（北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，吉林 吉林 132013）

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率高，嚴(yán)重危害女性健康。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展常受到多種基因的調(diào)控（原癌基因的激活和抑癌基因的失活），同時(shí)也受到一些表觀遺傳學(xué)因素［DNA甲基化和微小RNA（microRNA，miRNA）等］影響［1-3］。其中DNA甲基化的發(fā)生不僅可以影響腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)變化，而且對(duì)位于CpG島附近或位于CpG島中的miRNA表達(dá)產(chǎn)生影響［4-6］。本研究探討抑制DNA甲基化和siRNA干擾DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b（DNA methyltransferase 3b，Dnmt3b）后乳腺癌細(xì)胞MCF-7中miRNA和腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)情況，旨在為乳腺癌的診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)HyClone公司，轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)QIAGEN公司，RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa BIOINC公司，GAPDH抗體、DNA甲基化抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，二抗購(gòu)于中國(guó)博士德公司，抗熒光淬滅劑、Hoechst33258購(gòu)于德國(guó)Sigma公司。siRNA由上海吉瑪公司合成，引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光染色檢測(cè)MCF-7細(xì)胞甲基化水平：將蓋玻片過(guò)酸處理高壓滅菌后，放入24孔板中，接種MCF-7細(xì)胞，24 h后實(shí)驗(yàn)組分別加入5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR），終濃度分別為5-Aza-CdR 10、5、1 μmol/mL；對(duì)照組加入等體積PBS，每24 h加入1次5-Aza-CdR，同時(shí)更換培養(yǎng)液，連續(xù)處理4 d。4 d后取出蓋玻片，PBS清洗3次，用5%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次。用TritonX-100（0.2%）透化40 min，鹽酸（4N）酸化30 min，棄去液體后，用Tris鹽酸（pH8.0）中和20 min，PBS清洗3次。BSA（1%）4 ℃封閉過(guò)夜后，加入適量5-甲基胞嘧啶直接熒光抗體（1%BSA 1∶50稀釋），避光放置4 ℃過(guò)夜，PBS清洗3次，每次30 min。在適量Hoechst33258染色液（5 mg/L）中避光染色10 min，PBS避光清洗3次，每次5 min。將含抗熒光淬滅劑的封片劑DABCO滴于載玻片上封片，30 min內(nèi)熒光倒置顯微鏡下觀察，拍照并記錄。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染及細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制：MCF-7細(xì)胞用含有10%胎牛血清和90%DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（Mock組）、陰性對(duì)照組（NC組）和干擾組（siRNA組）。針對(duì)Dnmt3b的siRNA-1511及其陰性對(duì)照序列如下：5’-CGCCUC AAGACAAAUUGCUTT-3 ’；5’-AGCAAUUUGUCUU GAGGCGTT-3’。轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞按照1×105/mL接種于24孔板中，每孔加入1 mL培養(yǎng)液。過(guò)夜貼壁后，每孔更換為400 μL無(wú)血清培養(yǎng)液待用。用100 μL無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋80 ng siRNA，與3 μL轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫靜止5～10 min，輕輕將轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加至24孔板中，輕輕搖勻，轉(zhuǎn)染6 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。48 h后提取RNA檢測(cè)目的基因表達(dá)情況，96 h后檢測(cè)miRNA與相關(guān)基因表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染前后連續(xù)5 d顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)siRNA干擾后細(xì)胞Dnmt3bmRNA的表達(dá)：轉(zhuǎn)染48 h后提取NC組、Mock組、siRNA組細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增Dnmt3bmRNA，β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，引物序列見(jiàn)表1。

1.2.4 Western blotting檢測(cè)siRNA干擾后細(xì)胞Dnmt3b蛋白的表達(dá)：收集Mock組、NC組、siRNA組細(xì)胞，加入RAPI細(xì)胞裂解液，4℃裂解10 min，其間渦旋振蕩2次，30 s/次，4℃離心15 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。調(diào)蛋白濃度一致，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜。封閉后加入Dnmt3b單克隆抗體（1∶100稀釋），內(nèi)參加入兔抗-GAPDH抗體（1∶200稀釋），慢搖1 h，用PBS-T洗膜3次，每次20 min。加入二抗（Dnmt3b 1∶3 000稀釋；GAPDH 1∶2 000稀釋），室溫孵育40 min，PBS-T洗膜1次，PBS洗膜2次，每次10 min。在顯影儀中滴加顯影液顯影，用Image J軟件對(duì)蛋白表達(dá)條帶進(jìn)行光密度值的定量分析。

1.2.5 高通量測(cè)序檢測(cè)miRNA的表達(dá)情況：將細(xì)胞按1×105/mL接種于6孔板，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM，3孔/組，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組每孔加入終濃度5 μmol/mL的5-Aza-CdR，換液1次/24 h，并重新加入5-Aza-CdR。72 h后每孔加入1 mL Trizol將細(xì)胞完全裂解，miRNA高通量測(cè)序委托上海吉瑪公司進(jìn)行。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)mRNA和miRNA的表達(dá)：采用Trizol法提取RNA，檢測(cè)濃度與質(zhì)量，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR擴(kuò)增，退火溫度及引物序列見(jiàn)表1、表2。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in the study

表2 miRNA引物序列Tab.2 Sequences of the primers targeting miRNA sequences used in the study

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-CdR對(duì)細(xì)胞DNA甲基化水平的影響

熒光顯微鏡觀察MCF-7甲基化程度，結(jié)果可見(jiàn)，隨著5-Aza-CdR濃度的升高，5-甲基胞嘧啶甲基化抗體染色逐漸減弱，表示其整體甲基化水平逐漸降低。與對(duì)照組（59.37±8.45）比較，1、5、10 μmol/mL組（分別為34.30±9.47、5.11±2.78、4.99±2.64）甲基化水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜ 0.05），但5 μmol/mL組與10 μmol/mL組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用5 μmol/mL濃度5-Aza-CdR，見(jiàn)圖1。

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)及Dnmt3b的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，siRNA干擾組中Dnmt3b的表達(dá)低于Mock組和NC組（P＜ 0.05），見(jiàn)圖2A、2B。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，siRNA干擾組Dnmt3b的表達(dá)顯著下降（P＜ 0.05），抑制達(dá)75%以上，見(jiàn)圖2C；細(xì)胞計(jì)數(shù)可見(jiàn)Mock組和NC組細(xì)胞生長(zhǎng)速度相近，而與Mock組和NC組比較，siRNA干擾組細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制（P＜ 0.05），見(jiàn)圖2D。說(shuō)明siRNA轉(zhuǎn)染后顯著下調(diào)Dnmt3b的表達(dá)。

2.3 5-Aza-CdR處理、Dnmt3b siRNA干擾后癌基因和抑癌基因mRNA的表達(dá)

與對(duì)照組比較，經(jīng)5 μmol/mL 5-Aza-CdR處理后WWOX、MMP7表達(dá)顯著下調(diào)，TCF21、TIMP1表達(dá)顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表3。與NC組比較，siRNA干擾組抑癌基因BRCA1、BRCA2及癌基因MMP7、survivin的表達(dá)均顯著下調(diào)（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.4 高通量測(cè)序檢測(cè)5-Aza-CdR處理后miRNA的表達(dá)情況

高通量測(cè)序結(jié)果顯示，1 319個(gè)miRNA表達(dá)存在差異，其中，67個(gè)miRNA表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），見(jiàn)圖3。20個(gè)miRNA實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均有表達(dá)，見(jiàn)表4；47個(gè)miRNA對(duì)照組中無(wú)表達(dá)，見(jiàn)表5。

圖1 5-Aza-CdR處理后細(xì)胞DNA甲基化水平的改變×400Fig.1 Changes in DNA methylation levels in cells after 5-Aza-2’-deoxycytidine（5-Aza-CdR）treatment×400

圖2 siRNA干擾后細(xì)胞生長(zhǎng)及Dnmt3b的表達(dá)Fig.2 Cell growth and DNMT3b expression after siRNA interference

2.5 qRT-PCR檢測(cè)5-Aza-CdR處理、Dnmt3b siRNA干擾后miRNA的表達(dá)情況

與對(duì)照組比較，經(jīng)5 μmol/mL 5-Aza-Cdr處理后miR-200a、miR-411、miR-382、miR-409、miR-493、miR-127、miR-520a、miR-654表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），并且此8個(gè)miRNA的差異性表達(dá)與高通量測(cè)序結(jié)果一致。與NC組比較，siRNA干擾組中miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-203b、miR-409、miR-520a、miR-654的表達(dá)顯著上調(diào)，而miR-200b、miR-127的表達(dá)顯著下調(diào)（均P＜ 0.05），見(jiàn)表6。

3 討論

miRNA來(lái)源于細(xì)胞核內(nèi)基因組的miRNA基因，部分miRNA位于CpG島附近或位于CpG島中，這些miRNA表達(dá)極易受到DNA異常甲基化的調(diào)控［7-9］。miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，盡管完整的miRNA表達(dá)調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚，但已有研究提示腫瘤細(xì)胞中DNA甲基化異常會(huì)引起miRNA表達(dá)改變。HASHIMOTO等［10］研究顯示胃癌組織和細(xì)胞中miR-181c基因CpG島高甲基化，而miR-181c低表達(dá)，經(jīng)5-Aza-CdR處理后miR-181c表達(dá)恢復(fù)，同時(shí)抑制了胃癌細(xì)胞增殖。在DNA甲基化過(guò)程中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，Dnmt）參與催化，其包含Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b等，其中Dnmt3b參與CpG從頭甲基化［11］。有研究［7］表明乳腺癌組織中Dnmt3b表達(dá)增加，并且與腫瘤分期及預(yù)后相關(guān)。本研究通過(guò)5-Aza-CdR抑制乳腺癌細(xì)胞整體甲基化水平，結(jié)果顯示，miR-200a、miR-411、miR-382、miR-409、miR-493、miR-127、miR-520、miR-654的表達(dá)顯著上調(diào)，而僅干擾Dnmt3b表達(dá)時(shí)，miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-203b、miR-409、miR-502a、miR-654表達(dá)顯著上調(diào)，miR-127、miR-200b表達(dá)顯著下調(diào)，此結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果基本一致。有研究［13-14］表明miR-29家族可調(diào)控Dnmt3a和Dnmt3b的表達(dá)。由此可見(jiàn)，Dnmt3b會(huì)受到miRNA的調(diào)控，也可以改變部分miRNA基因甲基化狀態(tài)，從而影響它們的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

表3 5-Aza-CdR處理及Dnmt3b siRNA干擾后癌基因和抑癌基因mRNA的表達(dá)Tab.3 Relative mRNA expression of oncogenes and tumor suppressors after 5-Aza-2’-deoxycytidine（5-Aza-CdR）treatment and DNMT3b siRNA interference

圖3 5-Aza-CdR處理后MCF-7 miRNA高通量測(cè)序差異表達(dá)Fig.3 Identification of differentially expressed miRNAs after 5-Aza-2’-deoxycytidine（5-Aza-cdR）treatment

表4 高通量測(cè)序中miRNA差異表達(dá)Tab.4 Differential expression of miRNAs determined via high-throughput sequencing

表5 高通量測(cè)序中對(duì)照組不表達(dá)的miRNATab.5 List of miRNAs not expressed in the control group as determined via high-throughput sequencing

表6 5-Aza-CdR處理及Dnmt3b siRNA干擾后miRNA的表達(dá)Tab.6 Relative expression levels of miRNA after 5-Aza-2’-deoxycytidine（5-Aza-CdR）treatment and DNMT3b siRNA interference

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與癌基因的表達(dá)增高和抑癌基因的沉默密切相關(guān)，Dnmt3b作為甲基化的催化劑可以影響部分基因表達(dá)的功能。已有研究表明，在癌組織中抑癌基因WWOX、TCF21、BRCA1、BRCA2［15-20］表達(dá)下降，而癌基因MMP7［21］、TIMP1［22］、PKM2［23］、survivin［24］表達(dá)增高。本研究中5-Aza-CdR可以使乳腺癌細(xì)胞中抑癌基因WWOX和癌基因MMP7表達(dá)降低，而上調(diào)抑癌基因TCF21和癌基因TIMP1，其中TCF21和MMP7的表達(dá)符合預(yù)期結(jié)果，而WWOX和TIMP1的結(jié)果分析原因可能是由于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響這些基因的表達(dá)。對(duì)于siRNA干擾抑制Dnmt3b的表達(dá)中可見(jiàn)癌基因TIMP1、PKM2、survivin的表達(dá)顯著降低，而抑癌基因WWOX、TCF21、BRCA1、BRCA2的表達(dá)也降低，分析原因可能是由于甲基化程度與組織特異性的關(guān)系存在多樣化，雖然這些基因在前列腺癌、肺癌、大腸癌甚至乳腺癌中甲基化程度較高，但實(shí)驗(yàn)中所培養(yǎng)的細(xì)胞種類(lèi)不同、腫瘤的分期進(jìn)展不同、腫瘤的組織種類(lèi)不同，其甲基化水平也不相同。另外本研究?jī)H對(duì)Dnmt3b進(jìn)行干擾抑制Dnmt3b的表達(dá)，推測(cè)Dnmt3b對(duì)WWOX、TCF21、BRCA1、BRCA2的表達(dá)影響較小，并不占主要調(diào)控位置，其他甲基轉(zhuǎn)移酶是這些基因發(fā)生甲基化的主要因素，目前研究者對(duì)乳腺癌易感基因的甲基化研究還不夠成熟，往往出現(xiàn)矛盾的結(jié)果，具體原因還有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，Dnmt3b可影響乳腺癌細(xì)胞相關(guān)基因WWOX、TCF21、BRCA1、BRCA2、MMP7、TIMP1、PKM2、survivin及miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-200b、miR-203b、miR-409、miR-127、miR-520a的表達(dá)。DNA甲基化是一種可逆的表觀遺傳學(xué)修飾方式，逆轉(zhuǎn)與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNA基因甲基化水平將改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，為腫瘤的精準(zhǔn)治療提供新的方向［25］。本實(shí)驗(yàn)從Dnmt3b對(duì)miRNA及mRNA的影響作用出發(fā)，應(yīng)用siRNA干擾的方法改變Dnmt3b的表達(dá)，檢測(cè)乳腺癌相關(guān)miRNA及mRNA的表達(dá)情況，明確了Dnmt3b對(duì)miRNA及靶基因mRNA的相互調(diào)控機(jī)制，為乳腺癌的臨床精確診治提供了依據(jù)。