張文娟，譚昭，蔡如佳，關(guān)寧，高秀秋，王琳源

（錦州醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第二醫(yī)院牙周黏膜科，遼寧 錦州 121000；2.附屬第一醫(yī)院腦與脊髓損傷重點實驗室，遼寧 錦州 121000）

牙周炎是由牙周菌斑微生物引發(fā)的牙周支持組織破壞的慢性感染性疾病。雖然菌斑生物膜是牙周炎發(fā)生的始動因子，但宿主對牙周病原菌的免疫應(yīng)答是牙周組織破壞程度的決定性因素［1］。調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）是CD4+T細胞的獨特亞群，具有免疫抑制活性，通過抑制自身免疫和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答防止炎癥損傷。研究［2］發(fā)現(xiàn)，牙周炎中Treg細胞數(shù)量增加，其相關(guān)因子白細胞介素-10（interleukin 10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）表達升高，提示Treg細胞參與牙周炎的發(fā)病過程。然而，國內(nèi)關(guān)于Treg細胞在慢性牙周炎中具體作用的研究較少。本研究通過抑制小鼠Treg細胞功能，探討Treg細胞在慢性牙周炎小鼠中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株和動物

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）W83由中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院潘亞萍教授惠贈。SPF級C57BL/6小鼠16只，7 周齡，雌性，購于錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。本研究通過錦州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑

腦心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基（中國Solarbio公司）；氯化血紅素、羧甲基纖維素（美國Sigma公司）；體內(nèi)抗小鼠糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）單克隆抗體、同型對照抗體IgG（美國BioXcell公司）；TRIzol、實時PCR試劑盒（中國Vazyme公司）；IL-10、TGF-β1、叉頭翼螺旋轉(zhuǎn)錄分子（forkhead box P3，F(xiàn)oxp3）引物合成（中國鼎國昌盛公司）；實時PCR儀、高速低溫冷凍離心機（美國Thermo公司）；實體顯微鏡（日本Olympus公司）；FITC標(biāo)記的CD4、PE標(biāo)記的Foxp3抗小鼠的單克隆抗體（美國BIOLEGEND公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；厭氧培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）。

1.3 方法

1.3.1 實驗菌株培養(yǎng)：P.gingivalisW83接種于BHI血瓊脂培養(yǎng)基（含5%羊血、1%氯化血紅素、0.1%維生素K1）培養(yǎng)5～7 d，刮取菌落，重懸至BHI液體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)的P.gingivalisW83。調(diào)整菌密度為1×109/mL，重懸于含2%羧甲基纖維素鈉的磷酸鹽緩沖液中。

1.3.2 實驗分組和處理：將16只小鼠隨機分為4組，Sham組、P.gingivalis組、IgG組、anti-GITR組，每 組4只。P.gingivalis組、IgG組、anti-GITR組用移液器將100 μL菌液涂布于小鼠口腔，連續(xù)涂7 d，建立牙周炎動物模型，Sham組以相同體積含2%羧甲基纖維素鈉的磷酸鹽緩沖液涂抹于小鼠口腔。IgG組小鼠腹腔注射IgG同型抗體（每只小鼠100 μg）作為對照。anti-GITR組小鼠腹腔注射純化的抗小鼠GITR單克隆抗體（每只小鼠100 μg）。注射時間間隔3～4 d，共4次。所有小鼠于P.gingivalisW83感染后第45天處死取材。

1.3.3 牙齦指數(shù)和牙齒松動度評定：用牙周探診探查牙齦情況，從牙齦炎癥、水腫、出血等方面進行牙齦指數(shù)評定；按松動方向進行牙齒松動度評定［3］。

1.3.4 牙槽骨吸收評價：取右上頜骨，去除軟組織，3%過氧化氫浸泡6 h，沸水煮5 min，去凈剩余軟組織，0.1%亞甲藍染色，在體視顯微鏡下測量上頜第一磨牙至第三磨牙從釉牙骨質(zhì)界（cemento-enamel junction，CEJ）到牙槽嵴頂（alveolar bone crest，ABC）的距離，每顆牙測量頰側(cè)和腭側(cè)的近中、遠中共4個位點，取3顆牙12個位點的均值。

1.3.5 HE染色觀察牙周組織病理損傷情況：取左側(cè)上頜骨的磨牙段，磷酸鹽緩沖液清洗后用4%多聚甲醛固定48 h，放入10%中性EDTA中脫鈣，梯度脫水、透明、包埋，制成近遠中向石蠟切片（5 μm），HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察牙周組織情況。

1.3.6 牙周組織中Treg細胞檢測：參照KOBAYASHI等［4］的方法制備牙周組織單個核細胞懸液，將細胞懸液以5×105/mL的密度分別加入流式管并根據(jù)組別進行編號，設(shè)置空白對照管。加入FITC標(biāo)記的CD4抗體。4 ℃避光染色30 min。固定、破膜后加入PE標(biāo)記的Foxp3抗體，4 ℃避光孵育30 min。加入含1%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液洗滌2次后重懸，上機檢測。采用FlowJo10.4軟件分析CD4+Foxp3+（Treg）細胞。

1.3.7 實時PCR檢測：根據(jù)TRIzol試劑盒說明書操作，提取總RNA。用紫外分光光度計測RNA濃度和吸光度（optical density，OD）值，取OD260nm/OD280nm比值在1.8～2.0為實驗樣本。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進行擴增，實時PCR反應(yīng)的總體系為20 μL。IL-10引物序列：上游5’-CCTCGTTTG TACCTCTCTCCG-3’，下游5’-AGGACACCATAGCAA AGGGC-3’；TGF-β1引物序列：上游5’-AGCTGCGCT TGCAGAGATTA-3’，下游5’-AGCCCTGTATTCCGTC TCCT-3’；Foxp3引物序列：上游5’-CCCATCCCCAGG AGTCTTG-3’，下游5’-ACCATGACTAGGGGCACTGT A-3’；β-actin引物序列：上游5’-GGCTGTATTCCCCT CCATCG-3’，下游5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATG T-3’。反應(yīng)條件：第一階段預(yù)變性95 ℃ 30 s；第二階段循環(huán)反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；第三階段溶解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個樣本做3個平行孔，采用公式2-△△Ct計算目的基因的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠牙齦指數(shù)和牙齒松動度

Sham組小鼠牙齦顏色粉紅，無探針出血，無組織水腫；牙齒不松動。P.gingivalis組和IgG組小鼠牙齦略紅腫，個別探診出血；牙齒頰腭側(cè)松動，少數(shù)伴近遠中松動。P.gingivalis組和IgG組與Sham組相比，牙齦指數(shù)、牙齒松動度的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。anti-GITR組小鼠牙齦紅腫，探診出血；牙齒中重度度松動。anti-GITR組牙齦指數(shù)、牙齒松動度明顯大于P.gingivalis組和IgG組（P＜ 0.05）。P.gingivalis組與IgG組比較，牙齦指數(shù)、牙齒松動度的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表1。

表1 各組小鼠牙齦指數(shù)和牙齒松動度的比較Tab.1 Comparison of gingival index and tooth mobility of each group

2.2 牙槽骨吸收評價

與Sham組相比，P.gingivalis組、IgG組和anti-GITR組小鼠ABC高度降低，CEJ-ABC距離增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。且anti-GITR組CEJ-ABC距離大于P.gingivalis組和IgG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、2。

2.3 牙周組織病理檢查

圖1 牙槽骨形態(tài) ×32Fig.1 Alveolar bone morphology ×32

Sham組小鼠結(jié)合上皮完整，附著于CEJ處，牙周膜膠原纖維排列整齊。P.gingivalis組、IgG組小鼠結(jié)合上皮向根方增殖破壞，牙周膜膠原纖維排列紊亂，溶解，變性，固有層大量炎癥細胞浸潤，牙槽骨嵴頂吸收，破骨細胞和骨吸收陷窩形成。anti-GITR組結(jié)合上皮與牙面分離，下方的膠原纖維斷裂、喪失，大部分被炎癥細胞取代，ABC處骨吸收明顯，牙槽骨出現(xiàn)活躍的破骨性骨吸收陷窩。見圖3。

2.4 流式細胞儀分析Treg細胞

P.gingivalis組和IgG組牙齦組織中CD4+Foxp3+（Treg）細胞比例和細胞數(shù)量均高于Sham組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；anti-GITR組CD4+Foxp3+（Treg）細胞比例和細胞數(shù)量低于P.gingivalis組和IgG組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。P.gingivalis組和IgG組CD4+Foxp3+（Treg）細胞比例和細胞數(shù)量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。見圖4。

圖2 牙槽骨吸收分析Fig.2 Analysis of alveolar bone resorption

2.5 實時PCR檢測

與Sham相比，P.gingivalis組和IgG組小鼠牙齦組織IL-10、TGF-β1、Foxp3mRNA表達水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。anti-GITR組牙齦組織中IL-10、TGF-β1、Foxp3mRNA表達水平明顯低于P.gingivalis組和IgG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。P.gingivalis組和IgG組比較，IL-10、TGF-β1、Foxp3mRNA表達的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。見圖5。

3 討論

慢性牙周炎是口腔臨床常見疾病，是導(dǎo)致成人牙齒缺失的主要原因。P.gingivalis是慢性牙周炎病變區(qū)域的主要優(yōu)勢菌。隨著對牙周炎發(fā)病機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)牙周炎的組織病損主要是由宿主對感染的免疫應(yīng)答（先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答）引起的。CD4+T細胞是牙周炎免疫應(yīng)答的重要細胞類型，包括輔助性T細胞（T-helper cell，Th）1、Th2、Th17以及Treg等［5］。

圖3 HE染色觀察牙周組織形態(tài)×100Fig.3 Periodontal histomorphology observed by HE staining ×100

圖4 流式細胞儀分析牙齦組織中Treg細胞Fig.4 Flow cytometry analysis of Treg cells in gingival tissue

圖5 實時PCR檢測IL-10、TGF-β1、Foxp3 mRNA的表達Fig.5 Expression of IL-10，TGF-β1，and Foxp3 mRNA detected by real-time PCR

Treg細胞作為一類CD4+T亞群，表面高表達白細胞介素-2受體α鏈（CD25）、GITR、細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4等分子，特征性的表達轉(zhuǎn)錄因子Foxp3［6］，通過分泌TGF-β、IL-10等抑炎性細胞因子和細胞間直接接觸的方式參與免疫反應(yīng)，發(fā)揮免疫抑制作用，維持免疫穩(wěn)態(tài)［7］。BOZEC等［8］對人和小鼠進行體外研究，發(fā)現(xiàn)Treg細胞通過分泌TGF-β、IL-4、IL-10以及細胞表面分子細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4，與破骨細胞中CD80/86受體相互作用，抑制單核細胞/巨噬細胞向破骨細胞的分化。研究［9］發(fā)現(xiàn)，在慢性牙周炎的病損破壞期Treg細胞數(shù)量減少，在病損修復(fù)期病變牙齦組織中Treg細胞數(shù)量增多，表明Treg細胞參與慢性牙周炎的發(fā)病過程。與上述報道一致，本研究發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎小鼠的病變牙周組織中Treg細胞比例和數(shù)量增多，相關(guān)因子IL-10、TGF-β1、Foxp3表達上調(diào)，表明Treg細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答參與慢性牙周炎的炎癥調(diào)控。雖然在慢性牙周炎中Treg細胞相關(guān)因子表達上調(diào)，但仍出現(xiàn)牙周膜膠原纖維的溶解破壞，固有層炎癥細胞浸潤，牙槽骨嵴頂吸收，其原因可能是Treg細胞分泌的相關(guān)抑炎性細胞因子的效能不足以抵抗炎癥導(dǎo)致的組織破壞，導(dǎo)致牙周炎的炎癥進展。

GITR是腫瘤壞死家族受體超家族的成員，T淋巴細胞的共刺激分子，高表達于Treg細胞表面［10］，抗原遞呈細胞和內(nèi)皮細胞表面的GITRL與GITR結(jié)合后，GITR活化并通過招募TRAF蛋白到其胞漿尾部來介導(dǎo)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在IL-2和抗CD3抗體存在的條件下，加入GITRL-Fc融合蛋白促進Treg細胞的增殖［11］。SHIMIZU等［12］的體外研究發(fā)現(xiàn)，anti-GITR能夠以劑量依賴方式抑制Treg細胞的功能。將anti-GITR和兔補體處理的BALB/c nu/+脾細胞懸液過繼回輸?shù)紹ALB/c nu/nu小鼠體內(nèi)后，會導(dǎo)致小鼠自身免疫性疾病的發(fā)生。PATEL等［13］發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)給予GITR抗體后，實驗性關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)區(qū)炎癥細胞浸潤增加，骨破壞加重。以上研究表明，GITR在Treg細胞增殖和功能發(fā)揮中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用GITR抗體抑制Treg細胞功能后，P.gingivalis感染小鼠的病變牙周組織中Treg細胞比例和細胞數(shù)量減少，相關(guān)因子IL-10、TGF-β1、Foxp3表達降低，骨吸收加劇，炎性浸潤增加，表明Treg細胞在慢性牙周炎的發(fā)病過程中，參與抑制炎癥反應(yīng)并促進牙周組織的修復(fù)。

綜上所述，Treg細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在慢性牙周炎中參與維持牙周組織穩(wěn)態(tài)。在微環(huán)境中，Treg細胞效能不足可能導(dǎo)致了炎癥的進展。了解Treg細胞在牙周炎中的作用，有助于從免疫調(diào)控的角度探尋治療慢性牙周炎的途徑。值得注意的是，牙周炎的發(fā)病過程是動態(tài)可變的，Treg細胞作為免疫調(diào)節(jié)細胞，在牙周微環(huán)境中通過與多種細胞的相互作用影響病變的進程，其具體病理作用機制還有待于進一步的研究。