劉 建,王憲娥,呂 達(dá),喬 敏,張 立,孟煥新,徐 莉,毛銘馨
(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院,牙周科 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實(shí)驗(yàn)室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081)
廣泛型侵襲性牙周炎(generalized aggressive periodontitis, GAgP)因發(fā)病年齡早、疾病進(jìn)展快、具有家族聚集性、早期出現(xiàn)牙齒松動(dòng)和失牙等備受關(guān)注。GAgP 是多因素的復(fù)雜性疾病, 盡管菌斑生物膜是GAgP的始動(dòng)因素,但與遺傳有關(guān)的宿主易感性(如基因多態(tài)性)和局部解剖因素(如根形態(tài)異常)是影響疾病進(jìn)展速度和嚴(yán)重程度的重要因素。
GAgP被普遍認(rèn)為與易感基因多態(tài)性有關(guān),許多學(xué)者已發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)與GAgP的易感性增加有關(guān)[1],如維生素D受體(vitamin D receptor,VDR) 基因多態(tài)性與GAgP的關(guān)系已得到驗(yàn)證[2-3]。
以往系列研究已證實(shí)我國GAgP患者特有的牙根形態(tài)異常(錐根、細(xì)長根、冠根比例失常、彎曲根、融合根)的發(fā)生率明顯高于慢性牙周炎患者和牙周健康者[4-6];根形態(tài)異常核心家系研究顯示有遺傳傾向,遺傳度為30%~50%[7];根形態(tài)異常牙的牙槽骨吸收程度明顯大于非根形態(tài)異常牙,根形態(tài)異常牙數(shù)與重度骨吸收牙數(shù)成正相關(guān),分析原因是這些牙承受牙合力的能力降低,導(dǎo)致疾病進(jìn)展加快[8]。
牙根的發(fā)育是口腔上皮組織和間充質(zhì)相互作用的結(jié)果,其發(fā)育異??赡芘c某些基因缺失或變異有關(guān),機(jī)體內(nèi)外的不利因素作用于牙齒硬組織形成期、牙根發(fā)生期等階段時(shí),會(huì)形成相應(yīng)的臨床表現(xiàn)[9-11]。以往研究表明很多基因都與牙根的發(fā)育有關(guān),包括同源異形盒基因1、同源異形盒基因2、骨形成蛋白基因、基質(zhì)金屬蛋白酶9、轉(zhuǎn)化生長因子β、核心結(jié)合因子α1、VDR等[12-16]?;A(chǔ)研究還表明降鈣素受體(calcitotin receptor,CTR)影響成牙本質(zhì)細(xì)胞分化,不排除與牙根發(fā)育有關(guān)[17-18],但既往多是關(guān)于基因是否會(huì)阻止牙根形成或?qū)е卵栏笔У难芯縖16,19-22],都是基于細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[23-24],尚未見GAgP患者牙根形態(tài)異常與致病基因的關(guān)聯(lián)研究。
本研究旨在初步分析GAgP患者中牙根形態(tài)異常與骨代謝和牙根發(fā)育相關(guān)基因的關(guān)系,探索可能與GAgP患者發(fā)生牙根形態(tài)異常相關(guān)的基因多態(tài)性位點(diǎn),為GAgP患者實(shí)施針對性的預(yù)防和個(gè)性化治療提供理論依據(jù)[25]。
選擇2001年1月至2012年12月就診于北京大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科門診的179例GAgP患者作為研究對象。GAgP患者納入標(biāo)準(zhǔn)參照1999年牙周病分類法國際研討會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)(1999年新分類法):(1)患者年齡小于36歲;(2)快速的牙槽骨破壞和附著喪失,全口至少有6顆牙(至少有3顆為非第一磨牙和切牙)的探診深度(probing depth,PD)≥5 mm,鄰面附著喪失≥3 mm,均經(jīng)全口根尖片證實(shí)有鄰面牙槽骨吸收;(3)口內(nèi)余留牙≥20顆;(4)無正畸治療史;(5)患者除患牙周炎外全身健康,無糖尿病、心血管疾病和血液疾病等系統(tǒng)性疾??;女性未懷孕及哺乳。
本研究在開始前已獲得北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:0313),所有受試者納入前均簽署知情同意書,完成問卷調(diào)查,包括身高、體質(zhì)量、吸煙史、全身健康狀況等。
所有臨床檢查均由高年資醫(yī)生完成,檢查內(nèi)容包括:(1)菌斑指數(shù);(2)除第三磨牙外的每顆牙齒6個(gè)位點(diǎn)(近中頰、頰側(cè)中央、遠(yuǎn)中頰、近中舌、舌側(cè)中央和遠(yuǎn)中舌)的PD、臨床附著喪失(attachment loss,AL);(3)每顆牙近中頰、頰側(cè)中央、遠(yuǎn)中頰、舌側(cè)4個(gè)位點(diǎn)的出血指數(shù)(bleeding index,BI)。
所有研究對象均在北京大學(xué)口腔醫(yī)院放射科拍攝全口根尖X線片(采用分角線投照技術(shù),每人14張), 將全口根尖X線片掃描后存入電腦(確保X線片比例不變)。
所有受試者采取空腹前臂靜脈血10 mL,放入含有乙二胺四乙酸抗凝劑的真空管中,12 000轉(zhuǎn)離心5 min,留取白細(xì)胞層,-70 ℃凍存。采用上海華舜生物工程有限公司DNA提取試劑盒從白細(xì)胞中提取總基因組DNA,紫外分光光度計(jì)測定濃度和純度,D260 nm/D280 nm為1.8~2.0,-20 ℃保存。根據(jù)近十年的文獻(xiàn)報(bào)道和GenBank的檢索信息[12-16],共篩選和分析了9個(gè)與骨代謝和牙根發(fā)育相關(guān)基因的13個(gè)SNPs位點(diǎn)(表1)。SNPs基因型鑒定是由上海邃志生物科技有限公司利用美國Sequenom公司的MassARRAY 系統(tǒng)完成。為了確保分型結(jié)果的準(zhǔn)確性,對其中3個(gè)樣本39個(gè)位點(diǎn)的SNPs分型進(jìn)行了重復(fù)檢測。
表1 納入研究的9個(gè)基因及13個(gè)SNPs位點(diǎn)
參照徐莉等[6]、LV等[25]的研究,根據(jù)X線片表現(xiàn)將牙根形態(tài)異常分為6類:(1)錐根:牙根從根頸1/3即變窄,平面觀似三角形,牙根細(xì)且短,常見于前牙和雙尖牙。當(dāng)根寬度參照值滿足以下條件時(shí),可判斷為椎根:上中切牙<0.67;上側(cè)切牙<0.50;下切牙<0.34;上前磨牙<0.39;下前磨牙<0.42(圖1A、B)。(2)細(xì)長根:牙根細(xì),呈桿狀,多見于下前牙(圖1C)。(3)冠根比例失調(diào):冠長和根長的比值不同于正常牙。當(dāng)冠根比滿足以下條件時(shí),可判斷為冠根比例失調(diào):上中切牙>0.81;上側(cè)切牙>0.90;下切牙>0.80;前磨牙>0.80(圖1D)。(4)彎曲根:前牙和雙尖牙可見牙根呈明顯彎曲,根尖彎曲部與牙長軸呈15°角以上(圖1E)。(5)融合根:磨牙的牙根融合后似單根牙,多見于上、下頜的第二磨牙(圖1F)。(6)后牙根形態(tài)異常:后牙牙根過短或過細(xì)(圖1G)。由4位有經(jīng)驗(yàn)且已經(jīng)校準(zhǔn)的醫(yī)師在不知患者基因型的(盲法)情況下,閱讀X線片,對牙根形態(tài)異常狀況進(jìn)行判定。
A, cone-rooted teeth of anterior; B, cone-rooted teeth of premolar; C, slender-root teeth; D, short-rooted teeth; E, curved-rooted teeth; F, syncretic-rooted molars; G, molar root abnormalities.
采用SPSS 25.0軟件,對患者水平和牙水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料服從正態(tài)分布時(shí)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,不服從正態(tài)分布時(shí)以中位數(shù)(P25,P75)表示。不同基因型牙根形態(tài)異常數(shù)量的比較:(1)如果數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且具備方差齊性,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);(2)如果數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布但不具備方差齊性,采用校正獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);(3)如果數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布,則運(yùn)用非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-WhitneyU檢驗(yàn);(4)對多組數(shù)據(jù)間的比較,如果數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且方差齊,采用單因素方差分析;如果數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布,則采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)進(jìn)行分析。不同基因型根形態(tài)異常發(fā)生率的比較:將同一位點(diǎn)根形態(tài)異常發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的兩基因型合并為一組后進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,計(jì)算調(diào)整比值比(odds ratio,OR)。雙側(cè)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
共納入179例GAgP患者,其中男 ∶女=67 ∶112,平均年齡(27.23±5.19)歲。平均口內(nèi)存留牙為(26.80±1.84)顆(20~28顆),平均PD為(4.85±0.98) mm,平均AL為(4.44±1.30) mm,平均BI為3.54±0.45。
179例GAgP患者口內(nèi)存留牙共計(jì)4 798顆,其中存在牙根形態(tài)異常的合計(jì)695顆,根形態(tài)異常構(gòu)成比為14.49%,平均(3.88±3.84)顆。在6種類型的牙根形態(tài)異常中,前牙和雙尖牙錐根較為常見(表2)。
表2 牙根形態(tài)異常牙的分布狀況
在篩選的9個(gè)與骨代謝和牙根發(fā)育相關(guān)基因的13個(gè)SNPs位點(diǎn)中,經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析,VDR rs2228570及CTR rs2283002位點(diǎn)不同基因型牙根形態(tài)異常數(shù)量存在差異,其余SNPs位點(diǎn)不同基因型根形態(tài)異常牙的數(shù)量及發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)意義(表3、4)。
2.3.1VDR rs2228570位點(diǎn)與牙根形態(tài)異常 VDR rs2228570位點(diǎn)CC、CT、TT基因型患者的牙根形態(tài)異常數(shù)量分別為(4.66±4.10)、(3.71±3.93)、(2.68±2.68)顆。CC基因型患者的牙根形態(tài)異常數(shù)量顯著高于TT基因型者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)。同時(shí)該位點(diǎn)CC基因型患者的前牙錐根數(shù)量顯著高于TT基因型,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02,表3)。CC基因型典型根形態(tài)異?;颊呷诟馄妶D2,CC基因型患者根形態(tài)異常發(fā)生率高于CT和TT基因型,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。
2.3.2CTR rs2283002位點(diǎn)與牙根形態(tài)異常 CTR rs2283002 TT、CT、CC基因型患者的牙根形態(tài)異常數(shù)量分別為(3.05±3.12)、(3.43±3.95)、(5.02±3.70)顆。CC基因型患者的牙根形態(tài)異常數(shù)量顯著高于與TT和CT基因型,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03,表3)。22例TT基因型患者中有14例發(fā)生根形態(tài)異常,95例CT基因型患者中有62例發(fā)生根形態(tài)異常,49例CC基因型患者中有43例存在根形態(tài)異常,根形態(tài)異常發(fā)生率分別為63.64%、65.26%、87.86%,校正年齡、性別后,CC基因型的根形態(tài)異常發(fā)生率顯著高于CT及CC基因型(adjustedOR=3.71,95%CI:1.45~9.50,表4)。
牙根形態(tài)異常在我國GAgP患者中發(fā)生率高,是牙周病發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素之一。本研究采用分角線投照技術(shù)拍攝的X線片來觀察牙根形態(tài),與以往研究相同,田雨等[26]的研究比較了在X線片和在離體牙上測得的冠根比例,結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,證明使用分角線投照技術(shù)觀察牙根形態(tài)是可靠的。本研究中GAgP患者在牙水平存在根形態(tài)異常的比例為14.49%,與以往研究相當(dāng)[6]。牙根的發(fā)育主要是口腔上皮組織和外胚間充質(zhì)相互作用的結(jié)果,某些生物分子在時(shí)限、活性強(qiáng)度等方面協(xié)調(diào)發(fā)揮作用,影響牙齒發(fā)育,但是目前尚未見牙根形態(tài)異常發(fā)生的遺傳學(xué)研究。故本研究根據(jù)近十年的文獻(xiàn)報(bào)道和GenBank的檢索信息[12-16],篩選了與骨代謝和牙根發(fā)育相關(guān)的9個(gè)基因的13個(gè)SNPs位點(diǎn),分析不同基因型牙根形態(tài)異常的差異,初步發(fā)現(xiàn)與牙根形態(tài)異常發(fā)生相關(guān)的基因位點(diǎn)為VDR rs2228570位點(diǎn)和CTR rs2283002位點(diǎn)。
表3 GAgP患者9個(gè)基因13個(gè)SNPs位點(diǎn)不同基因型與牙根形態(tài)異常
Male, 21 years, VDR rs2228570 CC genotype;Cone-rooted teeth of anterior: 11, 21, 32, 31, 41, 42; Curved-rooted teeth: 12, 22; Molar root abnormalities: 36, 46.
表4 GAgP患者9個(gè)基因13個(gè)SNPs位點(diǎn)不同基因型根形態(tài)異常發(fā)生率
Berdal等[27]通過免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察VDR在大鼠切牙牙胚中的分布, 發(fā)現(xiàn)在牙胚發(fā)育過程中VDR在所有祖細(xì)胞中均有表達(dá), 并在分化過程中逐漸減少, 成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞是1, 25-二羥維生素D3 [(1,25(OH)2D3]的靶細(xì)胞。Papagerakis[28]采用電子顯微鏡及Northern blot方法研究大鼠,發(fā)現(xiàn)釉原蛋白的表達(dá)受1,25(OH)2D3調(diào)控,在維生素D(vitamin D,VD)缺乏大鼠切牙牙胚中釉原蛋白表達(dá)降低, 而單獨(dú)注射VD后釉原蛋白表達(dá)增加。Onishi[29]也發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3可通過調(diào)節(jié)鈣結(jié)合蛋白的基因表達(dá)而影響牙齒的礦化過程。Bailleul-Forestier等[30]采用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)在人類牙胚分化的成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核可以檢測到VDR和鈣結(jié)合蛋白D28k分布,提示1,25(OH)2D3可能有助于調(diào)節(jié)牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)的形成,這些研究提示VDR可能與牙根發(fā)育有關(guān)。
VDR是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子, VD與VDR結(jié)合可促進(jìn)基因(如釉原蛋白基因、牙本質(zhì)磷蛋白基因等)表達(dá),形成各種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,如成釉蛋白、牙本質(zhì)磷蛋白等,參與牙本質(zhì)和牙釉質(zhì)的形成[31]。VDR基因位于12號染色體長臂q13-14區(qū),有11個(gè)外顯子,rs2228570位點(diǎn)在第二外顯子區(qū)[32]。rs2228570位點(diǎn)的等位基因C突變?yōu)門時(shí),可以產(chǎn)生一個(gè)新的起始密碼子,導(dǎo)致VDR氨基酸鏈增加3個(gè)氨基酸[33]。盡管Gross 等[34]的研究顯示該基因位點(diǎn)多態(tài)性不影響VDR基因轉(zhuǎn)錄以及VDR配體親和力,但也有研究發(fā)現(xiàn)該基因位點(diǎn)突變會(huì)致使VDR基因轉(zhuǎn)錄活性降低[35-36]。Liu等[37]發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)CC型可能會(huì)增加侵襲性牙周炎的患病風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.45), 以往很多研究也發(fā)現(xiàn)該基因型可能會(huì)增加廣泛型侵襲性牙周炎的患病風(fēng)險(xiǎn)[2,38]。本研究結(jié)果顯示, 該位點(diǎn)CT基因型GAgP患者平均根形態(tài)異常數(shù)量比CC基因型患者平均少0.9顆,TT基因型患者平均根形態(tài)異常數(shù)量比CC基因型患者平均少2.0顆,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這表明rs2228570位點(diǎn)的等位基因T可能對阻止牙根形態(tài)異常的發(fā)生呈弱保護(hù)作用。CC基因型可能會(huì)導(dǎo)致GAgP根形態(tài)異常數(shù)量增加,造成牙根解剖形態(tài)缺陷,與其他多種因素共同導(dǎo)致GAgP患者嚴(yán)重的牙周組織破壞。
CTR rs2283002位點(diǎn)CC基因型GAgP患者平均根形態(tài)異常數(shù)量為(5.02±3.70)顆,大于CT基因型和TT基因型患者。此外,發(fā)現(xiàn)CC基因型患者的根形態(tài)異常發(fā)生率高于TT和CT基因型(adjustedOR=3.71,95%CI:1.451~9.500),表明CTR基因rs2283002位點(diǎn)可能與GAgP患者牙根形態(tài)異常有關(guān)。降鈣素受體基因位于染色體長臂7q21.3,目前發(fā)現(xiàn)有11個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn),rs2283002位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)域[39-40]。Giroux等[41]發(fā)現(xiàn)rs2283002位點(diǎn)基因多態(tài)性與下腰椎骨密度有關(guān),但Yanovich等[42]和Xiong等[39]的研究未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)基因多態(tài)性與骨密度有關(guān)。既往關(guān)于降鈣素受體基因與牙齒發(fā)育關(guān)系的研究較少,Mallek等[17]對新生大鼠切牙和磨牙牙胚進(jìn)行了一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn),體外培養(yǎng)條件分為正常營養(yǎng)組和營養(yǎng)缺乏組,結(jié)果顯示降鈣素能明顯抑制正常大鼠牙胚的鈣吸收,而增加了營養(yǎng)不良大鼠牙胚的鈣吸收,而上述作用是發(fā)生在牙胚發(fā)育早期。Sakakura等[18]用不同濃度降鈣素體外培養(yǎng)小鼠第一磨牙牙胚,發(fā)現(xiàn)較低濃度的降鈣素能促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞提前分泌前期牙本質(zhì),而較高濃度降鈣素則會(huì)抑制前期牙本質(zhì)的形成,這提示當(dāng)CTR基因表達(dá)增強(qiáng)時(shí),降鈣素可通過與CTR結(jié)合而發(fā)揮抑制牙本質(zhì)形成,從而影響牙根發(fā)育。
綜上所述,本研究提示VDR rs2228570位點(diǎn)和CTR rs2283002位點(diǎn)可能與GAgP患者牙根形態(tài)異常的發(fā)生有關(guān),為進(jìn)一步探究廣泛型侵襲性牙周炎患者根形態(tài)異常的發(fā)生和致病機(jī)制打下基礎(chǔ)。同時(shí)本研究也存在一些局限,在觀察牙根形態(tài)時(shí)使用了分角線投照技術(shù),可能采用平行投照更為準(zhǔn)確;同時(shí)本研究缺乏健康對照組,所研究的位點(diǎn)較少,需探索更多與牙根發(fā)育可能有關(guān)的基因位點(diǎn)。