郝甜,趙新偉,孫然,才滿,杜克久

(1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071000；2 河北林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)作為常見(jiàn)的環(huán)境有機(jī)污染物[1-2]，可沿食物鏈逐級(jí)富集至生物體內(nèi)[3-5]。環(huán)境中PBDEs同系物因還原反應(yīng)脫溴，生成低溴聯(lián)苯醚[6]，其中4-溴帶聯(lián)苯醚(4-bromodiphenyl ether，BDE-3)作為 PBDEs 脫溴反應(yīng)的終產(chǎn)物之一[7]，在 PBDEs 生物修復(fù)研究中備受關(guān)注[8-10]。

ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與生物對(duì)逆境的適應(yīng)過(guò)程[11-12]，目前多數(shù)研究集中于其對(duì)金屬或農(nóng)藥抗性等方面[13-15]，并且將酵母 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物體內(nèi)超表達(dá)，發(fā)現(xiàn)可提高植物對(duì)于重金屬的抗性[16-17]，而對(duì)于其是否參與包括 PBDEs 在內(nèi)環(huán)境持久性有機(jī)污染物(POPs)的轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒過(guò)程研究尚無(wú)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

毛白楊葉際異常維克漢姆酵母、煙草組培苗由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物修復(fù)實(shí)驗(yàn)室保存

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因的克隆及序列分析 以異常維克漢姆酵母菌體 DNA 為模板，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果(未公開(kāi))，由上海生工合成如下2條引物分別為正向引物 5′-GGGACTCTTGACCATGTCA

TCAGATATCAGA和反向引物5′-AGTCAGATCTACCATGTCACTTCTTGGGTTTTTC。PCR反應(yīng)體系(50 μL)包括： 正向引物與反向引物各 1 μL；普通 Taq 酶 Mix：25 μL；DNA：1 μL；ddH2O：22 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：(1)預(yù)變性：94 ℃，2 min。(2)變性：94 ℃，30 s，退火：56 ℃，30 s，延伸：72 ℃，5 min，30個(gè)循環(huán)。(3)最終延伸，72 ℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳回收擴(kuò)增片段，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌落 PCR 鑒定陽(yáng)性菌落，重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。

采用 GSDS 在線軟件分析基因結(jié)構(gòu)；利用 SMART 進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析，由 DNAMAN 軟件與其他物種進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。

1.2.2 植物過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建 首先根據(jù)對(duì)基因全長(zhǎng)和載體進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，選擇目的基因內(nèi)部沒(méi)有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的酶SalI和SpeI，再將 pCambia1 302-35s、pT-Wapdr15 質(zhì)粒酶切后，電泳檢測(cè)，回收目的片段。利用北京全式金生物技術(shù)有限公司出品的 T4DNA Ligase 試劑，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)，挑取菌落進(jìn)行菌落 PCR，陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定目的基因過(guò)表達(dá)載體是否構(gòu)建成功。將制備成功的重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，獲得攜帶目的基因的陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌株。

1.2.3 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草及轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定 采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)化方法參考郭曉蓉[18]。利用 PCR 技術(shù)鑒定目的基因是否轉(zhuǎn)入煙草。

同時(shí)，對(duì)于上市問(wèn)題，宗慶后此前一直堅(jiān)持娃哈哈不差錢、不上市。而今年3月，也有媒體報(bào)道稱，娃哈哈開(kāi)始為上市而瘦身——清退員工股份。宗慶后也改口表示，未來(lái)如果有大的產(chǎn)業(yè)要投資，娃哈哈也要上市募集資金。

1.2.4Wapdr15基因功能初步分析 從生長(zhǎng)一致的未轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)入Wapdr15基因的煙草組培苗相同部位，剪取葉片，平鋪到煙草分化培養(yǎng)基上，并吸取 10 μL 5 mg/mL BDE-3 滴到不同煙草葉片上，觀察記錄不同煙草葉片的受害情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的克隆

目的基因克隆結(jié)果見(jiàn)圖1。

以酵母 DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1 a所示。引物設(shè)計(jì)時(shí)預(yù)計(jì)Wapdr15基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度為 4 536 bp，由圖1 a可知，各基因的 PCR 產(chǎn)物片段大小與預(yù)計(jì)片段長(zhǎng)度一致?；厥占兓哪康幕?DNA 片段與 pUCm-T 載體進(jìn)行連接，菌落 PCR 檢測(cè)電泳結(jié)果如圖1 b所示。由圖1 b 可知，泳道 1-4 號(hào)出現(xiàn)目的條帶，與泳道 5 陽(yáng)性對(duì)照中條帶位置相同，而陰性對(duì)對(duì)照(泳道 6)中則無(wú)條帶。提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒送往生工(上海)生物有限公司測(cè)序。

Wapdr15測(cè)序結(jié)果及編碼氨基酸序列見(jiàn)圖2。

如圖2所示，經(jīng) NCBI 序列比對(duì)，與異常維克漢姆酵母目的基因的相似度為 98%，說(shuō)明目的基因Wapdr15克隆成功，將序列正確的質(zhì)粒命名為pT-Wapdr15。毛白楊葉際異常維克漢姆酵母(W.anomalus)Wapdr15基因長(zhǎng)度為4 536 bp，編碼1 511個(gè)氨基酸。

2.2 Wapdr15基因生物信息學(xué)分析

Wapdr15基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖3所示。

由圖 3 可知，Wapdr15基因中無(wú)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

Wapdr15基因編碼氨基酸序列結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果如圖4所示。

圖4 WaPDR15蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Figure 4 Domain structure of WaPDR15 protein

由圖 4 可知 WaPDR 15轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含有 ABC 蛋白的結(jié)構(gòu)域PDR-CDR(710～802)，符合 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 G 家族的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，所以WaPDR 15轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于 ABCG 家族。WaPDR15 共包含 2 個(gè) NBD (173～383，870～1 061)和 TMD (489～699，1 158～1 378)，形成了 NBD1～TMD1～NBD2～TMD2結(jié)構(gòu)，為典型的全分子蛋白。

WaPDR15 與其他物種 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果如圖5所示。

圖5 WaPDR15與其他物種氨基酸比對(duì)Figure 5 The amino acids of WaPDR15 comparison with other species

由圖 5 可知 WaPDR15 N 端的 NBD 結(jié)構(gòu)域中包含 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列中高度保守的 Walker-A、Walker-B 基序。

2.3 植物過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

pT-Wapdr15、pCam1 302-35s 質(zhì)粒酶切結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6 a中可知，1～3泳道中片段長(zhǎng)度為5 000 bp，與目的基因長(zhǎng)度相符。由圖6 b中可知，1～5泳道片段長(zhǎng)度為11 000 bp，與待連接質(zhì)粒長(zhǎng)度相符。

圖6 質(zhì)粒酶切電泳檢測(cè)結(jié)果Figure 6 Detection results of plasmid enzyme cutting electrophoresis

重組質(zhì)粒菌落PCR及酶切電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖 7。

圖7 重組質(zhì)粒菌落PCR及酶切電泳檢測(cè)結(jié)果Figure 7 Detection results of recombinant plasmid colony PCR and enzyme digestion electrophoresis

由圖 7a可知，酶切回收產(chǎn)物與表達(dá)載體 pCam1 302～35 s連接，菌落PCR鑒定結(jié)果中泳道1、2號(hào)出現(xiàn)目的條帶，與泳道3陽(yáng)性對(duì)照中條帶位置相同，而陰性對(duì)照中則無(wú)條帶，表明pCam-Wapdr15初步構(gòu)建成功。為進(jìn)一步確保載體構(gòu)建正確，挑選目的條帶明亮的 2 號(hào)菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒 PCR 和酶切鑒定。由圖7 b可知，酶切產(chǎn)物電泳檢測(cè)出現(xiàn)兩條帶，大片段11 000 bp和小片段5 000 bp，結(jié)果與預(yù)期相符，經(jīng)鑒定獲得植物表達(dá)載體pCam-Wapdr15重組質(zhì)粒。

農(nóng)桿菌菌落PCR結(jié)果如圖8所示。

圖8 農(nóng)桿菌菌落PCR凝膠電泳圖Figure 8 PCR gel release results of agrobacterium colonies

采用熱激法將pCam-Wapdr15轉(zhuǎn)入Agl 1農(nóng)桿菌，菌落PCR鑒定結(jié)果如圖8，所擴(kuò)增的片段與陽(yáng)性對(duì)照一致，說(shuō)明基因成功轉(zhuǎn)入 Agl 1 農(nóng)桿菌中。

2.4 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草及轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定

轉(zhuǎn)化煙草過(guò)程如圖9所示。

圖9 Wapdr15基因轉(zhuǎn)化煙草Figure 9 Tobacco transformed with the Wapdr15 gene

由圖9可知，將含有目的基因pCam-Wapdr15的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入煙草，培養(yǎng)1個(gè)月后，進(jìn)行篩選生根，得到疑似含 pCam-Wapdr15基因的抗性植株。選取生長(zhǎng)狀況良好的煙草組培苗葉片(圖9a)，剪成1 cm2方塊，培養(yǎng)基中加入抗生素后篩選轉(zhuǎn)染成功的煙草葉片(圖9b)，葉片上開(kāi)始出現(xiàn)不定芽(圖9c)，1個(gè)月后逐漸長(zhǎng)出不定根(圖9d)。

轉(zhuǎn)基因煙草組培苗驗(yàn)證結(jié)果如圖10所示。

圖10 轉(zhuǎn)基因植物的PCR擴(kuò)增1%瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 101% agarose gel electrophoresis of PCR product of transgenic plants

由圖10可知，以轉(zhuǎn)基因植株的 DNA 為模板，以含有目的基因片段pCam-Wapdr15的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以野生型煙草植株作陰性對(duì)照，對(duì) 5 個(gè)煙草株系進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增鑒定。轉(zhuǎn)基因煙草株系和陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果一致，且陰性對(duì)照植株沒(méi)有擴(kuò)增出特異性條帶，說(shuō)明成功獲得了Wapdr15的轉(zhuǎn)基因植株，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 WaPDR 15轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的功能分析

轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草對(duì) BDE-3的耐受情況如圖11所示。

圖11 轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)BDE-3的耐受情況Figure 11 Tolerance of transgenic tobacco to BDE-3

如圖11所示，為探究Wapdr15轉(zhuǎn)基因煙草植物對(duì) BDE-3 耐受情況，分別在葉齡一致的煙草葉片下表面的固定位置滴加10 μL 5 mg/mL的BDE-3，每24 h觀察葉片滴加部位的壞死情況。野生型對(duì)照組煙草葉片在滴加BDE-3第4天出現(xiàn)褐化壞死斑(圖11白色箭頭所指)，而轉(zhuǎn)毛白楊葉際異常維克漢姆Wapdr15轉(zhuǎn)基因的煙草葉片未出現(xiàn)褐化壞死斑，表現(xiàn)出一定抗性。

3 討論與結(jié)論

ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與生物抗逆過(guò)程，真菌中 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物中的超表達(dá)可以提到轉(zhuǎn)基因植物的抗性；釀酒酵母 YCF1 可以明顯提高印度芥菜(Brassicajuncea)對(duì)Cd和Pb的耐性；粟酒裂殖酵母中的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sp HMT1可以提高擬南芥種子的Cd耐性[16-17]。

Wapdr15基因編碼蛋白質(zhì)中包含保守度極高的 Walker-A、Walker-B 基序[12]，與葡萄中 ABCG 亞族中蛋白結(jié)構(gòu)相似[19]，這些結(jié)構(gòu)和保守基序都有助于NBD 與 ATP 結(jié)合并水解[20]，為物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸提供能量，提高生物抗逆能力。Wolfge 等[21]的研究結(jié)果顯示，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) ABCG 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白pdr15由轉(zhuǎn)錄因子pdr1和pdr3控制，pdr1和pdr3通過(guò)與順式作用位點(diǎn) PDREs(PDR響應(yīng)元件)結(jié)合，調(diào)控 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白藥物外排泵的表達(dá)，從而產(chǎn)生抗藥性。為研究Wapdr15基因?qū)?BDE-3 的作用，對(duì)Wapdr15基因進(jìn)行克隆、構(gòu)建Wapdr15基因過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草，分析轉(zhuǎn)入Wapdr15基因煙草對(duì) BDE-3 的耐受情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的煙草對(duì) BDE-3 的耐受顯著好于野生型對(duì)照煙草，毛白楊葉際異常維克漢姆 WaPDR15 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以增強(qiáng)煙草對(duì)于PBDEs的耐受性。

綜上所述，Wapdr15基因編碼序列長(zhǎng)4 536 bp，為全分子跨膜蛋白。毛白楊異常維克漢姆 WaPDR15ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì) BDE-3 有解毒作用。這些發(fā)現(xiàn)都將有助于進(jìn)一步揭示毛白楊葉際異常維克漢姆酵母對(duì) BDE-3 耐受解毒分子機(jī)制，并可以為包括林木在內(nèi)的植物對(duì)有機(jī)污染物修復(fù)機(jī)制研究提供借鑒。毛白楊葉際異常維克漢姆酵母 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Wapdr15有望成為包括毛白楊在內(nèi)的楊樹(shù)以及其他木本植物遺傳轉(zhuǎn)化的抗有機(jī)污染物基因資源，為獲得可修復(fù) BDE-3及其他 PBDEs 以及 POPs 的木本植物新種質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。