王維華，郭永剛，李敏

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院；3.淄博市周村區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心，山東淄博 255300)

植物根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)是植物根系定居性內(nèi)寄生生物，分布廣泛，且寄主繁多，隨著我國大量高毒殺線蟲劑的禁用及根結(jié)線蟲對傳統(tǒng)殺線蟲劑抗藥性的累積，根結(jié)線蟲病害的防治形勢嚴峻[1]。西瓜是我國重要的經(jīng)濟作物，設(shè)施西瓜連作加劇了根結(jié)線蟲病的發(fā)生。

研究發(fā)現(xiàn)輪作辣椒能有效降低西瓜根內(nèi)根結(jié)線蟲繁殖體數(shù)量，減輕西瓜根結(jié)線蟲病的危害程度[2]，而不同的辣椒品種對根結(jié)線蟲的抗性不同[3]。用抗根結(jié)線蟲辣椒與黃瓜和葫蘆輪作極大降低土壤中根結(jié)線蟲二齡幼蟲和卵的密度，減輕黃瓜根結(jié)線蟲病的危害[4]。植物根系分泌物中的揮發(fā)性物質(zhì)作為信號分子在根結(jié)線蟲侵染識別過程中發(fā)揮著主導(dǎo)作用[5]。

為探究抗線蟲辣椒品種在西瓜輪作過程中對西瓜根結(jié)線蟲病害的效應(yīng)，本試驗選取了對根結(jié)線蟲抗性不同的2個辣椒品種，利用根系分泌物自動收集裝置收集根系分泌物，并用GC-MS進行成分分析。用辣椒根系分泌物分別處理南方根結(jié)線蟲卵粒及二齡幼蟲，結(jié)合兩品種根系分泌物成分比對，初步探究抗病辣椒根系分泌物中的特異化感物質(zhì)對根結(jié)線蟲的抑制作用，為進一步探討辣椒輪作防控西瓜根結(jié)線蟲病害的機制及根結(jié)線蟲病害的綜合防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 辣椒根系分泌物的成分分析

1.1.1 根系分泌物自動收集

試驗于2016年7～8月在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)日光溫室進行。辣椒品種為中抗線蟲品種‘青農(nóng)簇生椒’(青島農(nóng)業(yè)大學(xué))和感病品種‘農(nóng)家小尖椒’(哈爾濱金龍農(nóng)業(yè)有限公司)。2016年7月1日辣椒種子催芽，7月5日播種，8月15日，將苗用去離子水沖洗干凈，移栽到根系分泌物自動收集裝置中[6]。收集分泌物的色譜柱中裝有XAD-4大孔吸附樹脂(SIGMA-ALDRICH.CO.)，樹脂柱規(guī)格為15 mm×300 mm，采用濕法裝柱。開啟裝置，控制離子水流量為1 L·h-1，連續(xù)收集10 d。將收集10 d的色譜柱取下，先用500 mL去離子水清洗，再用200 mL正己烷洗脫。將洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40 ℃下減壓旋蒸至正己烷揮發(fā)完全，用10 mL甲醇溶解干物質(zhì)，獲得2種根系分泌物，于4 ℃下保存。

1.1.2 辣椒根系分泌物成分

采用GC-MS進行分析，參考陳瀟[6 ]的方法。氣相色譜儀為Agilent 6980N；質(zhì)量選擇檢測器為Agilent Technologies 5973；分析軟件為Agilent Chemstation，通過Agilent Chemstation化學(xué)工作站檢索Nist標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫確定化合物。

1.2 辣椒分泌物對西瓜根線蟲的影響

2016年9～11月在日光溫室內(nèi)進行。共設(shè)3個處理，6次重復(fù)。將‘京欣4號’西瓜種子催芽后，播種于裝有滅菌基質(zhì)(草炭∶蛭石體積比=2∶1)的15 cm×20 cm花盆中，每盆留1株壯苗。三葉一心時，接種3×105個·L-1根結(jié)線蟲卵懸浮液10 mL，同時分別澆灌1 mL·L-1不同品種辣椒根系分泌物提取液10 mL·株-1，以等量滅菌的蒸餾水為對照。50 d后測定根圍和根內(nèi)根結(jié)線蟲數(shù)量。

1.2.1 西瓜根圍根結(jié)線蟲和卵粒數(shù)的計數(shù)方法

采用離心漂浮分離法和乳酚油-酸性品紅溶液染色法[7]，分別測定西瓜根內(nèi)二齡幼蟲、雌成蟲數(shù)和根圍土壤二齡幼蟲、卵粒數(shù)等。將根系切成0.5～1.5 cm小段，混勻后隨機取1 g鮮質(zhì)量根采用酸性品紅液染色法，于顯微鏡下觀察計數(shù)根內(nèi)線蟲數(shù)量，表示方法為條·g-1。取100 g根圍土壤于燒杯內(nèi)，注水至600 mL；攪拌20 s靜止1 min后，將上清液經(jīng)500 μm網(wǎng)篩倒入38 μm網(wǎng)篩內(nèi)，收集38 μm網(wǎng)篩內(nèi)的土壤和線蟲混合物，并在3 000 r·min-1離心5 min， 棄上清液并加入38.5%蔗糖溶液，充分混勻后3 000 r·min-1離心30 s，將上清液傾入26 μm網(wǎng)篩中，收集網(wǎng)篩中線蟲和卵粒，定容并于體視顯微鏡下計數(shù)。

1.2.2 南方根結(jié)線蟲孵化率測定

按照呂星光[8]的方法測定。取已滅菌的直徑9 cm的培養(yǎng)皿，挑取并加入約100粒經(jīng)1% H2O2表面消毒過的根結(jié)線蟲卵粒，分別加入兩種辣椒分泌物提取液10 mL，以滅菌的去離子水為對照。每處理重復(fù)3次。25 ℃黑暗培養(yǎng)。第2天開始觀察線蟲孵化情況，并每隔24 h觀察一次，觀察至第10天為止，計算線蟲卵孵化率。

1.3 鄰苯二甲酸二丁酯對南方根結(jié)線蟲的影響

鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)為分析純，南方根結(jié)線蟲卵粒及二齡幼蟲由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)菌根研究所提供。

線蟲孵化率和死亡率測定 取已滅菌的直徑9 cm的培養(yǎng)皿，挑取并加入約100粒經(jīng)1 % H2O2表面消毒過的根結(jié)線蟲卵粒，分別加入濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 mL·L-1的DBP水溶液，以滅菌蒸餾水為對照。計算線蟲卵孵化率。25 ℃黑暗培養(yǎng)，24 h后觀察二齡幼蟲成活情況，并計算線蟲死亡率及校正死亡率。殺線蟲強弱分級標(biāo)準(zhǔn)按Chandravadana等[9]的方法進行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及處理

采用Microsoft Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用DPS 7.05軟件進行方差顯著性分析(LSD法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒根系分泌物對線蟲孵化率的影響

如圖1所示，各處理的線蟲孵化率均隨時間而呈“S”型曲線增長，除了在2 d和4 d對照(CK)與‘農(nóng)家小辣椒’根分泌物處理的差異不顯著外，其余均顯著高于兩種辣椒分泌物處理。在處理1～6 d，兩種辣椒根系分泌物的線蟲孵化率間無顯著性差異，各處理孵化率增幅均在4～6 d達到最高，其中對照孵化率增幅最高，為16.67%。處理6 d至10 d，各處理的線蟲孵化率增幅均逐漸減小。在處理后10 d，對照的線蟲孵化率最高，為84.33%；‘青農(nóng)簇生椒’根系分泌物處理的線蟲孵化率最低，為60.67 %；‘農(nóng)家小尖椒’分泌物處理的線蟲孵化率為70.33 %。在7～10 d，兩種辣椒分泌物處理的線蟲孵化率均存在顯著性差異?？梢姡瑑衫苯菲贩N根系分泌物均能顯著抑制根結(jié)線蟲孵化，而且抗線蟲品種 ‘青農(nóng)簇生椒’根系分泌物對線蟲孵化的抑制作用高于‘農(nóng)家小尖椒’。

2.2 辣椒根系分泌物對西瓜根系根結(jié)線蟲數(shù)量的影響

由表1可知，‘青農(nóng)簇生椒’辣椒分泌物處理的西瓜根內(nèi)及根圍根結(jié)線蟲數(shù)量均顯著低于對照；‘農(nóng)家小尖椒’分泌物處理的西瓜根圍根結(jié)線蟲幼蟲和卵粒數(shù)量均顯著高于‘青農(nóng)簇生椒’， 且與對照差異顯著。‘農(nóng)家小尖椒’處理的西瓜根內(nèi)根結(jié)線蟲二齡幼蟲和雌成蟲數(shù)量均次于對照，且高于‘青農(nóng)簇生椒’處理；‘農(nóng)家小尖椒’根內(nèi)二齡幼蟲與對照差異不顯著，而根內(nèi)雌成蟲數(shù)量顯著高于對照且與‘青農(nóng)簇生椒’間不存在顯著性差異。

表1 辣椒根系分泌物對西瓜根內(nèi)和根圍根結(jié)線蟲數(shù)量的影響Table 1 Effect of root exudates on the number of root knot nematodes in watermelon roots and rhizosphere 單位：(個·g-1)

2.3 兩品種辣椒根系分泌物成分對比

在辣椒品種‘青農(nóng)簇生椒’和‘農(nóng)家小尖椒’根系分泌物中，分別檢測到了17種和18種化學(xué)物質(zhì)，包括酯類、烴類、酚類和胺類等(表2)。對比兩個品種辣椒根系分泌物發(fā)現(xiàn)，‘青農(nóng)簇生椒’中出現(xiàn)了‘農(nóng)家小尖椒’沒有的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)。

表2 辣椒根系分泌物中化感物質(zhì)Table 2 Allelopathic substance in root exudates of pepper

2.4 不同濃度DBP對線蟲孵化率的影響

如圖2所示，各處理的線蟲孵化率均隨時間而呈“S”型曲線增長，對照組孵化率均高于其他處理。在處理第3天，除對照組外，各處理間沒有顯著性差異，僅4 mL·L-1DBP與對照間差異顯著；各處理孵化率增幅均在第4～6天達到最高，其中對照孵化率增幅最高，為16.67%，DBP濃度由低至高其線蟲孵化率最高增幅為13.00%、10.33%、9.67%和9.33%。從第6天至第9天，各處理的線蟲孵化率增幅均逐漸減小。在處理后第10天，對照的線蟲孵化率最高，為84.33%；3 mL·L-1和4 mL·L-1DBP的線蟲孵化率最低，分別為57.33%和55.33%，兩個處理間無顯著性差異。綜上所述，線蟲孵化率隨DBP濃度的升高而降低。

2.5 不同濃度DBP對二齡幼蟲死亡率的影響

由表3可見，DBP對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲具有顯著的殺滅作用，且其死亡率及校正死亡率與DBP的濃度呈正相關(guān)。對照的死亡率為45.00%，與對照相比，4 mL·L-1DBP的死亡率、校正死亡率最高，分別為94.44%、90.85%，活性強度為強活性；其次為3 mL·L-1DBP的死亡率、校正死亡率分別為79.30%、63.63%，活性強度為較強活性；4 mL·L-1與3 mL·L-1DBP的死亡率、校正死亡率不存在顯著性差異。1 mL·L-1與2 mL·L-1DBP的死亡率、校正死亡率分別為53.22%、16.68%和58.41 %、26.01 %，且與對照間無顯著性差異，活性強度均為弱活性。

表3 不同濃度DBP對二齡線蟲死亡率的影響Table 3 Effect of different concentrations of DBP on the mortalities of nematode J2

3 結(jié)論與討論

植物根系分泌物與線蟲的生長和繁殖密切相關(guān)[7]。植物根系能夠向根際釋放大量的化感物質(zhì)，這些物質(zhì)可以對土壤生物產(chǎn)生直接或間接的影響，當(dāng)然也包括線蟲[10]。根系分泌物中的化學(xué)物質(zhì)可以吸引線蟲向根部移動或反向排斥，或抑制線蟲的運動能力，甚至使線蟲死亡。感病材料根系分泌物能夠促進胞囊線蟲卵粒的孵化，而抗病材料根系分泌物則對線蟲卵孵化具有明顯的抑制作用[11-12]?？剐苑颜枘靖捣置谖锟芍苯踊蜷g接抑制南方根結(jié)線蟲卵孵化與發(fā)育，從而抑制線蟲在寄主根內(nèi)的發(fā)育繁殖和再侵染；與感病番茄相比，抗性番茄根系分泌物的抑制效果更為明顯，且隨抗性増強抑制效果增加[13]。將不同抗性的茄子砧木接種南方根結(jié)線蟲后，感病品種根系分泌物能夠明顯刺激線蟲卵的孵化，而抗病品種在線蟲侵染初期表現(xiàn)出顯著抑制作用[14]，這可能是由于兩種植物根系化感物質(zhì)成分的差異造成的。從高抗、中抗和感病番茄材料的根系分泌物中均得到了DBP，且在未接種南方根結(jié)線蟲前3種番茄根系分泌物中的DBP含量相近，而接種后根系分泌物中DBP含量隨番茄材料抗線蟲能力的增強而升高。感病番茄根系分泌物對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲具有吸引作用，而抗病番茄根系分泌物對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲具有排斥作用，且隨抗性増強而增加[15]。

耿廣東等[16]采用GC-MS分析法發(fā)現(xiàn)辣椒根系分泌物含有多種化感物質(zhì)，其中DBP的含量最高。本試驗通過對根結(jié)線蟲抗性不同的兩個辣椒品種的根系分泌物組成成分進行比對和分析，共獲得21種物質(zhì)。其中，在抗線蟲辣椒品種‘青農(nóng)簇生椒’中出現(xiàn)了感病辣椒品種‘農(nóng)家小尖椒’根系分泌物中沒有的酯類——DBP。本試驗進一步分析了不同濃度的DBP處理的線蟲孵化和二齡幼蟲成活情況，隨著DBP濃度的升高，南方根結(jié)線蟲的生長和繁殖也均受到了抑制作用。結(jié)論認為辣椒根系分泌的化感物質(zhì)DBP，在抑制南方根結(jié)線蟲的生長和繁殖方面起到了積極作用?？梢酝茰y，輪作抗線蟲辣椒根系分泌的化感物質(zhì)BDP是防控西瓜根結(jié)線蟲病害的可能機制之一。

本試驗分析了抗性不同的兩種辣椒根系分泌物處理南方根結(jié)線蟲卵的孵化和根圍二齡幼蟲和卵粒數(shù)量的情況，結(jié)果表明，抗線蟲品種‘青農(nóng)簇生椒’根系分泌物對線蟲孵化的抑制作用高于‘農(nóng)家小尖椒’?！噢r(nóng)簇生椒’辣椒分泌物處理的西瓜根內(nèi)及根圍根結(jié)線蟲二齡幼蟲和卵粒數(shù)量均低于‘農(nóng)家小尖椒’。而兩種辣椒材料均對根結(jié)線蟲具有抑制作用，推測在辣椒根系分泌物中還有其他能夠拮抗根結(jié)線蟲的化感物質(zhì)，且該物質(zhì)同時存在于兩種辣椒材料中，從而導(dǎo)致不含DBP的‘農(nóng)家小尖椒’對線蟲也有一定的抑制作用。