吳君怡, 余 淼, 孫仕晨, 樊壯壯, 鄭靜蕾, 張劉陶, 馮海蘭, 劉 洋△, 韓 冬△

(1. 北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，修復(fù)科 國(guó)家口腔疾病臨床研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081； 2. 深圳市口腔醫(yī)院種植修復(fù)科，深圳 518001； 3. 北京醫(yī)院口腔科 國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院，北京 100010)

外胚層發(fā)育不良(ectodermal dysplasia, ED)是一類(lèi)涉及兩種和兩種以上外胚層來(lái)源器官發(fā)育異常的疾病，可造成全身多個(gè)系統(tǒng)的缺陷，至今已報(bào)道170余種病理?yè)p害，具有顯著的遺傳性[1-2]，其中最常見(jiàn)的是少汗性外胚層發(fā)育不良(hypohidrotic ectodermal dysplasia, HED)。HED是一種罕見(jiàn)的先天遺傳性疾病，新生兒發(fā)病率約為十萬(wàn)分之七[3]。HED患者的典型臨床表現(xiàn)為“三聯(lián)征”，包括汗腺發(fā)育異常、毛發(fā)稀疏和牙齒發(fā)育異常，具體表現(xiàn)為汗腺分泌功能低下甚至喪失導(dǎo)致的少汗或無(wú)汗，皮膚薄且干燥，常有濕疹；毛發(fā)卷曲且稀少；多數(shù)乳恒牙甚至全部乳恒牙先天缺失，余留牙為錐形牙或過(guò)小牙[2]。此外，患者常伴有特殊面容，如：前額突出，眼周色素沉著，眼周皮膚多皺，鞍狀鼻，上頜發(fā)育不足，上、下唇外翻等[4]。目前， HED已明確的遺傳方式有3種：常染色體顯性、常染色體隱性以及X連鎖遺傳。65%～75%的HED病例為X連鎖遺傳，主要與定位于人類(lèi)染色體Xq12-13.1的ectodysplasinA(EDA)基因突變相關(guān)，而常染色體顯性或隱性遺傳的HED多與ectodysplasinAreceptor(EDAR，定位于2q11-13)基因及EDARassociateddeathdomain(EDARADD，定位于1q42.3-43)基因的突變相關(guān)[5-6]。

EDA基因?qū)儆谀[瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)超家族成員，共有9個(gè)外顯子，約95%的基因變異發(fā)生在第1、3、5、8、9外顯子上[7-8]。EDA蛋白是Ⅱ型跨膜蛋白，包含一個(gè)短的胞內(nèi)區(qū)、單一跨膜區(qū)和一個(gè)長(zhǎng)的胞外區(qū)[9]。EDA蛋白有4個(gè)重要的功能結(jié)構(gòu)域，分別為：(1)跨膜域：由第1外顯子參與編碼，負(fù)責(zé)跨膜運(yùn)輸；(2)前體蛋白加工酶furin識(shí)別序列：由第3外顯子參與編碼，是EDA前體蛋白發(fā)生裂解的識(shí)別位點(diǎn)；(3)膠原樣結(jié)構(gòu)域：由第5～6外顯子參與編碼，負(fù)責(zé)維持TNF結(jié)構(gòu)域正常折疊構(gòu)象的形成，促進(jìn)TNF結(jié)構(gòu)域的多聚化；(4)TNF結(jié)構(gòu)域：由第7～9外顯子參與編碼，是EDA與下游受體EDAR結(jié)合的重要區(qū)域[10]。研究報(bào)道顯示，EDA基因變異中37.8%的變異位點(diǎn)位于TNF結(jié)構(gòu)域，22.0%的變異位點(diǎn)位于膠原樣結(jié)構(gòu)域，7.3%的變異位點(diǎn)位于跨膜域， 7.3%的變異位點(diǎn)位于前體蛋白加工酶furin識(shí)別序列[11]。

小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育第14天，可在上皮基底層檢測(cè)到Eda的表達(dá)；在胚胎發(fā)育第15天，可在蕾狀期牙胚上皮中檢測(cè)到Eda的表達(dá)，隨后，Eda可在牙胚間充質(zhì)中持續(xù)性表達(dá)至帽狀期末期[12]。此外，EDA在人體多種組織均有表達(dá)，包括毛囊、神經(jīng)外皮、胸腺、骨和上皮等，可參與人類(lèi)牙齒、毛發(fā)、皮膚等組織器官的形成[8, 13-14]。EDA基因突變除與HED相關(guān)外，還可導(dǎo)致單純型先天缺牙[3, 15]。

截至目前，人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)已收錄300余種EDA基因突變類(lèi)型。盡管已明確的與HED有關(guān)的EDA基因突變超過(guò)140余種，約50%是錯(cuò)義突變[11, 16]，但是新的EDA基因突變?nèi)杂写l(fā)現(xiàn)，與牙齒缺失位點(diǎn)有關(guān)的基因型-表型相關(guān)性分析仍有待完善。本研究擬對(duì)近年來(lái)臨床收集到的HED患者進(jìn)行EDA基因致病突變的篩查，旨在發(fā)現(xiàn)新檢出的突變，并對(duì)HED患者的臨床表型及缺失牙位進(jìn)行基因型-表型相關(guān)性分析。

1 資料與方法

1.1 病例收集

在就診于北京大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科的先天缺牙患者中，收集臨床表現(xiàn)為毛發(fā)稀少、汗腺功能異常、X線(xiàn)檢查證實(shí)缺牙區(qū)無(wú)恒牙胚的患者。本試驗(yàn)獲得北京大學(xué)口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：PKUSSIRB-201736082)， 研究對(duì)象包括患者和健康人均簽署知情同意書(shū)。

1.2 基因組DNA提取

提取患者及家系成員的外周靜脈血，經(jīng)乙二胺四乙酸抗凝劑抗凝后，使用全血基因組DNA提取試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國(guó))， 按照操作說(shuō)明提取基因組DNA。對(duì)于不便獲取外周靜脈血的患者及家系成員，使用GeneFiXTM唾液收集裝置(Isohelix公司，英國(guó))采集唾液，使用GeneFiXTM唾液DNA分離試劑盒提取基因組DNA。提取完成的基因組DNA置于-20 ℃保存。

1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、Sanger測(cè)序及單克隆測(cè)序

使用引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)設(shè)計(jì)涵蓋EDA基因編碼區(qū)外顯子的8對(duì)引物，使用DNA聚合酶(博邁德公司，中國(guó))對(duì)先證者DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)， 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后進(jìn)行Sanger測(cè)序(睿博興科生物公司，中國(guó))。使用DNA序列分析軟件Chromas2.6對(duì)DNA序列峰圖進(jìn)行分析，使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與正常人群的EDA基因序列(NM_001399.5)進(jìn)行比對(duì)。對(duì)于在女性攜帶者中檢測(cè)出的EDA雜合突變，利用CloneSmarter-TOPO載體克隆試劑盒(CloneSmarter公司，美國(guó))對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單克隆測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證變異(睿博興科生物公司，中國(guó))。

1.4 突變蛋白功能預(yù)測(cè)及致病性分級(jí)

在人類(lèi)基因組整合數(shù)據(jù)庫(kù)(https://gnomad.broadinstitute.org/)中檢索檢測(cè)出的EDA基因突變位點(diǎn)，去除最小等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)大于0.01的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn)，使用在線(xiàn)軟件Polyphen 2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)、MutationTaster(http://www.mutationtaster.org/)和Provean(http://provean.jcvi.org/index.php)分別對(duì)檢測(cè)出的EDA基因錯(cuò)義突變進(jìn)行蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)。使用《美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會(huì)遺傳變異致病性分級(jí)指南》對(duì)檢測(cè)出的突變進(jìn)行致病性評(píng)估。

1.5 保守性分析及蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)獲取不同物種的EDA蛋白序列，下載FASTA格式數(shù)據(jù)，使用T-coffee數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee)對(duì)檢測(cè)出的EDA蛋白突變位點(diǎn)進(jìn)行保守性分析。

通過(guò)Swiss-model數(shù)據(jù)庫(kù)(https://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行EDA蛋白同源建模，對(duì)突變蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。獲取EDA-A1剪切體模板(第233～391位氨基酸)，將模板導(dǎo)入到PyMOL 2.4.0軟件中，通過(guò)修改突變位點(diǎn)的氨基酸，對(duì)突變EDA蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。對(duì)于突變位點(diǎn)位于第233位氨基酸前的突變，通過(guò)MutationTaster數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mutationtaster.org/)獲取突變后的氨基酸序列，使用Psipred 4.0軟件對(duì)突變EDA蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。

1.6 EDA基因突變相關(guān)的HED患者恒牙缺失牙位統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)臨床和X線(xiàn)檢查結(jié)果，對(duì)檢測(cè)出EDA基因突變的HED患者的缺失恒牙進(jìn)行匯總和統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，左、右側(cè)同名牙位缺失牙數(shù)目的對(duì)比使用配對(duì)數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)。分別計(jì)算不同牙位缺牙率(該牙位缺失牙數(shù)目/該牙位牙總數(shù))， 采用PRISM 8軟件分別對(duì)不同牙位缺牙率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，并繪制缺牙率圖，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 變異檢測(cè)及功能預(yù)測(cè)

本研究在12個(gè)HED家系中發(fā)現(xiàn)8個(gè)家系的9例HED男性患者分別攜帶8個(gè)EDA基因突變，檢出率為66.67%(圖1)， 分別是：移碼突變c.619delG(p.Gly207Profs*73)，無(wú)義突變c.676C>T(p.Gln226*)，錯(cuò)義突變c.164T>C(p.Leu55Pro)、c.457C>T(p.Arg153Cys)、c.466C>T(p.Arg156Cys)、c.584G>A(p.Gly195Glu)、c.673C>T(p.Pro225Ser)和c.905T>G(p.Phe302Cys)，其中，#632先證者和#688先證者(圖1A、B)攜帶相同的EDA基因突變c.457C>T(p.Arg153Cys)；#362先證者(圖1E)攜帶2個(gè)不同的EDA基因突變c.673C>T(p.Pro225Ser)和c.676C>T(p.Gln226*)。在檢出的8個(gè)EDA基因突變中，c.619delG(p.Gly207Profs*73)、c.676C>T(p.Gln226*)、c.164T>C(p.Leu55Pro)、c.673C>T(p.Pro225Ser)和c.905T>G(p.Phe302Cys)是未報(bào)道過(guò)的新檢出的突變。

A-H, pedigree and EDA gene sequencing chromatograms， semicircle shade indicates female carrier with hypodontia and hypotrichosis, quarter-circle shades indicate female carriers with hypodontia.

檢出的8個(gè)EDA基因突變?cè)谌祟?lèi)基因組整合數(shù)據(jù)庫(kù)中均未檢索到，綜合使用在線(xiàn)軟件Polyphen-2、Mutation Taster以及Provean預(yù)測(cè)變異蛋白的功能影響，根據(jù)《美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會(huì)遺傳變異致病性分級(jí)指南》，發(fā)現(xiàn)這些突變表現(xiàn)為不同程度的致病性(表1)。對(duì)8個(gè)家系可獲得的家系成員進(jìn)行EDA基因突變檢測(cè)，#742先證者的母親(圖1C)未檢測(cè)到EDA基因突變，證明#742先證者攜帶的EDA基因突變是新發(fā)突變(denovomutation)；其余7個(gè)家系中先證者的母親均可檢測(cè)到與先證者一致的EDA基因突變，證明這些家系中先證者的EDA基因突變均分別遺傳自其母親。

表1 本研究中檢測(cè)出的EDA基因突變

2.2 HED 患者的臨床表型

本研究在8個(gè)家系中共篩查出9例攜帶EDA基因突變的男性HED患者(圖2)，均有毛發(fā)稀疏、皮膚干燥、汗腺功能減退以及HED相關(guān)特殊面容(圖2A、D、H、O)?？谇槐硇鸵彩值湫停憩F(xiàn)為多數(shù)牙乳恒牙先天缺失，余留前牙呈錐形或過(guò)小牙(圖2B、C、F、I、J、L～N、P～V)。值得注意的是，#688先證者除典型的毛發(fā)稀疏，汗腺功能減退以及多數(shù)牙缺失外，還表現(xiàn)出先天性乳頭乳暈缺如(圖2K)， 這一表型在EDA基因突變的HED患者中尚未見(jiàn)報(bào)道。

2.3 保守性分析及變異蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì)檢測(cè)出的EDA基因的6個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)進(jìn)行保守性分析，發(fā)現(xiàn)這些突變位點(diǎn)在不同物種間均高度保守(圖3)。對(duì)錯(cuò)義突變p.Phe302Cys進(jìn)行EDA突變蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)第302位氨基酸由含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的苯丙氨酸替換為含有二硫鍵的半胱氨酸，使蛋白構(gòu)象發(fā)生改變(圖4A～D)。對(duì)錯(cuò)義突變p.Leu55Pro、p.Arg153Cys、p.Arg156Cys、p.Gly195Glu、p.Pro225Ser、p.Gln226* 和p.Gly207Profs*73進(jìn)行EDA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)p.Leu55Pro、p.Arg153Cys、p.Arg156Cys和p.Gly195Glu導(dǎo)致EDA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊發(fā)生改變(圖4E～I(xiàn))；無(wú)義突變p.Gln226*導(dǎo)致EDA蛋白第266位氨基酸后的結(jié)構(gòu)缺失，蛋白顯著截短(圖4J)；移碼突變p.Gly207Profs*73導(dǎo)致EDA蛋白自207位氨基酸開(kāi)始發(fā)生序列改變，在之后的73個(gè)氨基酸位置發(fā)生翻譯提前中止，使蛋白長(zhǎng)度顯著截短(圖4K)。

2.4 EDA突變相關(guān)的HED患者恒牙缺牙數(shù)目和缺失牙位的統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)檢測(cè)出的9例攜帶EDA基因突變的男性HED患者的恒牙缺牙數(shù)目及缺失牙位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表2)，分別記錄不同患者上頜右側(cè)、上頜左側(cè)、下頜右側(cè)、下頜左側(cè)缺失牙數(shù)目情況。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后得到如下結(jié)果：(1)患者缺失牙位呈左、右對(duì)稱(chēng)分布，左、右側(cè)同名牙之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，因此后續(xù)將左、右側(cè)缺失牙數(shù)目進(jìn)行合并統(tǒng)計(jì)；(2)患者平均缺失牙數(shù)目為(13.86±4.49)顆，其中上頜平均缺失牙數(shù)目為(13.14±5.76)顆，缺失率為73.02%，下頜平均缺失牙數(shù)目為(14.57±3.05)顆，缺失率為80.95%，上、下頜缺失牙數(shù)目差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；(3)在上頜牙列中，側(cè)切牙和第二前磨牙缺失率最高，為100%(18/18)，而上頜中切牙缺失率最低，為11.11%(2/18)，其次為上頜第一磨牙，缺失率為55.56%(10/18，圖5A)，上頜這四個(gè)牙位缺牙率對(duì)比平均缺牙率76.98%(194/252)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(4)在下頜牙列中，側(cè)切牙缺失率最高，為100%(18/18)，而下頜第一磨牙缺失率最低，為55.56%(10/18)(圖5B)，下頜這兩個(gè)牙位缺牙率對(duì)比平均缺牙率76.98%(194/252)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A, the face photograph of #632 proband； B-C, the intraoral photographs of #632 proband； D-E, the detailed photographs show sparse eyebrows of #632 proband and his mother; F-G, the panoramic radiographs of #632 proband and his mother； H, the face photograph of #688 proband； I-J, the intraoral photographs of #688 proband； K, the photograph shows absent nipple and areola of #688 proband; L-M, the panoramic radiographs of #688 proband and #742 proband; N, the intraoral photograph of #652 proband; O, the face photograph of #652 proband; P-Q, the panoramic radiographs of #652 proband and his cousin; R, the cephalometric radiograph of #362 proband; S, the intraoral photograph of #729 proband; T-V, the panoramic radiographs of #729 proband, #593 proband and #685 proband. The black block represents the missing tooth, the red arrow refers to the tapered tooth. MAX, maxillary dental arch; MAND, mandibular dental arch.

3 討論

自1996年Srivastava等[8]成功克隆并定位EDA基因以來(lái)，不斷有研究從遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的角度對(duì)EDA基因突變與HED相關(guān)性進(jìn)行探索。目前已證實(shí)EDA基因突變可以導(dǎo)致X連鎖遺傳的HED的發(fā)生，其新檢出的突變類(lèi)型持續(xù)被報(bào)道。本研究在8個(gè)家系的9個(gè)男性HED患者中檢測(cè)出8個(gè)EDA基因突變：c.164T>C(p.Leu55Pro)、c.457C>T(p.Arg153Cys)、c.466C>T(p.Arg156Cys)、c.584G>A(p.Gly195Glu)、c.619delG(p.Gly207Profs*73)、c.673C>T(p.Pro225Ser)、c.676C>T(p.Gln226*)以及c.905T>G(p.Phe302Cys)，其中，c.619delG(p.Gly207Profs*73)、c.676C>T(p.Gln226*)、c.164T>C(p.Leu55Pro)、c.673C>T(p.Pro225Ser)和c.905T>G(p.Phe302Cys)是新檢出的突變。檢測(cè)出的8個(gè)突變中，有5個(gè)突變?yōu)镃>T(G>A)突變，可能由細(xì)胞中常見(jiàn)的胞嘧啶自動(dòng)脫氨基作用所致。

以上8個(gè)突變中，p.Leu55Pro 位于EDA蛋白的跨膜域內(nèi)，由于該結(jié)構(gòu)域與蛋白極性密切相關(guān)[17]，因此我們推測(cè)該突變引起的跨膜結(jié)構(gòu)改變，可能影響EDA的正常表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)EDA前體蛋白須在細(xì)胞膜上裂解并形成水溶性的信號(hào)分子后，方能與下游受體結(jié)合發(fā)揮作用，而furin識(shí)別序列結(jié)構(gòu)域正是EDA前體蛋白發(fā)生裂解的識(shí)別位點(diǎn)[17]，因此，位于furin識(shí)別序列結(jié)構(gòu)域內(nèi)的p.Arg153Cys和p.Arg156Cys，極有可能導(dǎo)致EDA前體蛋白裂解障礙，無(wú)法形成正常的水溶性的信號(hào)分子，進(jìn)而影響其與下游受體的結(jié)合，妨礙EDA蛋白的正常功能[10]；p.Gly195Glu、p.Gly207Profs*73、p.Pro225Ser和p.Gln226* 位于膠原樣結(jié)構(gòu)域內(nèi)，該結(jié)構(gòu)域主要是負(fù)責(zé)維持腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)結(jié)構(gòu)域形成正常折疊構(gòu)象，促進(jìn)TNF結(jié)構(gòu)域形成三聚體[17-18]，該結(jié)構(gòu)域內(nèi)的移碼突變p.Gly207Profs*73和無(wú)義突變p.Gln226*導(dǎo)致EDA蛋白截短，產(chǎn)生嚴(yán)重的功能影響。盡管功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明，p.Pro225Ser為可能致病的突變，但先證者同一條X染色體同時(shí)攜帶錯(cuò)義突變 p.Pro225Ser和無(wú)義突變p.Gln226*，可能通過(guò)協(xié)同作用嚴(yán)重影響EDA蛋白的功能；p.Phe302Cys位于EDA蛋白的TNF結(jié)構(gòu)域內(nèi)，研究證明此高保守的結(jié)構(gòu)域以同源三聚體的形式與受體EDAR結(jié)合，由此推測(cè)，p.Phe302Cys導(dǎo)致的TNF結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變，可能影響EDA與EDAR的結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致下游核轉(zhuǎn)錄因子kappa-B(nuclear factor kappa-B, NF-κB)信號(hào)通路激活受阻[17, 19]。NF-κB信號(hào)通路參與胚胎發(fā)育早期的外胚間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，決定著牙齒、毛發(fā)和皮膚等多種組織和器官的形態(tài)發(fā)生[20]，因此，本研究所報(bào)道的EDA基因突變，為EDA-EDAR-NF-κB級(jí)聯(lián)通路障礙在外胚層器官發(fā)育異常中的致病作用提供了新的理論證據(jù)。

A, location of EDA mutations identified in this study, reported mutations are in black, novel mutations are in red; B, schematic diagram of the EDA gene; C, conservation analysis of affected amino acids in the EDA protein among 8 different species. TM, transmembrane domain; TNF, tumor necrosis factor.

A-B, the tertiary structure of wild-type EDA-A1; C-D, the tertiary structure of the p.Phe302Cys mutant; E, the secondary structure of wild-type EDA protein; F-K, the secondary structure of the p.Leu55Pro, p.Arg153Cys, p.Arg156Cys, p.Gly195Glu, p.[pro225ser; Gln226*] and p.Gly207Profs*73 mutants.

本研究檢測(cè)出的9例EDA基因突變的男性HED患者均表現(xiàn)為汗腺發(fā)育異常、毛發(fā)稀疏、牙齒發(fā)育不全的三聯(lián)征。#688先證者除具有典型的HED表型外，還表現(xiàn)出乳頭和乳暈的先天缺如，這一乳腺相關(guān)的嚴(yán)重表型在男性HED患者中尚未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)HED疾病模型小鼠Tabby的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Tabby鼠表現(xiàn)出乳頭小且平，乳腺分泌功能障礙[21]。同時(shí)，有學(xué)者曾對(duì)EDA基因雜合突變的女性攜帶者的胸部發(fā)育進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)39%的患者表現(xiàn)出乳頭扁平，10%的患者出現(xiàn)多乳頭癥狀，67%的患者存在哺乳功能障礙[22]。以上研究均顯示，EDA基因?qū)θ橄侔l(fā)育的調(diào)控具有重要的作用，因此，#688先證者的乳頭和乳暈先天缺如的表型可能與EDA基因突變密切相關(guān)，有待后續(xù)研究進(jìn)一步明確證實(shí)其致病機(jī)制。

表2 EDA基因突變的HED患者缺牙數(shù)目和缺失牙位

A and B, percentage of missing tooth positions at each maxillary and mandibular dentition in HED patients with EDA mutations. Max, maxillary; Mand, mandibular; CI, central incisor; LI, lateral incisor; Ca, canine; PM1, first premolar; PM2, second premolar; M1, first molar; M2, second molar. Statistical significant P-value is marked with *P< 0.05, △P < 0.01, ◇P < 0.001, and ※P < 0.000 1; HED, hypohidrotic ectodermal dysplasia.

值得關(guān)注的是，同一家系中攜帶相同致病突變的男性HED患者(#652先證者與其表兄)缺牙表型有所差異， #652先證者恒牙列僅余留2顆上頜中切牙，而其表兄恒牙列余留2顆上頜中切牙和1顆下頜磨牙。相同的致病突變，缺牙表型卻存在差異，可能存在如下原因：(1)不同患者對(duì)相同的基因突變的敏感度有所差異，導(dǎo)致EDA基因突變?cè)诓煌瑐€(gè)體中的表現(xiàn)度不同，進(jìn)而導(dǎo)致臨床表型的輕重不一；(2)在遺傳過(guò)程中，DNA甲基化、組蛋白修飾、基因組印記的變化都能造成臨床表型不同的變化[23]。

本研究進(jìn)一步匯總了這9例EDA基因突變的男性HED患者的恒牙牙位缺失情況，并歸納了缺失牙位的特點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)上頜最易缺失牙位是側(cè)切牙和第二前磨牙，下頜最易缺失牙位是側(cè)切牙，這說(shuō)明在牙胚發(fā)育過(guò)程中，上頜側(cè)切牙、第二前磨牙和下頜側(cè)切牙的牙胚對(duì)EDA基因的敏感性最高；而上頜中切牙、上頜第一磨牙和下頜第一磨牙較少發(fā)生缺失，說(shuō)明上頜中切牙、上頜第一磨牙和下頜第一磨牙的牙胚發(fā)育對(duì)EDA基因的敏感性較低，這一結(jié)果與以往研究基本一致[24]。此外，本研究中EDA基因突變的男性HED患者的余留前牙呈錐形或過(guò)小牙。對(duì)Tabby鼠的研究也發(fā)現(xiàn)其前牙近遠(yuǎn)中徑變小、呈錐形牙冠的形態(tài)[25]，這均提示我們EDA基因可能與前牙形態(tài)發(fā)生有關(guān)，其具體發(fā)揮的功能及影響值得進(jìn)一步研究。

綜上，本研究在12個(gè)HED家系中共篩查出8例家系患者分別攜帶8個(gè)不同類(lèi)型的EDA基因突變，其中5個(gè)突變?yōu)槲丛鴪?bào)道的新檢出的突變。有文獻(xiàn)報(bào)道，約60%的HED患者攜帶EDA基因突變，未檢出EDA基因突變的HED患者可能攜帶HED已知致病基因EDAR(HED患者中占比16%， 后同)、EDARADD(2%)、Wntfamilymember10A(WNT10A，16%)基因突變，還有8%的HED患者可能攜帶其他未知基因突變[26]。對(duì)缺牙表型的分析是研究牙發(fā)育相關(guān)基因功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也有利于臨床醫(yī)生預(yù)測(cè)先天缺牙患者可能的致病基因，從而有的放矢地進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)。本研究通過(guò)分析得出EDA基因突變與上頜側(cè)切牙、第二前磨牙和下頜側(cè)切牙缺失的相關(guān)性最高，與上頜中切牙、上頜第一磨牙和下頜第一磨牙缺失的相關(guān)性最低，這不僅豐富了EDA的基因型-表型譜，更為遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷提供了強(qiáng)有力的臨床證據(jù)。