李少華，趙洪霞，溫 晨，丁志群，王敬蕊，程培紅,2*

1.寧波工程學(xué)院電信學(xué)院，浙江 寧波 315211 2.浙江大學(xué)硅材料國家重點實驗室，浙江 杭州 310027

引 言

由于具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)以及量子效應(yīng)，納米粒子在光、電、熱等方面均表現(xiàn)出優(yōu)異的特性，被廣泛應(yīng)用于生物、電子、光學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[1-4]。受其尺寸限制，單粒子的簡單靈敏的檢測方法對其應(yīng)用來講是至關(guān)重要的。目前，單粒子的光學(xué)檢測方法普遍采用SERS和激光誘導(dǎo)熒光信號等測量方法[5-9]。但是，這類檢測主要局限在具有SERS活性的粒子或可發(fā)光的熒光分子或粒子。并且，即使對于發(fā)光性能較好的有機染料分子和半導(dǎo)體納米粒子，固有的光漂白和blinking現(xiàn)象也對單粒子探測形成了挑戰(zhàn)。光散射測量是應(yīng)用于超細(xì)粒子的顯微成像和檢測的另外一種方法，但從理論上講，受液體背景下瑞利散射截面所限，最小的探測尺寸大約為80 nm。文獻(xiàn)已有報道，在表面等離子共振頻率的暗場照明下結(jié)合微分干涉對比技術(shù)和視頻增強技術(shù)可探測到直徑小于40 nm金屬粒子[10]。然而，由于瑞利散射隨著尺寸的減小而呈六次方減弱的趨勢，在細(xì)胞或散射組織內(nèi)，小尺寸粒子的散射信號很難從背景散射噪聲中分離出來。

眾所周知，介質(zhì)吸收電磁波后，部分或者全部激發(fā)能會轉(zhuǎn)化為熱能。20世紀(jì)70—80年代，研究人員基于這種能量的弛豫機制發(fā)展了基于光熱效應(yīng)的光譜技術(shù)[11-16]。其中比較常見的包括光熱干涉技術(shù)、熱透鏡、光熱偏轉(zhuǎn)等測量技術(shù)，并且這些測量技術(shù)也逐漸與光學(xué)顯微成像結(jié)合起來。利用這些測量方法，研究人員測量了薄膜、固體、液體和氣體等樣品中物質(zhì)的微弱光吸收，檢測極限可達(dá)到ng甚至pg量級。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，近年來光熱測量技術(shù)在單粒子、單分子檢測領(lǐng)域體現(xiàn)了極強的應(yīng)用前景。本論文主要介紹基于光熱效應(yīng)的光譜檢測技術(shù)在單粒子/分子成像和光譜檢測方面的應(yīng)用和發(fā)展歷程。主要包括熱透鏡顯微技術(shù)、偏振干涉測量技術(shù)、光熱差分測量等技術(shù)的實驗裝置、原理以及在單粒子/分子檢測方面的應(yīng)用，論文還論述了近年來研究人員在提高光熱顯微技術(shù)的信噪比、實現(xiàn)動態(tài)測量以及拓展紅外測量方面的研究進展。

1 光熱測量原理

介質(zhì)對激發(fā)光的吸收會引起介質(zhì)內(nèi)的折射率變化，并且會在加熱區(qū)附近出現(xiàn)折射率的梯度分布，稱為光熱效應(yīng)。人們利用第二束探測光入射至介質(zhì)，可以獲取光熱效應(yīng)導(dǎo)致的光程改變、折射率曲率變化或光偏轉(zhuǎn)等，由這些信號就可以得到介質(zhì)內(nèi)的光吸收特性。對于納米粒子而言，它的吸收截面隨著尺寸的減小而呈三次方減小的趨勢，當(dāng)粒子小至某一尺寸后，吸收將會大于散射。強吸收所導(dǎo)致光熱效應(yīng)會導(dǎo)致顆粒周圍的溫度增加。

根據(jù)熱傳導(dǎo)理論，假設(shè)粒子位于各向同性介質(zhì)中，如圖1所示，當(dāng)激發(fā)加熱光束作用在粒子上，在距離功率為P[1+cos(P[1+cos(ωt)])加熱點(即納米粒子)的某處溫度T可以表示為

圖1 單粒子光熱測量原理模型[17]Fig.1 Schematics of measurement principle of single-particle photothermal effect

2 常見的光熱顯微測量技術(shù)

2.1 熱透鏡測量技術(shù)

最初，光熱測量技術(shù)一般被用于平面樣品的檢測，1990年，東京大學(xué)的Tsuguo Sawada小組將光熱偏轉(zhuǎn)測量技術(shù)用于單個微球的檢測中，所采用的樹脂微球的尺寸在200～600 μm之間[20-21]。1993年，該組將顯微鏡引入光熱偏振測量系統(tǒng)，實驗裝置如圖2所示，在這一測量系統(tǒng)中，激發(fā)加熱光使用Ar+激光器的488 nm波長，探測光束為功率1 mW的He-Ne激光器的633 nm波長，激發(fā)光經(jīng)聲光調(diào)制后和探測光束同軸引入顯微物鏡，經(jīng)顯微物鏡后聚焦在樣品上，光束經(jīng)樣品后由濾光片去除激發(fā)光。如圖3(a)所示，由于吸收介質(zhì)的折射率一般具有負(fù)溫度系數(shù)，因此，激發(fā)光束的吸收導(dǎo)致的熱透鏡效應(yīng)會使探測光束發(fā)散，通過測量透過小孔的探測光束的強度變化可檢測樣品的熱信號。該光熱顯微測量系統(tǒng)對染料包覆的樹脂微球樣品的檢測極限達(dá)到了fg量級，并且，信號的空間分辨率近10 μm[22]。在這一測量系統(tǒng)中，激光發(fā)和探測光同軸引入顯微鏡，利用物鏡的色差使兩束光束聚焦于不同的點，可以避免調(diào)整和準(zhǔn)直激發(fā)和探測光束的麻煩。考慮到測量原理基于熱透鏡效應(yīng)，因此，研究人員將這種探測方法歸類于雙光束熱透鏡測量技術(shù)[23-25]。

圖2 熱透鏡顯微測量裝置示意圖[22]Fig.2 Schematics of the experiment set-up

1995年，Sawada小組將這種熱透鏡顯微技術(shù)應(yīng)用于水環(huán)境中染色生物細(xì)胞的分析中，顯示了這種探測技術(shù)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用前景；1998年，Sawada小組利用該技術(shù)成功地檢測了液體中單個粒子的脈沖光熱信號，并分別對它們進行計數(shù)[26]。圖3(b)是顯微鏡焦點附近液體環(huán)境中單粒子光熱顯微檢測的截面示意圖，根據(jù)Sawada的模型[20],透過物鏡的激發(fā)光誘導(dǎo)樣品中的熱效應(yīng)，對單個粒子，其尺寸遠(yuǎn)小于光束的束腰半徑，在激光束探測體積內(nèi)，作布朗運動的單個粒子像一個運動的點狀熱源，粒子周圍的溫度梯度增強了光熱效應(yīng)。圖4為不同粒子數(shù)濃度的80 nm聚苯乙烯球的光熱信號響應(yīng)，其中探測區(qū)粒子數(shù)在0到8.7×10-4之間變化。從圖中可以明顯觀察到痕量粒子的光熱脈沖信號。同時研究人員發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)的光熱信號響應(yīng)主要決定于鎖相放大器的時間常數(shù)，在傳統(tǒng)的熱透鏡測量中，常采用增大時間常數(shù)的方法改善信噪比。而在單粒子檢測中，粒子在探測區(qū)體積內(nèi)平均停留時間僅有幾十到幾百毫秒量級，具體時間與粒子的尺寸有關(guān)。因此，鎖相放大器較小的時間常數(shù)更有利于提高脈沖信號的信噪比。

圖3 (a)熱透鏡效應(yīng)示意圖[22]；(b)單粒子在液體微區(qū)內(nèi)的光熱效應(yīng)示意圖[26]Fig.3 (a) Schematic of photothermal lens phenomena；(b) Schematic illustration of the photothermal measurement of a nanoparticle in liquid microspace

圖4 痕量80 nm聚苯乙烯微球溶液的光熱信號,期望值(探測區(qū)內(nèi)的粒子數(shù))分別為 (a) 8.7×10-4 ,(b) 1.8×10-4,and (c) 3.6×10-5,(d) 超純水(空白樣)Fig.4 Monitored signals for the trace turbid solution of 80 nm polystyrene particles. The expectation values were (a) 8.7×10-4 ,(b) 1.8×10-4,and (c) 3.6×10-5,(d) Ultrapure water (blank)

在光熱透鏡測量系統(tǒng)中，顯微物鏡的色差會使激發(fā)光束和探測光束聚焦于不同的點，二者聚焦的位置對探測信噪比有極大影響。當(dāng)兩束光聚焦點相距31/2Zc時(Zc共焦距離)系統(tǒng)的靈敏度最佳。因此，Takehiko Kitamori等改進了實驗裝置[27-29]，引入了焦點控制單元來調(diào)整激發(fā)和探測光的聚焦點的相對位移，以達(dá)到最佳的熱透鏡測量布局。此外，光熱透鏡顯微測量的空間分辨率是由熱擴散長度決定的，因此，材料本身的熱光系數(shù)和激光的調(diào)制頻率也是決定測量分辨率的兩個重要參數(shù)。在測量系統(tǒng)中一般將探測光調(diào)制在1 kHz左右，采用鎖相放大器來去除背景信號提高信噪比，但是這樣并不能去除由背景噪聲導(dǎo)致的1 kHz左右的低頻波動的影響。

2.2 微分干涉相差測量技術(shù)

在熱透鏡測量技術(shù)中，主要通過檢測熱致折射率變化所引起的透射光強度的變化。當(dāng)采用這種技術(shù)來檢測納米流體(nanofluidics)時，由于納米通道(nanochannel)的尺寸小于波長，因此不能用幾何光學(xué)來描述熱透鏡的折射現(xiàn)象，而探測光熱效應(yīng)引起的相位信號變化可以解決這一問題。2002年，法國波爾多大學(xué)國家科學(xué)研究中心的BrahimLounis小組和荷蘭萊頓大學(xué)惠更斯實驗室的Michel Orrit小組采用靈敏的微分干涉方法去探測粒子光熱效應(yīng)引起的微弱相位變化[30-31]。圖5(a)是測量的實驗裝置，采用了514 nm的Ar+激光器作為激發(fā)加熱光源，He-Ne激光器633 nm激光作為探測光束。將加熱光束的功率保持在20 mW，并用聲光調(diào)制器將頻率調(diào)制在某一頻率(100 kHz和10 MHz之間)。探測光束通過偏振分束后經(jīng)過一個Wollaston棱鏡后偏振方向旋轉(zhuǎn)45度，之后分成兩個垂直偏振的光束，夾角約0.1°。兩束光聚焦到顯微鏡物鏡的物平面形成兩個相距1.2 μm的光點。加熱光束經(jīng)分束器后與其中一束探測光重合。兩束探測光經(jīng)樣品表面反射后在Wollaston棱鏡中重合，二者的相位差引起的垂直偏振光信號被偏振立方體反射進入快速探測器。顯然，兩個探測光束的相位差變化與某點的平均溫度呈正比關(guān)系。

圖5 (a)偏振干涉光熱測量裝置；(b)直徑為5 nm的金納米粒子的光熱成像[30]Fig.5 (a) Schematics of the experiment set-up；(b) photothermal images of 5 nm gold nanoparticles in a few tens of nanometers thick polyvinyl alcohold film on a glass substrate

在微分干涉相差測量中，為了使兩束反射光在Wollaston棱鏡達(dá)到最佳重合，研究人員在光路內(nèi)插入遠(yuǎn)心鏡頭系統(tǒng)使得棱鏡處于物鏡的像焦平面，并通過調(diào)整加熱光束在兩個探測光點間移動，當(dāng)它與某一個探測光點重合時能夠獲得最大的信號。為了提高測量的信噪比，實驗采用了鎖相放大器來檢測調(diào)制頻率下兩束探測光的強度變化以及相位變化，并且采用了高頻調(diào)制的方法來抑制噪聲，調(diào)制頻率決定溫度調(diào)制的區(qū)域，通過頻率的選擇使得溫度調(diào)制區(qū)域的體積容量與顯微物鏡聚焦點大致重合。為了獲得單個粒子的顯微成像，樣品由精密位移臺控制并相對于三個光點進行掃描。在這一實驗中，研究人員獲得了直徑為5nm的金納米粒子的顯微圖像，如圖5(b)所示，該測量的信噪比達(dá)到了10。

液體環(huán)境中單粒子探測的難度較大，這主要是由于粒子的快速布朗運動會導(dǎo)致在聚焦區(qū)內(nèi)停留時間非常短暫(約幾個毫秒)，在這種情況是無法利用信號積分的方法來改善探測極限的。2009年，Takehiko Kitamori小組利用微分干涉相差法對水中的單個金納米粒子(5 nm)進行計數(shù)[32]，并研究了微分干涉相差測量中激發(fā)光的偏振方向和調(diào)制頻率對光熱信號的影響。為了獲得良好的相位對比，他們采用一對差分干涉相差棱鏡，它們具有5 μm的高切變值，與熱擴散長度一致。實驗表明，與傳統(tǒng)的熱透鏡測量技術(shù)相比，微分干涉相差測量方法可使信號的背景降至1/100，信噪比提高1個數(shù)量級。

在活細(xì)胞生物標(biāo)記成像方面，單粒子(分子)跟蹤是常用的方法，但是所采用的標(biāo)記粒子必須尺寸足夠大(>40 nm)，其瑞利散射強度才能通過傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡檢測。另一方面，單分子檢測中常采用的有機染料、蛋白質(zhì)標(biāo)記分子的光漂白問題限制了它在活細(xì)胞內(nèi)的觀察時間。利用光熱法可以實時檢測小尺寸金屬納米粒子，從而解決以上問題。2003年，Cognet等采用10 nm的金粒子作為標(biāo)記，利用干涉光熱測量技術(shù)成功對膜蛋白顯色成像[42],實驗發(fā)現(xiàn)，該方法面臨的一個限制是信噪比與光吸收導(dǎo)致的樣品溫度上升之間的平衡。

2.3 光熱外差測量技術(shù)

盡管干涉相差法具有較高的靈敏度，但是它受限于干涉儀兩臂光束的重合度以及二者相位差的波動。2004年，Brahim Lounis小組提出了光外差法用于檢測單個納米粒子的光熱信號，并實現(xiàn)了對僅包含67個原子的金屬納米團簇成像。與微分干涉相差法相比，信號的靈敏提高了2個數(shù)量級[33]。

理論上，對于一個處于各向同性介質(zhì)中的金納米顆?；蚱渌占{米粒子，在一束強度調(diào)制的激光照射下，可以看作一個熱功率為Pheat[1+cos(Ωt)]的熱源，其中Ω是調(diào)制頻率，Pheat是粒子吸收的平均激光功率。光熱效應(yīng)導(dǎo)致粒子周圍介質(zhì)受時間調(diào)制的折射率分布發(fā)生變化[32]

其測量裝置如圖6(a)所示[34]，采用了Ti藍(lán)寶石激光器的720 nm作為探測光，Nd∶YAG的倍頻光532 nm作為加熱光束。為了避免吸收光功率對電子弛豫動態(tài)的影響，實驗采用弱激發(fā)條件，使得兩次連續(xù)吸收過程的平均時間間隔比納米粒子的弛豫時間長。利用聲光調(diào)制器將加熱光束調(diào)制頻率保持在100 kHz到15 MHz。兩束光用高孔徑物鏡聚焦在樣品同一點，探測光與散射場干涉作用后通過另一物鏡、分色鏡和紅光濾光片后進入鎖相放大器。實驗中激光光點固定，通過2D壓電掃描系統(tǒng)移動樣品從而獲取粒子的顯微圖像。圖6(b)和(c)分別是直徑為5 nm的金納米粒子和1.4 nm金納米團簇的三維光熱外差圖像?？梢钥闯?，圖像中沒有襯底的背景噪音，信號完全來自于光吸收粒子即金納米團簇。此外，該小組利用這一方法在弱光照射下成功地完成了對CdSe/ZnS發(fā)光量子點的成像，并且還測量了單個金納米粒子的吸收截面。

圖6 (a)光熱差分顯微測量裝置；(b)直徑為5 nm的金納米粒子的光熱成像；(c) 1.4 nm的金納米團簇光熱圖像[33]Fig.6 (a) Experiment Schematics of photothermal heterodyne imaging method；(b) photothermal imaging of isolated 5 nm Au nanoparticles；(c) photothermal image of isolated 1.4 nm Au nanoparticle

與早期的光熱透鏡測量和干涉相差測量技術(shù)相比，光熱外差顯微技術(shù)具有靈敏度高、裝置相對簡單，無需光束準(zhǔn)直等顯著優(yōu)點，因而在單粒子檢測方面獲得了廣泛的應(yīng)用[34-45]。2005年，BrahimLounis小組利用光熱外差法測量了單個金納米粒子的吸收光譜，研究了金屬納米粒子表面等離子吸收的尺寸效應(yīng)，清楚地觀察到了最小直徑為5nm的金納米粒子的局域表面等離子共振的均勻展寬[35]。同年，該小組利用同樣的方法首次在室溫下測量了單個CdSe/ZnS半導(dǎo)體納米晶的吸收光譜,觀察到了帶邊X態(tài)和高能態(tài)(1Se，2Sh，3/2)的共振吸收，測得了吸收和熒光譜線的斯托克位移[37]。2008年該組又將光熱外差法用于單根碳納米管吸收截面的測量[38-39]。2010年，Greg Hartland小組用光熱外差成像法測量了單根CdSe納米線的吸收截面，并且觀察到了了納米線沿不同方向的各向異性光吸收現(xiàn)象[40]。同年，Orrit小組利用該技術(shù)首次在室溫下測量了單個BHQ1(Black-Hole-Quencher)分子的吸收截面[41],實驗結(jié)果表明，這一測量技術(shù)對缺陷或粗糙度的散射不敏感，在300 ms的積分時間內(nèi)單分子檢測的信噪比可達(dá)到10。2015年，萊斯大學(xué)的Stephan Link小組將多波長超連續(xù)激光作為加熱光束引入光熱測量裝置，測量了金屬納米粒子的吸收光譜，并且實驗確定了不同尺寸和形狀的單個粒子的吸收和散射光譜間的相對位移[42]。

光熱外差法在生物機理研究中也展示了優(yōu)異的應(yīng)用前景[35,43-48]。2006年，Lasne等利用更高靈敏度的光熱外差法檢測了利用低粒子數(shù)密度的5 nm金粒子標(biāo)記的膜受體在活的COS7細(xì)胞內(nèi)的二維運動軌跡，并且實驗發(fā)現(xiàn)，對于水介質(zhì)中5 nm的金納米粒子，功率密度為400 kW·cm-2的激光僅會引起1.5 K的溫升[44]。2011年，Leduc等利用光熱外差法探測了MUS/OT包覆的金納米粒子在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的動態(tài)特性，并且可根據(jù)光熱信號獲知探測區(qū)內(nèi)局部的細(xì)胞粘度信息[46]。

3 單粒子光熱檢測技術(shù)的發(fā)展

3.1 信噪比的改進

圖7 直徑為28 nm的金納米粒子在不同介質(zhì)條件下的光熱信號對比(b)：水；(c)：硅油；(d)：23 ℃時液晶5CB；(e)：31 ℃時液晶5CB[51]Fig.7 Photothermal images of 28 nm gold nanoparticles recorded in different media(b):Water;(c):Silicone oil;(d):5CB at 23 ℃;(e):5CB at 31 ℃

3.2 動態(tài)測量技術(shù)的發(fā)展

3.2.1 光熱關(guān)聯(lián)光譜法(photothermal correlation spectroscopy)

2009年，光熱信號關(guān)聯(lián)光譜技術(shù)開始被用于探測單個納米粒子在介質(zhì)中的擴散、光物理等動態(tài)特性研究中[53-56]，與熒光關(guān)聯(lián)光譜(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)類似，它測量與納米粒子光吸收成正比的光熱信號的相關(guān)函數(shù)。其檢測實驗裝置與光熱外差法一樣，時間調(diào)制的激發(fā)光束誘導(dǎo)納米粒子周圍的隨時間改變的折射率分布，探測光束與折射率分布相互作用后攜帶與調(diào)制頻率同步的散射信號，探測器檢測該散射場與前向透過光束相干后的拍頻信號。在自相關(guān)測量中，探測光束、激發(fā)光束以及樣品位置保持不變，伴隨納米粒子在探測區(qū)域內(nèi)擴散的高取樣頻率下信號的漲落被記錄下來。該信號主要來自于光熱信號(s)的自相關(guān)函數(shù)[G(τ)]為

其中〈〉代表時間平均。假設(shè)觀察區(qū)域是橢圓高斯形分布，并且粒子運動為自由擴散，那么，

其中N是觀察區(qū)域的平均粒子數(shù)，A是觀察區(qū)域的形狀參數(shù)，τD是特征擴散時間。觀察區(qū)域的形狀參數(shù)A對確定特征擴散時間是非常重要的，假設(shè)探測區(qū)域為準(zhǔn)共焦(quasi-confocal)高斯形狀，A=Wz/Wxy，Wz和Wxy分別為橢球橫向和縱向半徑。在實驗中，根據(jù)歸一化自相關(guān)函數(shù)擬合實驗曲線，獲得參數(shù)N和τD，由擴散時間τD和液體的粘度系數(shù)η以及與溫度和裝置幾何形狀相關(guān)的參數(shù)γ間的關(guān)系，τD=γηd,就可以獲得粒子在液體介質(zhì)中的動態(tài)半徑以及擴散情況。如圖8所示，Vivien等用這種技術(shù)測量了功能化修飾的金納米粒子的光熱關(guān)聯(lián)曲線，通過與理論擬合，可以分別獲取生物素單功能化、鏈酶親和素混合后的納米粒子以及CALNN包覆前后的納米粒子光熱信號的關(guān)聯(lián)曲線，得到不同修飾的納米粒子的擴散時間，進而獲取粒子動態(tài)的流體學(xué)直徑，精度可達(dá)到納米量級[53]。

圖8 (a)10 nm生物素單功能化的納米粒子(左)和與鏈酶親和素混合后(右)的納米粒子的光熱信號關(guān)聯(lián)曲線；(b) CALNN包覆前后的納米粒子光熱信號關(guān)聯(lián)曲線Fig.8 (a) Photothermal correlation curves obtained from 10 nm biotin monofunctionalized nanoparticles(left) and upon mixture with streptavidin. Solid lines represent theoretical fits using eq 2；(b) Photothermal curves from bare and CALNN-coated gold nanoparicles. CALNN is a 5 amino-acid long peptide

2013年，Markus Selmke等在雙焦點探測區(qū)域體積近似的基礎(chǔ)上分析評價相關(guān)函數(shù)，提出了一個新的光熱關(guān)聯(lián)光譜測量技術(shù)[57-58]。結(jié)果表明，該技術(shù)可以測量14 nm的金納米粒子在輻射壓力引導(dǎo)下的漂移速度大約為10 nm·ms-1，這一數(shù)值低于單粒子熒光關(guān)聯(lián)光譜測量的探測極限，在這一測量中，由于樣品的采樣體積非常小，大約飛升(femtoliter)量級，因而獲取的光熱信號不包含空間和時間分布的信息。2015年,利物浦大學(xué)的Nievers等將柵格圖像關(guān)聯(lián)光譜技術(shù)應(yīng)用于光熱顯微鏡成像系統(tǒng)，不僅實現(xiàn)了納米粒子空間分布的觀察，而且獲得了粒子在寬時間范圍內(nèi)的擴散動態(tài)[59]。

3.2.2 光熱外差全息成像(photothermal heterodyne holography)

常規(guī)的光熱測量技術(shù)一般采用單點測量，它通過激光對粒子周圍折射率的變化進行空間掃描成像，因此，入射光瞬時的噪聲將會引起圖像在空間上的噪聲。同時，單點測量很難提供快速的大視場成像，難以獲得粒子間的相對位移等信息[60-61]。光熱激發(fā)與數(shù)字外差全息技術(shù)的結(jié)合是近年發(fā)展的大視場(100 μm2區(qū)域)光熱探測方法[61]。其測量裝置如圖9所示，光熱激發(fā)采用波長為532 nm的正弦調(diào)制的連續(xù)波激光，通過分束器后直接進入物鏡照射在樣品上。全息照相臂采用波長為785 nm單模激光二極管，由半波片和偏振分束器將光分為參考光束和照射光束。二者都采用了聲光調(diào)制器將頻率調(diào)制在80 MHz附近。為了使兩束光的偏振方向一致以便干涉，在其中一束光路上加入半波片。與大多數(shù)差分干涉儀一樣，該裝置可以通過選擇適當(dāng)?shù)氖еC頻率來研究調(diào)制在任一頻率下的光熱信號。

圖9 光熱外差全息成像的測量裝置示意圖Fig.9 Experimental setup of photothermal heterodyne holography

這種光熱外差全息成像方法可以在5 s內(nèi)對180 μm2范圍內(nèi)的樣品成像，與單點掃描成像技術(shù)的25 μm2·min-1相比要高的多。同時，該方法可以研究納米粒子在三維空間的信息，在生物領(lǐng)域?qū)?biāo)記納米粒子的三維成像中具有較好的應(yīng)用價值。然而值得注意的是，與單點檢測相比，大視場檢測的信噪比要大約低一個數(shù)量級。該方法需要在大的觀測范圍、視頻速率采樣速率以及大熱擴散半徑之間權(quán)衡協(xié)調(diào)。此外，要獲得在大視場內(nèi)對樣品加熱的功率密度，就需要超高的激光功率，這就有可能會對樣品造成損傷。

3.3 激發(fā)光波長的拓展

紅外顯微技術(shù)與光譜技術(shù)的結(jié)合可用于微區(qū)樣本分析，在材料、生物等領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景。然而，由于紅外光譜中大多數(shù)可利用的激光波長位于中紅外(3～11 μm)，瑞利判據(jù)Δ=0.61λ/NA的限制決定了紅外顯微鏡的空間分辨率普遍較低，采用固體浸沒透鏡可提高分辨能力，但最多可以使分辨率達(dá)到2 μm左右。近年來，紅外光熱外差顯微技術(shù)逐漸發(fā)展起來[62-69]。與普通光熱外差測量裝置不同的是采用中紅外激光作為激發(fā)光源，仍然采用可見光為探測光，這樣光熱差分顯微技術(shù)不僅可以測量樣品帶間吸收的光熱信號，還可測量帶內(nèi)躍遷、振動躍遷吸收等。并且，信號的空間分辨率可提高至亞微米量級。2017年，Gregory V.Harland小組利用中紅外可調(diào)諧光學(xué)參數(shù)振蕩器(2.5～3.7 μm)作為激發(fā)光源，532 nm激光作為探測光，在干燥環(huán)境中實現(xiàn)了亞微米尺寸聚合物粒子的成像，分辨率達(dá)到0.3 μm[67]。同年，Bijeesh等采用雙光子吸收導(dǎo)致的熱效應(yīng)，對單個20 nm的BaTiO3納米粒子的成像，由于非線性光激發(fā)可避開生物組織對350～650 nm可見光的吸收，從而實現(xiàn)快速深組織成像，因此，紅外光熱成像在生物非線性光學(xué)標(biāo)記領(lǐng)域展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景[62]。

4 結(jié) 論

基于光熱效應(yīng)的顯微光譜技術(shù)具有優(yōu)異的時空分辨率、信噪比和靈敏度，可實現(xiàn)對樣品的實時、原位和免標(biāo)記檢測，因而，近年來在單粒子成像和光譜分析方面取得廣泛的應(yīng)用。但是，光熱顯微技術(shù)的發(fā)展仍然面臨一些挑戰(zhàn)，比如實驗裝置相對復(fù)雜、信號的時間分辨率較低、檢測速度慢等問題。通過技術(shù)的不斷進步，可望克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，進一步提升其檢測性能[70-72]。同時，在大數(shù)據(jù)時代，基于機器視覺等人工技術(shù)的圖像分析和數(shù)據(jù)處理技術(shù)可以高效的從海量的圖像數(shù)據(jù)中獲得更準(zhǔn)確的信息，這些技術(shù)的引入可望進一步推動光熱顯微光譜技術(shù)在單粒子檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。