張小雯，孫敬蒙，汪卓明，寧勁濤，王丹，張煒煜

(1.長春中醫(yī)藥大學藥學院，長春 130117；2.吉林大學白求恩第一醫(yī)院藥學部，長春 130021)

近年來，心腦血管疾病的發(fā)病率逐年升高。心腦血管系統(tǒng)疾病是一種主要由血管壁病變，血液成分組成和血液動力學改變，以及不良生活習慣造成的一種常見的慢性疾病[1]，多發(fā)生于中老年人。主要表現(xiàn)為高血壓、心肌梗死、心絞痛與腦卒中、腦梗死等癥狀[2]。馬來酸桂哌齊特(cinepazide maleate，CM)是新一代哌嗪類藥物，在治療心腦血管系統(tǒng)疾病方面獲得國內(nèi)外認可，目前上市品種僅有注射用粉針劑[3]。筆者在本研究以CM作為模型藥物[4]，由于CM遇光不穩(wěn)定，在光照條件下含量急劇下降，半衰期為70 min。將CM制備成脂質(zhì)體[5]，增加藥物穩(wěn)定性，并進一步將脂質(zhì)體混懸液固化干燥為粉末，改善其上述的缺點。筆者采用魚骨圖分析法[6]，對影響CM制備因素進行剖析，結(jié)合Plackett-burman design(PBD)及Box-behnken design(BBD)，優(yōu)化馬來酸桂哌齊特脂質(zhì)體(cinepazide maleate liposomes，CM-Lip)的制備工藝，并進一步進行驗證和表征，為新型藥物的開發(fā)研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器設備 Agilent 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、AR2140型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，感量：0.1 mg)、HH.S21-Hi6電熱恒溫水浴鍋(北京市長源實驗設備廠)、KQ2200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、透射電子顯微鏡(HITACHI公司)、PHS-3C型數(shù)字酸度計(儀電科學儀器)、SZ516 紅外分析光譜儀(北京北分瑞利)、DSC3差示掃描量熱儀(梅特勒-托利多儀器有限公司)、LS13320型激光粒度分析儀(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.2材料與試劑 CM對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100135-201105，含量：99.91%)、CM原料藥(吉林省博大偉業(yè)制藥有限公司，批號：171118，含量：98.97%)、膽固醇(北京鼎國昌盛生物科技有限責任公司，批號：DH061-1.1)、大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)股份有限公司，批號：201712061)，甲醇、乙腈均為色譜級由Sigma公司提供，磷酸二氫鈉(批號：20170617)、磷酸氫二鈉(批號：20180215)、磷酸二氫鉀(批號：20180103)、磷酸氫二鉀(批號：20180402)均購自北京化工廠。

2 方法與結(jié)果

2.1含量測定方法

2.1.1色譜條件 采用Aglient-XDB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.05 mol·L-1磷酸氫二鈉緩沖液(25：75)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL；檢測波長：230 nm。

2.1.2溶液的制備

①對照品溶液的制備。取CM對照品2 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，濾過，即得。

②供試品溶液的制備。取CM-Lip 混懸液，置于250 mL錐形瓶中，加PBS(pH值=5.8)稀釋至刻度，備用；取PBS(pH=7.4) 8 mL置透析袋中，將透析袋置于上述錐形瓶中，并放置(37±1℃)℃，75 r·min-1恒溫振蕩器中，振蕩180 min后，從透析袋中取出樣品5 mL，置于蒸發(fā)皿內(nèi)放置水浴鍋上蒸干，殘渣加流動相溶解并定容至5 mL，搖勻，濾過，即得。

③陰性對照溶液的制備。取磷酸氫二鈉0.709 8 g，加水溶解成500 mL，配成0.05 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液，備用；取乙腈25 mL置于100 nL量瓶中，加上述備用液定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.1.3專屬性實驗 精密量取對照品溶液，供試品溶液，陰性對照溶液20 μL，按照“2.1.1”項色譜條件進樣測定。結(jié)果供試品溶液中CM成分得到較好分離，供試品與對照品在相同的保留時間出現(xiàn)色譜峰，而陰性色譜圖中在對照品相同保留時間處沒有色譜峰，證明陰性無干擾，專屬性良好。見圖1。

2.1.4標準曲線的制備 分別精密吸取CM對照品溶液0.02，0.10，0.20，0.40，0.50，1.00 mL，置2 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得不同濃度對照品溶液。依次以“2.1.1”項色譜條件進樣測定，記錄色譜峰面積，以色譜峰面積(Y)為縱坐標，對照品濃度(X)為橫坐標，得回歸方程：Y=14.375X-62.819(R2=0.999 9)，表明對照品濃度在4.24～169.6 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.5精密度實驗 取同一供試品溶液，重復進樣測定6次，記錄峰面積，計算峰面積RSD值為0.47%(n=6)；表明測定方法精密度良好。

2.1.6穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，在0，2，4，6，12，24 h進樣測定，計算CM供試品溶液峰面積平均值為1014.78，RSD值為0.94%(n=6)，表明CM供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

A.陰性樣品；B.對照品；C.供試品；1.馬來酸桂哌齊特。

2.1.7準確度實驗 按處方量120%、100%、80%，精密稱取CM，并按處方比例加入其他輔料，制備3種不同濃度的CM溶液，平均回收率分別為98.71%，99.70%，98.96%，RSD值分別為0.70%，1.58%，0.35%(n=3)。結(jié)果表明，均符合《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則9101項下規(guī)定。

2.2工藝過程 取磷脂、膽固醇溶解于有機溶劑中形成油相，取CM溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)中形成水相，將水相緩慢滴加到油相中，短時間間歇超聲，至形成W/O型乳劑；減壓回收溶劑，至膠態(tài)，加PBS溶液，水合，再減壓回收溶劑，即得CM-Lip混懸液。

2.3包封率的測定 采用反透析法[7]，取CM-Lip混懸液，置于250 mL錐形瓶中，加PBS(pH值5.8)稀釋至刻度，備用；取PBS(pH值=7.4)8 mL溶液置透析袋中，將透析袋置于上述錐形瓶中，并放置(37±1)℃，75 r·min-1恒溫振蕩器中，振蕩180 min，從透析袋中取出樣品5 mL，蒸干，加流動相溶解，置于5 mL量瓶，稀釋至刻度，經(jīng)孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算包封率(EE)，EE(%)=(C總-C游離)/C總×100%。式中C總為藥物總量，C游離為游離藥物總量。

2.4PBD PBD是一種在影響因素較多時，可以用較少實驗次數(shù)科學、高效的篩選出顯著影響因素的兩水平實驗設計方法[8]。根據(jù)預實驗結(jié)果綜合分析，并運用魚骨圖(圖2)分析可知，影響CM-Lip包封率的因素包括處方、方法、設備、環(huán)境四大項，共23種影響因素；通過預實驗，確定有機溶劑用量(A)、有機溶劑(乙醚：乙醇)比例(B)、水合溫度(C)、超聲時間(D)、旋蒸溫度(E)、磷脂與藥物比(F)、水合時間(G)、油相(乙醚：乙醇)與水相比例(H)為主要影響因素。采用Minitab 17.0軟件進行Plackeet- Burman設計，以主要影響因素為自變量，設定各因素兩水平(-1、+1)的取值，以包封率為因變量，設計因素水平設計見表1。

圖2 包封率的影響因素的魚骨圖

實驗結(jié)果見表2，用Minitab 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析處理，得到其回歸模型為：EE=79.6-0.135A-2.92B+0.093C+0.067D-0.487E+1.127F+4.73G+4.77H；通過對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，結(jié)果見表3，模型P值為 0.04，F(xiàn)值為7.54，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；r=0.986 5，提示回歸擬合程度較好。由圖3a、3b可知，F(xiàn)、G及H差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，對CM-Lip包封率顯著性排列為F>H>G；A、B、C、D、E對包封率無顯著性影響(P>0.05)。在水合過程中，水合溫度的變化能夠顯著影響CM-Lip的包封率，若水合溫度過高，可能導致CM-Lip的穩(wěn)定性有所下降，出現(xiàn)CM滲漏，CM-Lip包封率下降的現(xiàn)象。加入一定比例的油相(乙醚：乙醇)與水相，但當其比例較大時，超聲過程中會出現(xiàn)分層現(xiàn)象，會使CM-Lip的包封率下降，應使油相(乙醚：乙醇)與水相比恰當，進一步提高CM-Lip的包封率。當磷脂與藥物比高于最佳比例時，存在包封率下降的現(xiàn)象，當磷脂與藥物比過低時又使得空白脂質(zhì)體大量存在。

2.5響應面設計實驗 響應面法是指通過一定數(shù)量實驗次數(shù)對各個實驗因素及其因素之間的相互作用進行分析，最終得到直觀三維曲面圖用以進行評價的優(yōu)化方法[9-10]。在PBD實驗的基礎上，結(jié)合魚骨圖分析，最終選擇磷脂與藥物比例、水合時間、油相(乙醚：乙醇)與水相比例作為Box-Behnken響應面實驗的3個主要因素，每個因素分為3個水平，因素水平設計表見表4，根據(jù)Design-Expert.V8.0.6.1 軟件設計表進行實驗。以包封率為響應值，采用Box-Behnken響應面實驗法對3個因素進行優(yōu)化，實驗結(jié)果見表5。

表1 Plackeet-Burman設計因素水平

表2 Plackeet-Burman實驗結(jié)果

表3 Plackeet-Burman實驗設計的顯著性結(jié)果

應用Design-Expert.V8.0.6.1對表5進行分析，結(jié)果見表6，以包封率對各因素自變量進行模型擬合，通過擬合得到的二次回歸方程為Y=75.51+9.93×A+9.50×B-0.65×C-3.85×A×B-7.98×A×C-1.35B×C-13.15×A2-13.75×B2-0.16×C2(R2=0.950 6，失擬度檢驗F值為5.63，P=0.064 2>0.05)，由擬合方程結(jié)果可知擬合模型F值為14.98(P<0.05)，說明擬合模型擬合度高，失擬項F值較小為5.63，其P值為0.064 2>0.05，表明其失擬項不顯著性，表明該擬合模型擬合結(jié)果良好，可用于實驗結(jié)果分析，信噪比值為14.274，相對較高，證明該模型可用于實驗結(jié)果分析；二次回歸擬合方程的決定系數(shù)R2=0.950 6>0.95，證明實測值與預測值之間的相關性較高，能夠高度準確的預測實際情況。

圖3 響應值(Y)的Pareto圖(a)及正態(tài)圖(b)

表4 Box-Behnken設計因素水平設計

表5 Box-Behnken實驗設計與結(jié)果

表6 Box-Behnken設計方差分析結(jié)果

根據(jù)二次回歸方程擬合結(jié)果，將其中一個因素水平固定，進行EE對其他兩個因素的擬合，并得到實驗結(jié)果的等高線與三維效應曲面圖對CM-Lip的制備工藝參數(shù)進行優(yōu)選，圖4～6中包封率隨著各變量的增加而增加，到達最大值后逐漸下降。軟件的處方優(yōu)化的結(jié)果為：藥物與磷脂比例為1：10、油相(乙醚：乙醇)與水相比例為3：1，水合時間為1.5 h。

圖4 因素A及因素B對綜合評分EE的等高線圖和三維響應面圖

圖5 因素A及因素C對綜合評分EE的等高線圖和三維響應面圖

圖6 因素B及因素C對綜合評分EE的等高線圖和三維響應面圖

2.6驗證實驗 根據(jù)響應面實驗結(jié)果的最優(yōu)工藝，即藥物與磷脂比例為1：10、油相(乙醚：乙醇)與水相比例為3：1，水合時間為1.5 h，預測包封率為84.32%，進行驗證，結(jié)果，3批CM-Lip包封率分別為84.41%，79.16%，85.79%，平均包封率為83.12%，RSD值為0.22%，偏差較小，預測性良好，證明脂質(zhì)體最佳制備工藝的穩(wěn)定可行性。

2.7CM-Lip粉末的表征驗證

2.7.1脂質(zhì)體的形態(tài) 在最優(yōu)工藝處方條件下，取“2.2”項下制備的CM-Lip混懸液，以純化水適當稀釋后用2%磷鎢酸負染，滴至專用銅網(wǎng)上，自然揮干，靜置使粒子在銅網(wǎng)上沉積，放大倍率200 000倍，加速電壓100 kV，觀察并攝像。圖7結(jié)果顯示，CM-Lip的外觀呈不規(guī)則球形或橢球形。

圖7 馬來酸桂哌齊特脂質(zhì)體的透射電鏡圖(×200 000)

2.7.2粒徑分布與Zeta電位 在最優(yōu)工藝處方條件下，取“2.2”項下制備的CM-Lip混懸液，采用激光粒度分析儀測定粒徑及分布，結(jié)果見圖8。CM-Lip混懸液粒徑為(114.5±10.3) nm，分散系數(shù)(PDI)為0.208，說明CM-Lip混懸液粒徑分布較均勻；Zeta電位為-17.85 mV，絕對值>15 mV，表明CM-Lip混懸液穩(wěn)定，不易發(fā)生絮凝。

圖8 馬來酸桂哌齊特脂質(zhì)體粒徑分布

2.7.3CM-Lip載藥量的測定 載藥量是CM-Lip中所含藥物量的百分率[11]。有機試劑破壞法是比較常見并且容易的測定載藥量的方法。取“2.2”項下制備的CM-Lip混懸液，加甘露醇攪拌使溶解，冷凍干燥得CM-Lip粉末。精密稱取CM-Lip粉末0.60 g，用PBS(pH值7.4)充分溶解，置于10 mL量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取搖勻后溶液1 mL，置于不同離心管中，向離心管中分別加入甲醇、異丙醇、無水乙醇及其不同比例的混合溶劑6 mL，超聲、離心破壞，精密吸取離心后上清液1 mL，蒸干，殘渣加流動相溶解并定容至2 mL，搖勻，經(jīng)孔徑0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算載藥量。載藥量(%)=脂質(zhì)體中所含藥量/脂質(zhì)體總量×100%。3次測定結(jié)果分別為30.1，30.5，29.9 mg·g-1，平均載藥量為30.17 mg·g-1，RSD=1.01%。

2.7.4差示掃描量熱(differential scanning calorimetry,DSC)分析 取CM、膽固醇、甘露醇、物理混合物與“2.2”項下制備的CM-Lip混懸液，加甘露醇攪拌使溶解，冷凍干燥得CM-Lip粉末，進行DSC分析。工作條件：以空鋁坩為空白參考池，另一鋁坩為樣品池，在樣品池中放入樣品約5 mg，置于機器中進行圖譜掃描；N2作為吹掃氣，掃描速度50 ℃·min-1，掃描范圍30～300 ℃。圖9結(jié)果表明，CM在177.94 ℃時出現(xiàn)一個熔點峰，甘露醇在167.04 ℃出現(xiàn)一個熔點峰，膽固醇在153.65 ℃時出現(xiàn)一個熔點峰，但是當藥物與兩者物理混合得到物理混合物a后，測定時卻只出現(xiàn)了兩個峰，說明是藥物峰與甘露醇峰發(fā)生了重合，因此制備不含甘露醇的物理混合物，得到了物理混合物b；CM-Lip的DSC出現(xiàn)新的熔點峰，且峰值發(fā)生變化，說明形成新物質(zhì)，不是簡單地物料疊加，證明生成了CM-Lip。

a.馬來酸桂哌齊特；b.甘露醇；c.膽固醇；d.馬來酸桂哌齊特脂質(zhì)體；e.物理混合物a；f.物理混合物b。

圖9 DSC脂質(zhì)體總圖

a.cinepazide maleate；b.mannitol；c.cholesterol；d.cinepazide maleate liposomes；e.physical mixture a；f.physical mixture b.

Fig.9 General map of DSC liposomes

2.7.5紅外光譜掃描 分別取CM、膽固醇、物理混合物與“2.2”項下制備的CM-Lip混懸液，加甘露醇攪拌使溶解，冷凍干燥得CM-Lip粉末。加入適量溴化鉀固體，充分研細，裝片，壓片，在400～4000 cm-1范圍內(nèi)進行紅外分光掃描，比較各譜圖曲線，見圖10。圖10A顯示，1644 cm-1處吸收峰為膽固醇的C=C伸縮振動峰，3 404 cm-1處的吸收峰為膽固醇的-OH伸縮振動峰，2 931cm-1為-CH3的伸縮振動峰，1354～1460 cm-1為-CH3的不對稱伸縮振動。圖10C顯示，3 450 cm-1處吸收峰

圖10 膽固醇(A)、物理混合(B)、馬來酸桂哌齊特(C)、馬來酸桂哌齊特脂質(zhì)體(D)的紅外光譜圖

為CM的-OH伸縮振動峰，2 590 cm-1處吸收峰為哌嗪環(huán)叔胺鹽的N-H伸縮振動峰，1244和1121 cm-1處吸收峰分別為C-O-C的不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動，1633，1589和1499 cm-1處吸收峰為苯環(huán)的骨架伸縮振動，2976和2875 cm-1分別為CH3的-CH-不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動。圖10 B顯示具有各個簡單物質(zhì)膽固醇和CM的色譜峰。由圖10 C和圖10D顯示，當CM被制備成脂質(zhì)體以后，-CH3的不對稱伸縮振動、哌嗪環(huán)叔胺鹽的N-H伸縮振動和C-O-C不對稱伸縮振動幾乎沒有變化，說明CM進入脂質(zhì)體囊泡中。此外，CM在3450 cm-1處-OH伸縮振動峰吸收峰消失，在3400 cm-1處形成寬峰，進一步說明CM進入脂質(zhì)體囊泡中。

2.8釋放度實驗 采用體外透析法測定CM-Lip的體外釋放過程，分別取CM原料藥混懸液和與CM-Lip混懸液，分別置于250 mL量瓶中，并加PBS(pH值=5.8)稀釋定容至刻度，轉(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶中；分別放入5個含有PBS(pH值=7.4)溶液8 mL的透析袋，置于(37±1)℃、75 r·min-1的恒溫振蕩器中振蕩(儀器為不透光裝置)，分別于0.5，2，4，6，12 h將取一個透析袋，精密吸取溶液5 mL，取樣時以暗箱為轉(zhuǎn)移工具，使樣品溶液保持避光條件，并補充相同溫度PBS(pH值=7.4)的釋放介質(zhì)8 mL，蒸干，殘渣加乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鈉緩沖液溶解并稀釋定容至5 mL，搖勻，經(jīng)孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算釋放度，在相同條件下做平行實驗3次，藥物累計釋放度計算繪制藥物累計釋放曲線，并進行曲線擬合，結(jié)果見圖11。結(jié)果表明，在同一釋放介質(zhì)中，CM原料藥0.5 h達到80%，而CM-Lip釋放度為30%。CM-Lip始終保持緩慢釋放，12 h累積釋放度為76%，證明CM-Lip具有明顯的緩釋作用，解決CM半衰期短的缺點。將CM-Lip釋放曲線分別用零級、一級和Higuchi方程進行擬合，結(jié)果顯示，擬合方程及相關系數(shù)(r)分別為Q=0.062 7t+0.315 7(r=0.974)、Q=0.701 6(1-e-0.752 4t)(r=0.967)、Q=0.254 1t1/2+0.213 2(r=0.976)，Q為累積釋放度，t為時間。根據(jù)相關系數(shù)判斷，結(jié)果表明其釋藥行為符合Higuchi方程。

3 討論

脂質(zhì)體的主要組成材料為磷脂和膽固醇等，在水中能自發(fā)形成具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊泡(vesicles)[12]。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，僅采用逆向蒸發(fā)法制備的CM-Lip包封率較低，主要原因是該方法水合時間較長，易出現(xiàn)水合不完全。此外，逆向蒸發(fā)法不容易控制脂質(zhì)體的粒徑，因此通過逆向蒸發(fā)法制備CM-Lip混懸液后，再通過高壓均質(zhì)機，可使脂質(zhì)體粒徑減小且均勻，而且通過高壓均質(zhì)機的擠壓作用后進一步提高了其包封率，包封率最高為84.9%。

包封率常用來做評價脂質(zhì)體制備工藝優(yōu)劣的生物重要指標。常見測定包封率的方法有透析法、超速離心法、凝膠過濾法等。因凝膠過濾法過程復雜消耗時間以及成本較高，但是采用超速離心法離心轉(zhuǎn)速比較高，在離心的過程中造成脂質(zhì)體中藥物滲漏，不能確保脂質(zhì)體中游離藥物的分離是否完全，從而導致脂質(zhì)體的包封率較低，結(jié)果不準確；故本實驗考察透析法(正透析與反透析)與超速離心法分法測定CM-Lip的包封率，預實驗結(jié)果表明，正透析實驗結(jié)果中游離藥物一直難以達到平衡，反透析實驗結(jié)果中藥物平衡的穩(wěn)定性良好，在透析30～100 min，CM含量在一直逐步增加，150～200 min藥物游離量趨于平衡。故最終選擇反透析法測定CM-Lip包封率。乳劑的形成是逆向蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體的關鍵因素之一，前期預實驗表明有機相溶劑為乙醚與乙醇，且比例為3：1時，脂質(zhì)體包封率最大；當乙醚與乙醇的比例>3：1時，油相(乙醚：乙醇)與水相會分層，不會形成乳劑；當乙醚與乙醇的比例<3：1時，油相(乙醚：乙醇)與水相不分層，但包封率較低，因此最終選擇有機相溶劑乙醚與乙醇比值為3：1。

圖11 馬來酸桂哌齊特原料藥混懸液和馬來酸桂哌齊特脂質(zhì)體的體外釋放曲線

本研究采用魚骨分析法，對影響CM-Lip制備因素進行剖析，結(jié)合PBD及BBD，優(yōu)化CM-Lip的制備工藝。傳統(tǒng)的正交實驗設計利用線性數(shù)學模型，分析出多個因素水平的最佳組合；但正交設計只能分析離散型數(shù)據(jù)，具有預測性不佳的缺點。PBD結(jié)合BBD，采用線性模型，能求得回歸方程，通過合理預測得出最佳工藝條件。