龐晨，張錫流，張秀玲，葉星江，黃敏

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.病理科；2.藥學(xué)部，南寧 530023)

肺癌是世界上最常見惡性腫瘤之一[1]，近年來肺癌中腺癌分型發(fā)病率高于鱗狀細(xì)胞癌，且5年生存率較低[2-3]。盡管目前治療肺癌方法較多，并且取得一定的進(jìn)展，但臨床研究數(shù)據(jù)表明[4]，很多肺腺癌患者在確診時往往處于癌癥中末期，失去手術(shù)治療的機(jī)會。當(dāng)然，放射治療(放療)和化學(xué)治療(化療)等治療手段也常用于該腫瘤的治療，但這些手段副作用大，且對于大多中晚期患者效果甚微[5]。因此，迫切需要尋求新的治療方法和藥物。據(jù)研究[6]，鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraet Migo)含有多種活性成分，具有保肝、抗疲勞、降糖以及護(hù)胃等作用[7]，具有很高的藥用價值。更有研究表明，鐵皮石斛對乳腺癌[8]、消化道惡性腫瘤[6-7]、肺癌等多種惡性腫瘤有預(yù)防和抑制作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)[9]，連續(xù)食用鮮鐵皮石斛可提高中晚期非小細(xì)胞肺癌患者化療后整體生活質(zhì)量，并明顯延長患者無進(jìn)展生存期。通過前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證明[10]，綜合抑瘤率、移植瘤組織壞死情況以及移植瘤生長曲線初步得出鐵皮石斛可以通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞及其組織的壞死，達(dá)到抑制移植瘤體積生長的目的；其中高濃度鐵皮石斛用藥組藥效更加穩(wěn)定。而鐵皮石斛作用機(jī)制有待進(jìn)一步的探究和分析。在肺癌發(fā)展過程中往往伴有相關(guān)基因表達(dá)的改變，因此，筆者在本實(shí)驗(yàn)建立肺腺癌裸鼠移植瘤模型，進(jìn)一步分析中藥鮮鐵皮石斛對肺腺癌移植瘤的抑制情況及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 無特定病原體(SPF) 級BLB/c裸鼠30只，雄雌各半，3～5 周齡，體質(zhì)量(16±2)g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2016-0002。自由飲水和攝食，動物房恒溫22 ℃，相對濕度60%。

1.1.2儀器 5410 型低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf 公司)；BSC-1300Ⅱ B2 型生物安全柜(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)，7500 Fast型實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)系統(tǒng)(美國 Applied Biosystems 公司)。倒置顯微鏡(日本 Olympus 公司)，電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，感量：0.01 mg]。

1.1.3藥材 鮮鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)，來源于廣西上林縣，新鮮鐵皮石斛切碎加純水，料理機(jī)制得鐵皮石斛漿，離心除渣，濃縮滅菌，4 ℃ 保存?zhèn)溆?每毫升相當(dāng)于鮮藥材0.68 g)。本藥品由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部制劑中心制得，并由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部黃敏主任中藥師鑒定為正品。

1.1.4藥品與試劑 環(huán)磷酰胺(百特醫(yī)療用品貿(mào)易有限公司，批號：8F246A)，胎牛血清(FBS，南美Lonsa公司)、鼠抗人ki67單克隆抗體及免疫組化(SP法)試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號分別為1907170672h、190704S407b。Beclin1單克隆抗體(美國Abcam公司，批號：GR3204186-2)。RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于天根生化科技(北京)有限公司，批號分別為RN05004M、FP205-02。

1.1.5細(xì)胞 人肺腺癌A549細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫，后由實(shí)驗(yàn)室接種并保存。

1.2A549肺腺癌細(xì)胞培養(yǎng) 生物安全柜紫外照射30 min后，將肺腺癌A549細(xì)胞置于含有配好達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle's medium，DMEM)中(FBS、青霉素-鏈霉素溶液和DMEM高糖比例10：1：90)，在37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并保存A549細(xì)胞，每天潤洗換液。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到臨界值(約80%覆蓋率)時，收集細(xì)胞并傳代。

1.3A549肺腺癌細(xì)胞收集 在細(xì)胞生長的對數(shù)階段，細(xì)胞處于良好狀態(tài)。在細(xì)胞中加入胰酶進(jìn)行消化，離心處理后，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)。再次離心后，加入供種植移植瘤所需要PBS(每只裸鼠種植0.1 mL，含細(xì)胞1×107個)。

1.4動物分組及造模 裸鼠適應(yīng)約1周，取30只。隨機(jī)取5只，作為空白對照組，25只進(jìn)行腫瘤模型的建立。腹腔注射戊巴比妥 0.1 mL·(10 g)-1。取肺腺癌A549單細(xì)胞懸液，皮下注射至裸鼠右側(cè)背部0.1 mL。7 d后出現(xiàn)腫瘤，觀察裸鼠成瘤情況。25只裸鼠在細(xì)胞接種后7 d成瘤，第10天腫瘤達(dá)到90～110 mm3。造模大鼠再隨機(jī)分為5組，模型對照組，環(huán)磷酰胺組，鐵皮石斛小、中、大劑量組，每組5只。

1.5動物給藥方法 環(huán)磷酰胺組腹腔注射環(huán)磷酰胺0.025 g·kg-1，每隔1天給藥，共13次；鐵皮石斛小、中、大劑量組分別灌胃給予0.68 g·mL-1鐵皮石斛6.25，12.50，25.00 g·kg-1，連續(xù)25 d?？瞻讓φ战M和模型對照組灌胃0.9%氯化鈉溶液，每天30 mL·kg-1，連續(xù)25 d。

1.6裸鼠移植瘤體生長情況以及取材 每天在固定時間段內(nèi)觀察被接種細(xì)胞裸鼠的活動、精神、飲食、瘤體生長情況。每3天測定小鼠腫瘤體積(腫瘤體積=長×寬2×0.5)及體質(zhì)量，4周后處死動物。取移植瘤時，冰上操作，用無酶鑷子和眼科剪剝離出完整的移植瘤，快速將周圍脂肪和壞死組織，以及包膜、血水去除，用眼科剪剪成兩塊，其中一塊迅速放入RNA保存液中，置于冰上，經(jīng)梯度凍存(4 ℃ 20 min，-20 ℃ 50 min，-80 ℃)待用。另一塊置于10%甲醛溶液中固定保存待用。

1.7免疫組化方法檢測瘤體Beclin1、Ki67的表達(dá) 常規(guī)石蠟包埋及切片(厚度4 μm)；取一定量pH值6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波爐中，脫蠟、水化；封閉后，分別加一抗Beclin1(1：80)、Ki67，4 ℃過夜，加二抗37 ℃孵育30 min(MaxVision-HRP鼠/兔二抗)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。評判標(biāo)準(zhǔn)：由兩位病理科主治及以上醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行閱片。

根據(jù) 5 個 400倍隨機(jī)視野內(nèi) Beclin1染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例判定。Beclin1顯示胞質(zhì)陽性。染色強(qiáng)度分別是不著色、淡黃色、棕黃色、黃褐色，分別對應(yīng)0 分、1 分、2 分、3 分。陽性細(xì)胞(胞質(zhì)有黃色或黃棕褐色顆粒)<5%、5%～25%、>25%～50%、>50%～75%、> 75% 分別對應(yīng) 0 ，1，2，3 ，4分。

表達(dá)強(qiáng)度=染色強(qiáng)度X陽性細(xì)胞，陰性(-)、弱陽性(+)、中陽性(++)、強(qiáng)陽性(+++)分別對應(yīng)總分0 分、1～4分、5～8分、9 ～12分；“- ”為不表達(dá)，“+”為低表達(dá)，“++”及以上為高表達(dá)[11]。

Ki-67的陽性表達(dá)根據(jù)細(xì)胞著色的強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)綜合判定結(jié)果，其陽性表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn)為: 染色強(qiáng)度分別是不著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色，分別對應(yīng)0 分、1 分、2 分、3 分，于高倍鏡下(×400)計算每張切片陽性細(xì)胞百分率，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比打分: <5%判為0分，5%～<25%判為1分，25%～<50%判為2分，≥50%判為3分，并以每個組織著色程度及染色細(xì)胞百分率得分相加的和為最后得分：0～1分為陰性(-)，2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，5～6分為強(qiáng)陽性(+++)[12]。

1.8RT-PCR方法 檢測瘤體表皮生長因子(EGFR)、p53、p16 mRNA表達(dá)取瘤體組織50 mg，提取總RNA后，用Avian Myeloblastosis Virus逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以β-actin作為內(nèi)參，檢測 EGFR、p53 和p16 mRNA的表達(dá)。建立RT-PCR 反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，β-actin的上、下游引物各0.6 μL，EGFR，p53和p16上、下游引物各0.6 μL，RNase-free ddH2O加至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，15 min；95 ℃，10 s；60 ℃，32 s。計算2-△△CT，得出數(shù)據(jù)以模型對照組數(shù)值為1，比較環(huán)磷酰胺組及鐵皮石斛小，中，大劑量組表達(dá)量，與模型對照組比較，數(shù)值>1則為上調(diào)，數(shù)值<1則為下調(diào)。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1用藥裸鼠狀態(tài)比較 鐵皮石斛給藥前，各組裸鼠生長情況和精神狀態(tài)正常。灌胃給藥后，與空白對照組比較，鐵皮石斛小、中、大劑量組裸鼠精神、活動、食欲差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與模型對照組比較，鐵皮石斛小、中、大劑量組肺腺癌移植瘤生長較慢，環(huán)磷酰胺組移植瘤同樣生長緩于模型對照組，但與空白對照組比較，環(huán)磷酰胺組裸鼠出現(xiàn)活力降低、精神萎靡。

2.2腫瘤移植瘤瘤體體積變化情況 前期研究表明[10]，不同濃度鐵皮石斛均對肺腺癌移植瘤有一定的抑制作用。環(huán)磷酰胺組和鐵皮石斛小、中、大劑量組抑瘤率分別達(dá)到62.0%，51.0%，52.0%，56.0%，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。與模型對照組比較，鐵皮石斛小、中、大劑量組腫瘤體積生長緩慢，且抑瘤率高。其中鐵皮石斛大劑量組瘤體(平均0.9 cm)較模型對照組(平均1.8 cm)明顯縮小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2移植瘤形態(tài)學(xué)改變情況

2.2.1肉眼觀察移植瘤大體 早期裸鼠移植瘤瘤體光滑，多為圓形或橢圓球狀，隨著時間推移，裸鼠移植瘤瘤體形狀開始出現(xiàn)不規(guī)則現(xiàn)象，個別移植瘤瘤體表面會出現(xiàn)凹凸不平。模型對照組由于瘤體體積大，瘤體表面會有破潰出現(xiàn)。剝離的移植瘤與皮下組織分界清楚，少有浸潤性粘連現(xiàn)象，移植瘤瘤體肉眼觀見大部分呈現(xiàn)淡紅色，多數(shù)呈圓球狀或橢圓球狀，瘤體質(zhì)地堅硬，切開橫斷面組織呈蒼白色，可見血管。

2.2.2移植瘤組織壞死情況 前期研究結(jié)果顯示[10]，模型對照組可見肺腺癌腺體，癌細(xì)胞排列緊密且均勻，癌細(xì)胞核仁體積大，出現(xiàn)核分葉，雙核，巨核以及核分裂象增多，有細(xì)胞核漿比例失調(diào)的現(xiàn)象，失去正常的細(xì)胞形態(tài)。移植瘤組織癌細(xì)胞壞死面積較少。環(huán)磷酰胺組和鐵皮石斛小、中、大劑量組移植瘤組織癌細(xì)胞均有不同程度壞死，癌細(xì)胞相比于模型對照組數(shù)目少，癌細(xì)胞完整性差，細(xì)胞壞死部分有核溶解，核固縮和碎裂等現(xiàn)象。與模型對照組比較，鐵皮石斛小，中，大劑量組移植瘤組織細(xì)胞壞死面積顯著升高。組間進(jìn)行比較，鐵皮石斛大劑量組和環(huán)磷酰胺組壞死面積多個視野達(dá)到一半以上，鐵皮石斛中，小劑量組同樣可見移植瘤組織細(xì)胞壞死。見圖1。

2.3Beclin1蛋白表達(dá)情況觀察 結(jié)果顯示，自噬基因Beclin1蛋白在模型對照組中低表達(dá)。鐵皮石斛干預(yù)后，與模型對照組比較，鐵皮石斛中劑量組和大劑量組、環(huán)磷酰胺組Beclin1陽性高表達(dá)率逐漸升高，且呈劑量依賴性特點(diǎn)，其中環(huán)磷酰胺組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.412，P<0.05)，見圖2，表2。

2.4Ki67免疫組化表達(dá)情況觀察 結(jié)果顯示，增殖指數(shù)Ki67蛋白在模型對照組中呈現(xiàn)高表達(dá)，經(jīng)鐵皮石斛干預(yù)用藥后，與模型對照組比較，鐵皮石斛大劑量組以及環(huán)磷酰胺組的增殖指數(shù)Ki67陽性率逐漸降低，且呈劑量依賴性特點(diǎn)，其中環(huán)磷酰胺組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.412，P<0.05)，見圖3，表2。

2.5EGFR、p16、p53mRNA表達(dá) 結(jié)果見表3。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型對照組比較，鐵皮石斛大劑量和中劑量組裸鼠移植瘤組織中EGFR mRNA水平均顯示下調(diào)。其中，鐵皮石斛大劑量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，鐵皮石斛中劑量和小劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。與模型對照組比較，鐵皮石斛大，中，小劑量組裸鼠移植瘤組織中p53和p16mRNA水平均顯示上調(diào)。其中，鐵皮石斛大劑量和中劑量組裸鼠移植瘤組織中p16mRNA差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，鐵皮石斛小劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型對照組比較，鐵皮石斛大，中，小劑量組裸鼠移植瘤組織中的p53 mRNA均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表3。

A.模型對照組；B.環(huán)磷酰胺組；C鐵皮石斛大劑量組；D鐵皮石斛中劑量組；E鐵皮石斛小劑量組。

A.模型對照組；B 環(huán)磷酰胺組；C鐵皮石斛大劑量組；D鐵皮石斛中劑量組；E鐵皮石斛小劑量組。

A.模型對照組；B 環(huán)磷酰胺組；C鐵皮石斛大劑量組；D鐵皮石斛中劑量組；E鐵皮石斛小劑量組。

表2 5組裸鼠移植瘤Beclin1和Ki67蛋白表達(dá)的陽性率比較

表3 5組裸鼠腫瘤組織中EGFR、p16、p53mRNA表達(dá)

3 討論

我國肺癌發(fā)病率也在不斷上升，且腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致患者病死率越來越高[13-14]。尋找更為有效的治療方法和緩解藥物是當(dāng)前臨床醫(yī)學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。鐵皮石斛證明有抗癌的效用[15]，但其抑制肺癌的作用機(jī)制尚不明確。有臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鐵皮石斛治療患者實(shí)體瘤療效總有效率要優(yōu)于使用臨床常規(guī)化療方案組，且患者因化療導(dǎo)致的毒副作用得到緩解。這提示鐵皮石斛可提高中晚期非小細(xì)胞肺癌患者化療后的整體生活質(zhì)量，并明顯延長患者無進(jìn)展生存期。

本實(shí)驗(yàn)所采用的BALB/c品系裸鼠由于缺少免疫器官免疫力低下，對異種人肺腺癌細(xì)胞無排斥反應(yīng)。種植后肺腺癌細(xì)胞移植瘤組織形態(tài)良好，根據(jù)《現(xiàn)代腫瘤治療藥物學(xué)》關(guān)于抗腫瘤中藥有效的標(biāo)準(zhǔn)，抑瘤率>30%則代表抑制腫瘤有效，根據(jù)筆者前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，鐵皮石斛對A549細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長具有抑制作用。此外，經(jīng)鐵皮石斛干預(yù)的移植瘤組織癌細(xì)胞均有不同程度壞死，高劑量鐵皮石斛用藥組壞死面積多個視野達(dá)到一半以上[10]。

EGFR參與多種實(shí)體腫瘤疾病進(jìn)展過程，EGFR的下調(diào)使非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖活力以及侵襲能力降低[16]。此外，與EGFR相關(guān)通路磷酸化激活的抑制可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤血管生成，降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[17]。本實(shí)驗(yàn)過程結(jié)果顯示，與模型對照組比較，鐵皮石斛大劑量和中劑量組裸鼠移植瘤組織中EGFR mRNA水平均顯示下調(diào)。其中，環(huán)磷酰胺組和鐵皮石斛大劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) 。根據(jù)前述研究，提示鐵皮石斛可通過下調(diào)EGFR mRNA的表達(dá)達(dá)到抑制肺腺癌移植瘤生長，同時推測其抑制肺腺癌的作用機(jī)制可能通過與抑制EGFR相關(guān)通路激活有關(guān)。

自噬在促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡中起到積極作用，抑制自噬意味限制細(xì)胞克服壓力和維持體內(nèi)平衡的能力。在腎部腫瘤組織中，自噬相關(guān)基因Beclin1表達(dá)低于正常組織，而Beclin1的低表達(dá)腫瘤患者預(yù)后比Beclin1高表達(dá)的腫瘤患者差[18]。同樣，Beclin1對非小細(xì)胞肺癌有抑癌作用，低表達(dá)的Beclin1導(dǎo)致肺癌中的自噬體形成減少，腫瘤細(xì)胞的自噬能力降低，異常的腫瘤細(xì)胞凋亡減少且有持續(xù)增加的趨勢，最終導(dǎo)致肺癌的發(fā)生發(fā)展[19]。Beclin1通過誘導(dǎo)自噬的發(fā)生抑制肺癌，且Beclin1陽性表達(dá)水平和腫瘤體積、TNM分期呈負(fù)相關(guān)，同分化程度呈正相關(guān)[20]。這與本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果中Beclin1在模型對照組高表達(dá)一致。此外，在肺腺癌進(jìn)展過程中，發(fā)現(xiàn)Beclin1基因表達(dá)呈下降趨勢，而Beclin1低表達(dá)會抑制癌細(xì)胞的自噬功能，癌細(xì)胞的凋亡受到抑制，導(dǎo)致癌細(xì)胞的惡性增殖，促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。而本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，鐵皮石斛大，中劑量組以及環(huán)磷酰胺組肺腺癌移植瘤中Beclin1陽性表達(dá)率較模型對照組升高，分析鐵皮石斛可能通過上調(diào)自噬相關(guān)基因Beclin1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞自噬，最后抑制肺腺癌腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。另有研究者表明，Beclin1是維持肺腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵組成部分，它可以通過介導(dǎo)自噬機(jī)制抑制腫瘤發(fā)生，其異常表達(dá)常會破壞自噬和凋亡通路[21]。由此可見，自噬基因Beclin1的表達(dá)與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在一定條件下可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。另有研究表明，p53和Beclin1可以通過Beclin1-p53相互作用，研究者提出[22]，BECN1+/-細(xì)胞中Beclin1水平的降低可能通過促進(jìn)Bcl-2的活性，從而增加細(xì)胞存活，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。其中Bcl-2的凋亡相關(guān)Bax蛋白是p53下游的應(yīng)答蛋白，協(xié)同參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)過程。Beclin1的減少會導(dǎo)致p53水平低下，可能導(dǎo)致DNA的損傷以及促進(jìn)基因組的不穩(wěn)定性，最后導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鐵皮石斛給藥組裸鼠移植瘤組織中p53 mRNA水平均顯示上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示鐵皮石斛抑制A549肺腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制可能通過上調(diào)腫瘤自噬相關(guān)基因Beclin1和抑癌基因p53有關(guān)，過表達(dá)Beclin1會上調(diào)p53，提示可能通過Beclin1-p53途經(jīng)相互作用，修復(fù)基因不穩(wěn)定性，抑制腫瘤發(fā)生。

p16是檢測腫瘤常用指標(biāo)，同時也是最受關(guān)注的抑癌基因之一[23]，其作為一種腫瘤抑制劑，可以阻止細(xì)胞周期的進(jìn)展和增殖，參與誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[24]。在過表達(dá)p16的轉(zhuǎn)基因小鼠中，細(xì)胞增殖顯著減少，組織再生相應(yīng)減少[25]。有研究發(fā)現(xiàn)[26]，p16基因的突變是小鼠惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的驅(qū)動因素，它參與并調(diào)控細(xì)胞周期，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞異常增殖的目的[27]，對腫瘤細(xì)胞起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用[28]。高越等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在p16低表達(dá)的非小細(xì)胞癌患者更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，越是晚期的患者p16 蛋白的缺失情況越明顯。本實(shí)驗(yàn)中各劑量鐵皮石斛給藥組裸鼠移植瘤組織中的p16 mRNA水平上調(diào)，鐵皮石斛中，大劑量組裸鼠移植瘤組織中p16 mRNA差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。武世伍等[30]對非小細(xì)胞肺癌中p16和Ki67進(jìn)行了相關(guān)性分析，研究發(fā)現(xiàn)癌組織中Ki67的表達(dá)水平同p16表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。這提示p16和 Ki67和非小細(xì)胞肺癌的增殖發(fā)生相關(guān)，且抑癌基因p16可能與增殖指數(shù)Ki67協(xié)同作用。其中增殖因子Ki67是細(xì)胞增殖的標(biāo)志，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和判斷腫瘤細(xì)胞活性有著重要意義。Ki67陽性預(yù)示著肺癌細(xì)胞增殖活躍，病情容易進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ki67蛋白經(jīng)鐵皮石斛干預(yù)后，與模型對照組比較，鐵皮石斛大劑量組、環(huán)磷酰胺組Ki67陽性率降低。各劑量鐵皮石斛給藥組裸鼠移植瘤組織中p16 mRNA水平顯示上調(diào)。其中，鐵皮石斛大劑量組和中劑量組裸鼠移植瘤組織中p16 mRNA差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。據(jù)如上文獻(xiàn)以及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果所述，提示鐵皮石斛抑制A549肺腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制可能與上調(diào)抑癌基因p16和抑制癌增殖因子Ki67有關(guān)，可能通過p16和Ki67之間的負(fù)調(diào)控關(guān)系相互制約維持平衡，最后達(dá)到抑制肺腺癌發(fā)生發(fā)展的目的。

綜上所述，鐵皮石斛抑制肺腺癌裸鼠移植瘤組織的作用機(jī)制可能與自噬相關(guān)因子Beclin1相關(guān)，通過Beclin1-p53和p16-Ki67相互協(xié)同作用以及調(diào)控與腫瘤血管生成相關(guān)因子EGFR表達(dá)量實(shí)現(xiàn)抑制移植瘤組織生長的目的，可能通過啟動細(xì)胞自噬從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。