張 鑫，王孟清，羅銀河，江智豪

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208

2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007

3.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)國(guó)內(nèi)一流建設(shè)學(xué)科，湖南 長(zhǎng)沙 410208

支氣管哮喘是氣道慢性炎癥性疾病，近年兒童哮喘呈逐年增加的趨勢(shì)[1]。兒童哮喘與呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）密切相關(guān)，研究表明超過(guò)85%的兒童哮喘與RSV 感染有關(guān)[2]。RSV 感染人體后，肺中的抗原提呈細(xì)胞攝取抗原，樹突細(xì)胞被激活，此外，樹突細(xì)胞自噬功能的改變也會(huì)影響其抗原提呈功能，進(jìn)而影響T 細(xì)胞分泌的炎性因子，從而誘發(fā)哮喘[3-6]。輔助性T 細(xì)胞1（T helper 1，Th1）、輔助性T 細(xì)胞2（T helper 2，Th2）細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和輔助性T 細(xì)胞17（T helper 17，Th17）分泌的白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）在哮喘的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[7]。五虎湯為治喘名方，可顯著改善哮喘患兒的氣道炎癥，課題組前期研究表明五虎湯可通過(guò)作用樹突細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)Th1、Th2 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平[8-9]。本研究通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探討五虎湯對(duì)RSV 誘導(dǎo)的哮喘小鼠樹突細(xì)胞自噬的影響，以及對(duì)Th17 細(xì)胞分泌的炎性因子IL-17A 和IL-17F 水平的影響，揭示五虎湯改善哮喘氣道炎癥的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雌性BALB/c 小鼠88 只，6～8 周齡，體質(zhì)量（20±2）g；SPF 級(jí)SD 雄性大鼠12 只，6周齡，體質(zhì)量（200±5）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司，許可證號(hào) SCXK（湘）2016-0002。轉(zhuǎn)基因OT2 小鼠3 只，4 周齡，體質(zhì)量（18±2）g，購(gòu)自美國(guó)Jackson Laboratory，許可證號(hào)2061A00649。動(dòng)物飼養(yǎng)于濕度（55±5）%、溫度（22±2）℃、12 h 亮/12 h 暗循環(huán)條件下，自由飲食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)20180810-02）。

1.2 細(xì)胞

RSV 病毒株和人喉表皮樣癌Hep-2 細(xì)胞由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒學(xué)研究所提供。

1.3 藥材

麻黃、苦杏仁、生石膏、甘草、細(xì)茶葉由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供，經(jīng)劉紹貴主任藥師鑒定分別為麻黃科植物草麻黃Ephedra sinicaStapf 的干燥草質(zhì)莖、薔薇科植物山杏Prunus armeniacaL.var.ansuMaxim.的干燥成熟種子、硫酸鹽類礦物硬石膏族石膏、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖、山茶科植物茶Camellia sinensis(L.) O.Ktze.的嫩葉。

1.4 藥品與試劑

雞卵清蛋白（ovalbumin，OVA，批號(hào)MP6110-1G）購(gòu)自上海懋康生物科技有限公司；小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒（批號(hào)P8620）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；乙酰膽堿（批號(hào)2260-50-6）購(gòu)自上海禾午生物科技有限公司；雷帕霉素（批號(hào)S1039，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購(gòu)自美國(guó)Selleck 公司；地塞米松（批號(hào)D1756，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%）、DMSO（批號(hào)D2650-100ML）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蘇木精-伊紅（HE）染色液（批號(hào)P032IH）、中性樹膠（批號(hào)P033IH）、二甲苯（批號(hào)10023418）、無(wú)水乙醇（批號(hào)10009218）購(gòu)自國(guó)藥控股湖南有限公司；微管相關(guān)蛋白輕鏈3I（microtubule-associated protein lightc hain 3I，LC3I）抗兔單抗（批號(hào)4599S）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）抗兔單抗（批號(hào)3868S）購(gòu)自美國(guó)CST 公司；β-actin 抗小鼠單抗（批號(hào)YM3028）購(gòu)自美國(guó)Immunoway 公司；IL-17A、IL-17F ELISA 試劑盒（批號(hào)分別為E20181109021、E20181109024）購(gòu)自上海晶天生物科技有限公司；PBS 緩沖液（批號(hào)LM1711）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào)0500）、RPMI 1640 培養(yǎng)基（批號(hào)0002）、重組人粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子（批號(hào)kx30-GM）、重組人白細(xì)胞介素4（批號(hào)rh114）、Opti-MEM 培養(yǎng)基（批號(hào)1967689）購(gòu)自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司；PE/Cy7 抗小鼠CD69抗體（批號(hào)104511）、APC 抗小鼠CD3 抗體（批號(hào)100235）、PE 抗小鼠CD4 抗體（批號(hào)100407）購(gòu)自美國(guó)Biolegend 公司；CD11cPerCP-Cyanine5.5/APC/PE 抗體（批號(hào)130-102-413）、小鼠CD4（L3T4）微珠（批號(hào)130-117-043）、肺分離試劑盒、CD11c MicroBeads UltraPure 購(gòu)自德國(guó)Miltenyi 公司；紅細(xì)胞裂解液（批號(hào)S371KJ）購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司；熒光染料CFSE（批號(hào)HY-D0938）購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；OVA-17 肽（批號(hào)BP015382）購(gòu)自武漢百意欣生物技術(shù)有限公司。

1.5 儀器

S888E 超聲波霧化器（南京道芬電子有限公司）；DHX-50 小動(dòng)物呼吸機(jī)（成都儀器廠）；YT-6C生物組織攤鋪機(jī)（孝感宏翔生物醫(yī)械技術(shù)有限公司）；BE41 光學(xué)顯微鏡（蘇州勝視電子設(shè)備有限公司）；DYY-6C 電泳儀（北京六一儀器廠）；YH-C3001電子天平（五鑫衡器有限公司），TS-2 水平脫色搖床（上海皖寧公司）；EASY15 純水儀（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；12008007 臺(tái)式離心機(jī)（金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）；DK-600S 恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），BC-J160S 細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；75004250 高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；DS-Ri2 高級(jí)分析倒置顯微鏡（美國(guó)Nikon 公司）；MACSQuant Analyzer 流式細(xì)胞儀（德國(guó)Miltenyi公司）；Transwell 小室（6.5 mm）、T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國(guó)Corning 公司）。

2 方法

2.1 五虎湯的制備

依據(jù)朱丹溪《幼科全書》中的藥物與劑量配方，取麻黃2.4 g、杏仁6.0 g、生石膏9.0 g、生甘草2.4 g、細(xì)茶葉4.8 g，加入5 倍量蒸餾水浸泡30 min，回流提取40 min，濾過(guò)，再加入5 倍量蒸餾水，回流提取40 min，合并2 次提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成2.46 kg/L（以生藥量計(jì)）原液。原液用作高劑量組，原液以等體積生理鹽水稀釋作為中劑量組，原液以3 倍體積生理鹽水稀釋作為低劑量組。

2.2 RSV 誘導(dǎo)哮喘小鼠模型的建立

78 只BALB/c 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為對(duì)照組（14 只）和模型組（64 只），參照課題組前期研究[9]造模。于實(shí)驗(yàn)第1、2 天，模型組小鼠鼻腔滴入0.1 mL RSV（2.4×106PFU/mL），同時(shí)ip 0.25 mL 1% OVA（以生理鹽水配制）；對(duì)照組小鼠鼻腔滴入0.1 mL Hep-2 細(xì)胞滴，同時(shí)ip 等體積生理鹽水。自實(shí)驗(yàn)第9 天，每天9: 00 時(shí)將小鼠放入霧化吸入箱中，模型組給予1% OVA 霧化以激發(fā)哮喘，對(duì)照組給予等體積生理鹽水霧化，隔天1次，每次30 min，連續(xù)14 d。

致敏前后每3 天稱定小鼠體質(zhì)量，并觀察小鼠有無(wú)搔鼻、點(diǎn)頭樣喘息等行為學(xué)變化。最后1 次造模24 h 后分別從對(duì)照組和模型組隨機(jī)取4 只小鼠，進(jìn)行氣道反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)。小鼠麻醉后待四肢松弛，固定消毒，外科剪切開頸部皮膚，暴露氣管，用靜脈留置針行頸靜脈穿刺并固定，V 行剪開氣管，予深靜脈穿刺針行氣管插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)切開氣管插管固定。呼吸機(jī)參數(shù)調(diào)整為呼吸頻率為75 次/min，潮氣量為8 mL/kg。記錄氣道壓力、氣道流量和潮氣量的變化。小鼠氣道壓力穩(wěn)定后給予0.1 mL 不同質(zhì)量濃度（0、6.25、12.50、25.00、50.00 μg/mL）乙酰膽堿霧化，收集吸入乙酰膽堿5～60 s 的數(shù)據(jù)，采用動(dòng)物肺功能分析軟件計(jì)算用藥后的最大肺阻力，與對(duì)照組比較，模型組肺阻力顯著升高則表明造模成功。

2.3 分組與給藥

將造模后的小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、地塞米松（1.82 mg/kg）組、雷帕霉素（1 mg/kg）組、五虎湯低劑量（1.6 g/kg，相當(dāng)于臨床1/2 劑量）組、五虎湯中劑量（3.2 g/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量）組、五虎湯高劑量（6.4 g/kg，相當(dāng)于臨床2 倍劑量）組，每組10 只。五虎湯組ig 五虎湯（20 mL/kg），并ip生理鹽水；地塞米松、雷帕霉素組ip 0.4 mL 相應(yīng)藥物，并ig 等體積生理鹽水；對(duì)照組和模型組ig 等體積生理鹽水，并ip 等體積生理鹽水，1 次/d，連續(xù)14 d。

2.4 五虎湯對(duì)RSV 小鼠肺泡灌洗液中IL-17A 和IL-17F 水平的影響

末次給藥后48 h，小鼠脫頸椎處死，分離肌肉，暴露氣管，在氣管上剪一個(gè)T 形口，插入自制的氣管，注入1 mL PBS 至肺部組織，輕揉后吸出，2500 r/min 離心10 min，吸取上清液。按照IL-17A、IL-17F ELISA 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)小鼠肺泡灌洗液中IL-17A 和IL-17F 水平。

2.5 五虎湯對(duì)RSV 小鼠肺組織病理的影響

取小鼠肺組織，將1 mL 4%多聚甲醛注入氣管，全肺浸泡4%多聚甲醛24 h。常規(guī)石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE 染色，觀察肺組織的病理變化。

2.6 五虎湯對(duì)RSV 小鼠肺組織中自噬小體的影響

取小鼠肺組織，用2.5%戊二醛緩沖液固定4 h，再用0.1 mol/L 磷酸洗滌10 min，重復(fù)3 次。1%鋨酸固定2 h，梯度乙醇脫水、環(huán)氧樹脂包埋，于30 ℃烘箱中過(guò)夜后再于60 ℃烘箱內(nèi)放置12 h，切片（厚100 nm）后用醋酸鈾、硝酸鉛染色，于透射電鏡下觀察肺組織中的自噬小體。

2.7 五虎湯對(duì)RSV 小鼠肺組織樹突細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.7.1 肺組織中樹突細(xì)胞的分離 小鼠肺組織剪碎后，將小鼠肺組織解離成單細(xì)胞混懸液，在MACS SmartStrainers 中去除細(xì)胞團(tuán)塊，采用CD11c MicroBeadsUltraPure 分選磁珠從肺單細(xì)胞混懸液中分選獲得樹突細(xì)胞。

2.7.2 Western blotting 法檢測(cè)樹突細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 樹突細(xì)胞提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣本經(jīng)SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%牛奶封閉1 h，分別加入LC3I（1∶2000）、LC3II（1∶1000）、β-actin（1∶5000）抗體孵育過(guò)夜，TBST 洗滌3 次，每次10 min；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗滌3 次，每次10 min。采用凝膠成像系統(tǒng)成像掃描，用Quantity One 軟件進(jìn)行灰度分析。

2.8 樹突細(xì)胞的分離與鑒定

將10 只BALB/c 小鼠脫頸椎處死，浸泡于75%酒精中。于無(wú)菌操作臺(tái)分離小鼠股骨、脛骨，剝除結(jié)締組織，暴露髓腔，用PBS 緩沖液反復(fù)沖洗髓腔，收集骨髓濾液，離心后棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液裂解2 min，1000 r/min 離心5 min，棄上清，PBS緩沖液洗滌后加入RPMI 1640 培養(yǎng)基（含10 ng/mL重組人粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子、1 ng/mL 重組人白細(xì)胞介素4、1% FBS、1%雙抗），接種于6 孔板中培養(yǎng)。第3 天起每天更換一半培養(yǎng)基，第7 天收集細(xì)胞，以PBS緩沖液調(diào)整樹突細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL，加入CD11ccPerCP-Cyanine5.5/APC/PE 抗體，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)樣分析。

2.9 五虎湯含藥血清的制備與劑量篩選

2.9.1 五虎湯含藥血清的制備 將12 只SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及五虎湯低劑量（1.1 g/kg，相當(dāng)于臨床1/2 劑量）、中劑量（2.2 g/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量）、高劑量（4.4 g/kg，相當(dāng)于臨床2 倍劑量）組，每組3 只。對(duì)照組ig 生理鹽水（10 mL/kg），各給藥組ig 等體積藥物，2 次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后禁食，各組大鼠腹主動(dòng)脈取血，離心取上清液，血清滅活后濾過(guò)，分別用作空白血清和五虎湯低、中、高劑量含藥血清，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.9.2 含藥血清最佳劑量的篩選 樹突細(xì)胞以含RSV 的Opti-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，以PBS 洗滌后，隨機(jī)分為空白血清組和含藥血清低、中、高劑量組。各組分別加入5%、10%、20%、30%含藥血清，孵育24 h 后采用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.10 CD4＋T 細(xì)胞分離和CFSE 標(biāo)記

3 只OT2 小鼠脫頸椎處死，浸泡于75%乙醇中。于無(wú)菌操作臺(tái)取小鼠脾臟，研磨過(guò)200 目篩網(wǎng)，收集濾液，1500 r/min 離心5 min，棄上清。取4 支15 mL 離心管，每管加入4 mL 小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液，將外周血細(xì)胞沉淀加入離心管中，加入10 mL PBS 洗滌細(xì)胞，離心10 min，棄上清，濾過(guò)后收集濾液，250×g離心10 min。每1×107個(gè)細(xì)胞加入90 μL Buffer 溶液（PBS、pH 7.2、0.5%牛血清白蛋白、2 mmol/L EDTA）和10 μL CD4 抗體，于4 ℃孵育10 min，用于免疫磁珠分選。

無(wú)菌操作臺(tái)中，將分選柱吸附在分選器上，分選柱下放置15 mL 離心管，向分選柱中加入3 mL Buffer溶液待其自然濾過(guò)，將分選柱置于15 mL 離心管中，向分選柱中加入5 mL Buffer 溶液，待所有液體全部濾下時(shí)，使用助推器推下分選柱內(nèi)殘余液體，離心管內(nèi)液體即為CD4+T 淋巴細(xì)胞懸液。1000 r/min 離心5 min，棄上清，加入5 mL PBS 洗滌，加入含10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞懸液，接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。用含0.1% BSA 的PBS 溶液調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，加入1 μL CFSE 儲(chǔ)存液，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，于冰上孵育5 min，1000 r/min 離心5 min，棄上清，重復(fù)3 次。

2.11 五虎湯對(duì)CD4＋T 細(xì)胞增殖和T 細(xì)胞活化標(biāo)志物CD69 表達(dá)的影響

“2.8”項(xiàng)中分離的樹突細(xì)胞以1×104/孔接種于Transwell 小室下室，“2.10”項(xiàng)中分離的CD4+T 細(xì)胞以1×105/孔接種于Transwell 小室上室。設(shè)置對(duì)照組，模型組，五虎湯低、中、高劑量含藥血清組，雷帕霉素（10 ng/mL）組，對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，其他組加入含RSV 的Opti-MEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，PBS 洗滌后加入OVA-17 肽，培養(yǎng)24 h，構(gòu)建RSV誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞自噬模型。對(duì)照組與模型組加入空白血清，含藥血清低、中、高劑量組分別加入20%相應(yīng)含藥血清，雷帕霉素組加入雷帕霉素，培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，分別加入 CD4-PE、CD3-APC 和CD69-PE/Cy7 抗體，流式細(xì)胞術(shù)分析CD4＋T 細(xì)胞的增殖與CD69 的表達(dá)情況。

2.12 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用表示。兩組數(shù)據(jù)比較，滿足正態(tài)性和方差齊性，用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組比較滿足正態(tài)性和方差齊性的計(jì)量資料采用One-way ANOVA，各組間兩兩比較采用 LSD 法，方差不齊者用Dunett’s 檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 RSV 誘導(dǎo)哮喘小鼠模型的驗(yàn)證

與對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量減輕，出現(xiàn)呼吸快、搔鼻、豎毛、聳肩、上肢縮抬、點(diǎn)頭樣喘息等行為學(xué)改變。如表1 所示，與對(duì)照組比較，吸入不同質(zhì)量濃度（0、6.25、12.50、25.00、50.00 μg/mL）乙酰膽堿后，模型組小鼠肺阻力顯著增加（P＜0.01），表明造模成功。

3.2 五虎湯對(duì)RSV 小鼠肺組織病理變化的影響

如圖1 所示，對(duì)照組小鼠支氣管管腔壁完整，未見脫落的上皮細(xì)胞，支氣管黏膜平整，平滑肌無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠支氣管管壁增厚，氣道變窄，氣道和血管周圍有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主；五虎湯各劑量組、地塞米松組、雷帕霉素組小鼠肺組織炎癥表現(xiàn)均減輕，支氣管管腔內(nèi)可見少量黏液和脫落，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組明顯減輕。

表1 對(duì)照組與模型組小鼠肺阻力比較 ()Table 1 Comparison of airway reactivity in mice between control group and model groups ()

表1 對(duì)照組與模型組小鼠肺阻力比較 ()Table 1 Comparison of airway reactivity in mice between control group and model groups ()

與對(duì)照組比較：**P＜0.01**P < 0.01 vs control group

乙酰膽堿/(μg·L-1) 肺阻力/(cm H2O·mL·s)對(duì)照 模型00 02.13±0.20 2.45±0.19 06.25 03.91±0.40 11.14±1.11**12.50 06.44±0.72 15.91±1.00**25.00 09.09±0.83 21.90±1.22**50.00 12.71±0.69 29.42±2.12**

圖1 五虎湯對(duì)RSV 小鼠肺組織病理的影響 (HE,×200)Fig.1 Effect of Wuhu Decoction on lung pathology of RSV mice (HE,× 200)

3.3 五虎湯對(duì)RSV 小鼠肺組織自噬小體的影響

如圖2 所示，與對(duì)照組比較，模型組、各給藥組小鼠肺組織自噬小體增多。

3.4 五虎湯對(duì)RSV 小鼠肺組織樹突細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖3 和表2 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠樹突細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3I蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，五虎湯低、中、高劑量組和雷帕霉素組小鼠樹突細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3I蛋白表達(dá)水平顯著增高（P＜0.01）。

圖2 五虎湯對(duì)RSV 小鼠肺組織自噬小體的影響Fig.2 Effect of Wuhu Decoction on pulmonary autophagosome of RSV mice

圖3 五虎湯對(duì)RSV 小鼠肺組織樹突細(xì)胞中LC3I 和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of Wuhu Decoction on expressions of LC3I and LC3Ⅱ in dendritic cells in lungs of RSV mice

3.5 五虎湯對(duì)RSV 小鼠肺泡灌洗液中IL-17A 和IL-17F 水平的影響

如表3 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺泡灌洗液中IL-17A 和IL-17F 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松組、雷帕霉素組、五虎湯中、高劑量組小鼠肺泡灌洗液中IL-17A 和IL-17F 水平顯著降低（P＜0.05、0.01），五虎湯低劑量組IL-17A 水平顯著降低（P＜0.01）。

表2 五虎湯對(duì)RSV 小鼠肺組織樹突細(xì)胞中LC3I 和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)的影響 ()Table 2 Effect of Wuhu Decoction on expressions of LC3I and LC3Ⅱ in dendritic cells in lungs of RSV mice ()

表2 五虎湯對(duì)RSV 小鼠肺組織樹突細(xì)胞中LC3I 和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)的影響 ()Table 2 Effect of Wuhu Decoction on expressions of LC3I and LC3Ⅱ in dendritic cells in lungs of RSV mice ()

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：△△P＜0.01**P < 0.01 vs control group；△△P < 0.01 vs model group

組別 劑量/(g·kg-1) 蛋白相對(duì)表達(dá)量LC3I LC3II LC3II/LC3I對(duì)照 — 0.32±0.02 0.08±0.01 0.26±0.01模型 — 0.54±0.04** 0.40±0.05** 0.73±0.06**五虎湯 1.6 0.54±0.01 0.95±0.01△△ 1.75±0.06△△3.2 0.85±0.02△△ 1.29±0.01△△ 1.51±0.04△△6.4 1.10±0.02△△ 1.28±0.01△△ 1.16±0.02△△地塞米松 0.00 182 0.58±0.03 0.43±0.06 0.74±0.09雷帕霉素 0.00 100 0.11±0.01△△ 0.63±0.02△△ 6.03±0.71△△

表3 五虎湯對(duì)RSV 小鼠肺泡灌洗液中IL-17A 和IL-17F 水平的影響 ()Table 3 Effect of Wuhu Decoction on levels of inflammatory cytokines IL-17A and IL-17F in bronchoalveolar lavage fluid of RSV mice ()

表3 五虎湯對(duì)RSV 小鼠肺泡灌洗液中IL-17A 和IL-17F 水平的影響 ()Table 3 Effect of Wuhu Decoction on levels of inflammatory cytokines IL-17A and IL-17F in bronchoalveolar lavage fluid of RSV mice ()

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：△P＜0.05 △△P＜0.01**P < 0.01 vs control group；△P < 0.05 △△P < 0.01 vs model group

組別 劑量/(g·kg-1) IL-17A/(ng·L-1) IL-17F/(ng·L-1)對(duì)照 — 58.69±7.65 59.39±6.96模型 — 182.39±8.30** 140.39±3.11**五虎湯 1.6 121.46±5.55△△ 132.53±4.36 3.2 111.37±7.81△△ 109.93±10.49△△6.4 148.13±10.90△△ 117.80±15.15△地塞米松 0.00 182 103.13±10.99△△ 97.00±9.13△△雷帕霉素 0.00 100 86.37±11.69△△ 87.97±5.36△△

3.6 樹突細(xì)胞的分離與鑒定

從小鼠骨髓中分離的樹突細(xì)胞在培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)，培養(yǎng)至第7 天，如圖4 所示，鏡下可見細(xì)胞邊緣有樹突樣突起，具有典型的樹突細(xì)胞形態(tài)。如圖5 所示，從小鼠骨髓中分離培養(yǎng)的樹突細(xì)胞純度為99.3%。

3.7 五虎湯含藥血清最佳劑量的篩選

如圖6 所示，20%五虎湯含藥血清對(duì)細(xì)胞存活率較高，選取20%含藥血清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 小鼠骨髓來(lái)源樹突細(xì)胞的形態(tài) (×200)Fig.4 Morphology of mice bone marrow derived dendritic cells ( × 200)

圖5 小鼠骨髓來(lái)源樹突細(xì)胞的鑒定Fig.5 Identification of mice bone marrow-derived dendritic cells

3.8 五虎湯對(duì)CD4＋T 細(xì)胞增殖和CD69 表達(dá)的影響

如圖7、8 和表4 所示，與對(duì)照組比較，模型組CD4＋T 細(xì)胞增殖和T 細(xì)胞活化標(biāo)志物CD69 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，中、高劑量含藥血清組和雷帕霉素組CD4＋T 增殖和CD69表達(dá)顯著降低（P＜0.05、0.01），低劑量含藥血清組CD4＋T 增殖顯著降低（P＜0.01）。表明五虎湯含藥血清在體外具有抑制RSV 誘導(dǎo)的T 細(xì)胞增殖活化的能力。

4 討論

圖6 五虎湯含藥血清對(duì)樹突細(xì)胞活力的影響Fig.6 Effect of drug-containing serum of Wuhu Decoction on dendritic cell activity

圖7 對(duì)照組 (A)，模型組 (B)，五虎湯低、中、高劑量含藥血清組 (C～E) 和雷帕霉素組 (F) CD4＋T 細(xì)胞的流式結(jié)果Fig.7 Flow results of CD4＋T cells in control group (A),model group (B),drug-containing serum low,medium,high dose of Wuhu Decoction group (C—E) and rapamycin group (F)

氣道炎癥是支氣管哮喘重要的發(fā)病機(jī)制，樹突細(xì)胞介導(dǎo)的CD4＋T 淋巴細(xì)胞的增殖活化與氣道炎癥密切相關(guān)[10-11]?？乖淖R(shí)別與遞呈、炎癥細(xì)胞的趨化、T 細(xì)胞的分化及其細(xì)胞因子的產(chǎn)生是哮喘炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)[12]。樹突細(xì)胞為肺中最重要的抗原呈遞細(xì)胞，成熟后可提呈抗原，激活分化初始T 細(xì)胞[13]。研究表明，哮喘患者的樹突細(xì)胞與自體T 細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)T 細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-9 和IL-13，提示樹突細(xì)胞通過(guò)影響T 細(xì)胞分泌的炎性因子，誘發(fā)氣道炎癥，從而參與哮喘發(fā)病[14]。自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身物質(zhì)以適應(yīng)生存環(huán)境的過(guò)程，病毒感染誘發(fā)機(jī)體細(xì)胞自噬，機(jī)體可通過(guò)提高自噬清除病毒[15]。自噬影響樹突細(xì)胞的抗原提呈功能，樹突細(xì)胞攝取、加工提呈抗原需要高水平的內(nèi)吞和溶酶體活性，樹突細(xì)胞自噬功能紊亂引起的T 細(xì)胞炎性因子分泌變化可能是哮喘的發(fā)病機(jī)制之一[16-17]。

表4 五虎湯對(duì)CD4＋T 細(xì)胞增殖和CD69 表達(dá)的影響()Table 4 Effect of Wuhu Decoction on proliferation of CD4＋T cells and expression of CD69 ()

表4 五虎湯對(duì)CD4＋T 細(xì)胞增殖和CD69 表達(dá)的影響()Table 4 Effect of Wuhu Decoction on proliferation of CD4＋T cells and expression of CD69 ()

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：△P＜0.05 △△P＜0.01**P < 0.01 vs control group；△P < 0.05 △△P < 0.01 vs model group

組別 CD4＋T/% CD69 相對(duì)表達(dá)量對(duì)照 09.72±0.22 06.26±0.18模型 81.70±0.42** 16.73±0.37**含藥血清 66.30±0.54△△ 15.57±0.47 52.40±0.33△△ 10.70±0.64△54.90±0.29△△ 11.67±0.69△雷帕霉素 18.10±0.40△△ 10.63±0.19△△

五虎湯是治療兒童哮喘的名方，由麻黃、杏仁、石膏、甘草、細(xì)茶葉組成，有清肺平喘的功效。本研究采用RSV 與OVA 建立哮喘小鼠模型，以自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察五虎湯是否可以通過(guò)影響小鼠肺中樹突細(xì)胞的自噬水平治療哮喘，結(jié)果表明RSV 誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺部可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，各給藥組小鼠肺部炎癥減輕；模型組小鼠肺樹突細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ/LC3I表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），雷帕霉素和五虎湯組樹突細(xì)胞的自噬水平進(jìn)一步升高（P＜0.01），提示五虎湯可以提高哮喘小鼠肺中樹突細(xì)胞細(xì)胞的自噬水平。

IL-17 是Th17 細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子，具有募集粒細(xì)胞、促進(jìn)其他炎性細(xì)胞因子釋放的作用[18-19]。IL-17 參與機(jī)體多種炎癥與免疫性疾病，在RSV 誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺組織中IL-17 水平明顯升高[20-21]。IL-17 家族包含IL-17A～F，IL-17F 與IL-17A的同源性達(dá)50%，二者功能類似[22-23]。IL-17A 可通過(guò)促進(jìn)成纖維細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞釋放細(xì)胞因子活化中性粒細(xì)胞，并使中性粒細(xì)胞在氣道募集，還可促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞黏蛋白表達(dá)，促進(jìn)黏液分泌[24]。IL-17F 可刺激支氣管上皮細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1）表達(dá)，并刺激IL-17 分泌使炎性細(xì)胞募集，同時(shí)對(duì)氣道高反應(yīng)性與氣道重塑有重要影響[25-26]。IL-17A 和IL-17F通過(guò)促進(jìn)前炎性細(xì)胞因子的釋放來(lái)放大炎癥反應(yīng)，均可作為T 細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)因子，研究認(rèn)為IL-17A 在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中更為重要，IL-17F 對(duì)消化道嚙齒枸櫞酸桿菌感染與免疫的機(jī)制更為重要[27-28]。本研究結(jié)果顯示，RSV 誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺泡灌洗液中IL-17A和IL-17F水平均顯著升高（P＜0.01），經(jīng)五虎湯治療后二者水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），以五虎湯中劑量為佳，IL-17A 水平的變化較IL-17F 更為顯著，推測(cè)在RSV 誘導(dǎo)的哮喘模型中IL-17A 可能更適合作為病情變化的指標(biāo)。

圖8 對(duì)照組 (A)，模型組 (B)，五虎湯低、中、高劑量含藥血清組 (C～E) 和雷帕霉素組 (F) 的CD69 表達(dá)的流式結(jié)果Fig.8 Flow cytometry of CD69 expression in control group (A),model group (B),drug-containing serum low,medium,high dose of Wuhu Decoction group (C—E),and rapamycin group (F)

為了進(jìn)一步研究炎性因子IL-17A、IL-17F 的變化是否由樹突細(xì)胞自噬直接介導(dǎo)，體外采用RSV 感染樹突細(xì)胞與T 細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CD4＋T 細(xì)胞增殖水平和T 細(xì)胞活化標(biāo)志物CD69 表達(dá)升高，五虎湯含藥血清與自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素組CD4＋T 細(xì)胞增殖和CD69 的表達(dá)均顯著降低（P＜0.05、0.01），表明五虎湯可通過(guò)作用樹突細(xì)胞，抑制過(guò)度活化增殖的T 細(xì)胞。

綜上所述，樹突細(xì)胞的自噬水平與細(xì)胞因子IL-17A 和IL-17F 的分泌有關(guān)，RSV 可誘導(dǎo)哮喘小鼠肺組織樹突細(xì)胞自噬水平升高，使IL-17A、IL-17F水平上升，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。五虎湯可通過(guò)上調(diào)RSV誘導(dǎo)的哮喘小鼠的自噬水平，進(jìn)而降低IL-17A、IL-17F 等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，改善氣道炎癥，從而發(fā)揮治療RSV 誘發(fā)哮喘的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突