(yú)類線粒體DNA具有進(jìn)化快、缺乏重組、母系遺傳的特點(diǎn),有利于初步揭示種質(zhì)資源狀況[14]。但是為彌補(bǔ)線粒體DNA母系遺傳的不足,后續(xù)有必要利用微衛(wèi)星等核基因標(biāo)記研究禾花鯉群體遺傳結(jié)構(gòu),以更加全面地評(píng)估禾花鯉受其他鯉種質(zhì)遺傳漸滲的風(fēng)險(xiǎn)。