田昆侖，楊志華，蘇娟，李建蓉

（1.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，云南 大理 671000；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病原生物系，湖北 武漢 430030）

HCV 主要經(jīng)血液或血制品傳播，占輸血后肝炎的80%～90%，目前全球有1.7 億人感染HCV，我國健康人群抗HCV 陽性率為0.7%～3.1%，約3 800 萬人，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。由于丙肝初始癥狀不明顯，不易被發(fā)覺，且疾病隱匿性發(fā)展，因而比乙肝更易演變?yōu)槁愿窝?、肝硬化和肝癌。西醫(yī)治療以干擾素為主要藥物，但其臨床完全應(yīng)答率僅為50%左右。小柴胡湯具有消炎、保護(hù)細(xì)胞膜的作用，被廣泛用于治療慢性肝病[1]。本研究旨在探討小柴胡湯抗丙型肝炎病毒（HCV）的作用機(jī)制，并通過動物實(shí)驗(yàn)，觀察藥物對機(jī)體免疫功能的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取6～8周齡清潔級ICR小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g，平均體質(zhì)量（20.3±2.2）g，隨機(jī)分為給藥組和對照組，每組20只。8～9周齡清潔級SD大鼠，體質(zhì)量200 g左右，由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動物給藥 小柴胡湯組方：柴胡9 g、黃芪6 g、半夏6 g、黨參6 g、生姜6 g、炙甘草3 g和大棗4枚。上述材料購自武漢市中藥材公司，藥物煎煮2次，合并2次煎煮液過濾濃縮，1 mL 溶液相當(dāng)于原生藥1 g，置4 ℃保存?zhèn)溆?。給藥組給予15 g/kg（ig）試藥，對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液，每天給藥2次，連續(xù)給藥10 d。

1.2.2 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)（采用MTT法） 第11天處死小鼠，無菌取脾臟，常規(guī)分離淋巴細(xì)胞，采用10 μg/mL ConA，培養(yǎng)68 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入四甲基偶氮唑鹽（MTT）1 mg/mL，每孔50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入細(xì)胞裂解液每孔100 μL，37 ℃放置過夜，在酶標(biāo)儀570 nm 波長下測定A 值，以反應(yīng)細(xì)胞增殖程度。

1.2.3 T細(xì)胞亞群（L3T4＋、Lyt2＋）檢測 無菌取小鼠胸腺，分離淋巴細(xì)胞，采用間接免疫熒光法測定L3T4＋、Lyt2＋細(xì)胞亞群，試劑購自華美生物工程公司。

1.2.4 藥物血清的制備[2]用煎煮藥方給予15 g/kg 灌喂大鼠，于1次給藥后1、2 h，2次給藥后1 、2 、3 h采血，分離血清，56 ℃滅活，-20 ℃保存待用。

1.2.5 PBK-HCV 重組體 1 693 bp HCV cDNA片段（核苷酸序號為317-2009nt）和SMMC7721肝癌細(xì)胞由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院傳染病研究所提供。主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Oligod（T）16，為美國GIBCOBRL公司生產(chǎn)。β-action和HCV上下游引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列為：β-action1 5’TTCCAGCCTTCCTTCCTGG 3’825 nt～843 nt；β-action2 5’TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT 3’1 029 nt～1 048 nt；HCV-CI1 5’GGTCGCAACCTCGTGGAAGG 3’493 nt～512 nt；HCVCI2 5’ATCGATGACCTTACCCAAAT 3’682 nt～701 nt。

1.2.6 藥物半數(shù)抑制劑量（ID50） 采用MTT 法，處于對數(shù)生長期的SMMC7721肝癌細(xì)胞加生藥或藥物血清處理68 h，每孔MTT 50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入二甲亞砜（遼寧德邁世歐化工有限公司）每孔100 μL，搖勻，于酶標(biāo)儀570 nm波長下測定A 值，計算出半數(shù)抑制劑量（ID50），小柴胡湯為75 mg/mL。

1.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和RNA 提取 重組體PBK-HCV 轉(zhuǎn)染SMMC7721肝癌細(xì)胞，采用FUGENETM6轉(zhuǎn)染試劑[普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司]，嚴(yán)格按說明書操作，在轉(zhuǎn)染后24 h 加入不同生藥濃度（低于抑制細(xì)胞增殖濃度以下取3 個藥物濃度，分別為30 、20 和10 mg/mL）或20%藥物血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用RNA 抽提試劑（Trizol Reagent）提取細(xì)胞總RNA，同時，設(shè)置未加藥對照組。

1.2.8 HCV mRNA 表達(dá) 采用RT-PCR 法測定。采用抽提的RNA 5 μL 作為逆轉(zhuǎn)錄模板，在模板中加入5×RT Buffer 5 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，2 mmol/L dNTP 2 μL，Oligod（T）16100 pmol/L，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶100 U，加雙蒸水至25 μL。41 ℃水浴1 h，煮沸變性10 min。取RT擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，加入10×Buffer 5 μL，2 mmol/L-1dNTP 5 μL，25 mmol/L MgCl 3 μL，βaction 引物或 HCV 引物各 20 pmol/L，TaqDNA 酶 1.5 U，加雙蒸水至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃預(yù)變性1 min，56 ℃預(yù)變性1 min和72 ℃預(yù)變性1 min，共30個循環(huán)，最后72 ℃預(yù)變性延伸5 min[3-4]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“±s”表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物對小鼠免疫功能的影響 藥物組T淋巴細(xì)胞增殖較對照組顯著增高，T 細(xì)胞亞群比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 小柴胡湯對ICR小鼠免疫功能的影響（±s）Table 1 Effect of Xiaochaihu Decoction on immune function in ICR mice(±s)

表1 小柴胡湯對ICR小鼠免疫功能的影響（±s）Table 1 Effect of Xiaochaihu Decoction on immune function in ICR mice(±s)

組別對照組（n=20）藥物組（n=20）t值P值A(chǔ)570 nm 0.362±0.16 0.798±0.15 1.98＜0.05 L3T4＋34.46±0.87 35.22±1.04 0.56＞0.05 Lyt2＋28.56±0.71 28.96±1.18 0.29＞0.05 L3T4＋/Lyt2＋1.21±0.1 1.22±0.11 0.07＞0.05

2.2 RT-PCR 結(jié)果分析 2%瓊脂糖凝膠電泳可見224 bp 的β-action條帶及209 bp的PBK-HCV的條帶，加藥組與未加藥組均可見2條條帶。采用IS-1000多功能凝膠成像儀處理，以HCV-C/β-action表示HCV-mRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示，加藥組與未加藥組HCV-mRNA表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

丙型肝炎是病毒性肝炎的一種，是一種由HCV感染引起的病毒性肝炎。丙型肝炎的傳播途徑與乙型肝炎相似，也是經(jīng)血傳播。但是丙型肝炎患者血中的病毒量較少，傳染性低于乙肝。丙型肝炎是全球性傳染病，在我國也普遍存在，HCV感染后80%～85%患者可發(fā)展為慢性肝炎，約20%發(fā)展為肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌（HCC）[5]。丙型肝炎病毒HCV 感染的顯著臨床特點(diǎn)為慢性化發(fā)生率高，除約20%的急性感染者可自發(fā)清除HCV 外，絕大多數(shù)都將發(fā)展為慢性持續(xù)性感染，并最終進(jìn)展為肝硬化和肝癌[6]。

目前尚無治療病毒性肝炎的特效方法。大量用重組干擾素治療，費(fèi)用高且療效不佳。中醫(yī)中藥治療成為丙型肝炎治療研究的熱點(diǎn)。丙型肝炎具有傳染性及潛伏期，其病因?yàn)闈駸嵋叨舅?，類似于中醫(yī)濕溫病的范疇，但臨床以神疲乏力、納差為主訴者多見且以脾虛證為主，又類似于中醫(yī)的內(nèi)傷脾胃雜癥[7]。有關(guān)本病辨證論治的報道較乙型肝炎少，早期分型也不統(tǒng)一，分為 2 型、4 型、5 型、6 型、8 型等。1990 年上海會議將慢性肝炎分為5型，具有較強(qiáng)的代表性。歸納各分型特點(diǎn)，涉及臟腑有肝、膽、脾、腎，涉及病理有陰虛、陽虛、氣虛、血虛、氣滯、血淤、濕熱、熱毒、寒濕、痰濕等。而臨床中又以濕熱蘊(yùn)結(jié)，郁久不解，淤滯肝絡(luò)，肝脾失調(diào)，氣陰兩虛為最主要病理特性[8]。臨床上丙型肝炎出現(xiàn)某一個典型證型較少見，通常是幾個證型交錯互見，在辨證論治中應(yīng)隨證化裁，不必拘泥于一證一方。小柴胡湯治療病毒性肝炎的療效已為大量臨床應(yīng)用所證實(shí)。現(xiàn)代藥學(xué)研究表明，柴胡具有抗炎作用，可促進(jìn)肝臟蛋白質(zhì)的合成，增加肝糖原，改善高脂血癥，防止脂肪肝的形成[9-10]。本研究結(jié)果顯示，在動物實(shí)驗(yàn)中，小柴胡湯組T淋巴細(xì)胞增殖顯著高于對照組，T細(xì)胞亞群比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。小柴胡湯對SMMC7721細(xì)胞生長的半數(shù)抑制劑量為75 mg/mL，但不能抑制重組體mRNA 表達(dá)。提示小柴胡湯的抗HCV作用不是通過抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄，而主要是通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能發(fā)揮作用。本研究結(jié)果還顯示，小柴胡湯可增強(qiáng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用，不影響正常機(jī)體的T細(xì)胞亞群，具有提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能的作用。

綜上所述，小柴胡湯的抗HCV作用不是通過抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄，而主要是通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能發(fā)揮作用。