李佳璇，趙姍姍，盛尊來,

1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院（哈爾濱 150030）；2. 黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物疾病防控技術(shù)與制劑創(chuàng)制實(shí)驗(yàn)室（哈爾濱 150030）

石榴（Punica granatumL.）是石榴科植物石榴的果實(shí)，原產(chǎn)于波斯一帶，開辟“絲綢之路”的張騫出使西域時(shí)將石榴種子帶回中國并種植，現(xiàn)在主產(chǎn)于江蘇、湖南、湖北、山東等地[1-3]。中國是石榴的第一生產(chǎn)和消費(fèi)國，石榴果實(shí)、果皮、根、花均可入藥[4]。

石榴皮是石榴的干燥果皮，含有許多生物活性成分，如多酚類、黃酮類、有機(jī)酸、生物堿類等[5-9]。石榴皮是中國傳統(tǒng)中藥，有澀腸止瀉、止血驅(qū)蟲的功效，用于治療燒傷燙傷，痢疾，中耳炎、牛皮癬及甲狀腺癌、肝癌等多種癌癥[10-16]。

田口法是日本著名質(zhì)量管理學(xué)家田口玄一博士提出的一種質(zhì)量工程的方法。田口法充分利用系統(tǒng)中存在的非線性效應(yīng)，選擇合適的正交設(shè)計(jì)表安排試驗(yàn)，通過S/N分析和方差分析對測試結(jié)果進(jìn)行分析，通過田口正交試驗(yàn)確定影響因素的重要性和各因素的最佳水平并加以組合，利用誤差模擬干擾因素，設(shè)計(jì)更加科學(xué)，提高效率，降低費(fèi)用[17-19]。單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用田口法優(yōu)化安石榴林、安石榴苷、鞣花酸的提取工藝，為工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)，有助于石榴皮的進(jìn)一步開發(fā)利用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

石榴皮是（哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠）；安石榴林、安石榴苷和鞣花酸對照品（純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所；乙醇（廣州友聯(lián)化工試劑有限公司）；甲酸（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；超純水由Milli-Q Academic超純水系統(tǒng)（自制，Millipore，Bedford，MA，USA）；娃哈哈礦泉水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.2 儀器和設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀（上海沃特世科技有限公司）；Gemini C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Phenomenex分析儀器有限公司）；KAT-8循環(huán)水多用真空泵（無錫中恒儀器廠）；TGL-16G高速臺式離心機(jī)（上海利鑫堅(jiān)離心機(jī)有限公司）；DH6000A電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；BT224S分析天平（深圳明科科技有限公司）。

1.3 色譜條件

高效液相色譜儀器采用2998 PDA檢測器，流動(dòng)相由0.1%甲酸（A）和甲醇（B）組成，梯度洗脫分離程序：0 min（5% B）×8 min（16.3% B）×17 min（20.5% B）×47 min（62.8% B）。流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長377 nm。

通過比較其保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)峰的保留時(shí)間確定石榴皮中的安石榴林、安石榴苷和鞣花酸（見圖1）。表1列出這些標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

圖1 高效液相色譜圖

表1 安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和線性范圍

1.4 安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的提取

將石榴皮（5.00 g）研磨成粉末后過篩，乙醇回流提取。過濾使藥渣與提取液分離，提取液以3 000 r/min離心10 min，用高效液相色譜法測定其含量。

1.5 田口法優(yōu)化提取工藝

在單因素試驗(yàn)條件下，初步確定乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、液料比（D）和粒徑（E）的適宜范圍。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)五因素三水平L27(35)的田口法試驗(yàn)，因素水平表如表2所示。整個(gè)設(shè)計(jì)包括27次試驗(yàn)點(diǎn)，隨機(jī)進(jìn)行。信噪比S/N計(jì)算如式（1）。

式中：n為每個(gè)試驗(yàn)的測量次數(shù)；S/N為信噪比；y為提取率。

表2 田口設(shè)計(jì)的因素和水平

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

用Minitab 17軟件分析田口法的信噪比和方差分析結(jié)果。用圖基法檢驗(yàn)各因素的顯著性（p＜0.05）。

2 結(jié)果和分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響

試驗(yàn)考察溫度40 ℃、時(shí)間1 h、液料比20∶1 mL/g、粒徑0.25 mm、提取次數(shù)1次時(shí)，不同濃度的乙醇（0，20%，40%，60%，80%和100%）對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響。

結(jié)果如圖2A所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)從0升高到20%時(shí)，提取率呈線性下降，而乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí)，提取率保持不變。

這是因?yàn)榘彩窳?、安石榴苷和鞣花酸中含有大量苯基、羥基，易溶于極性溶劑。3種成分在乙醇體積分?jǐn)?shù)0%時(shí)達(dá)到最大值。根據(jù)這一結(jié)果，選擇0～20%乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.2 提取溫度對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響

試驗(yàn)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)0%、時(shí)間1 h、液料比20∶1 mL/g、粒徑0.25 mm、提取次數(shù)1次時(shí)，不同的提取溫度（30，40，50，60，70和80 ℃）對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響。

結(jié)果如圖2B所示，隨著提取溫度升高，安石榴林，安石榴苷和鞣花酸產(chǎn)量先升高后下降，安石榴苷產(chǎn)量在70 ℃達(dá)到最大值，而安石榴林和鞣花酸產(chǎn)量在40 ℃達(dá)到最大值。由于石榴皮中安石榴苷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于安石榴林和鞣花酸，因此，將提取溫度設(shè)定在70 ℃并進(jìn)行下面的田口試驗(yàn)。

2.1.3 提取時(shí)間對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響

試驗(yàn)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)0、提取溫度70 ℃、液料比20∶1 mL/g、粒徑0.25 mm、提取次數(shù)1次時(shí)，不同的提取時(shí)間（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h）對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響。

結(jié)果如圖2C所示，安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的提取率都在提取時(shí)間2.0 h時(shí)達(dá)到最大值，并隨著提取時(shí)間繼續(xù)延長而降低。據(jù)推斷，在這種情況下，3種成分已充分溶解和吸收，可用于臨床。

這是因?yàn)樘崛r(shí)間2.0 h時(shí)，3種酚酸溶解飽和，溶解速率處于平衡狀態(tài)，但隨著提取時(shí)間繼續(xù)增加，酚酸類物質(zhì)可能發(fā)生縮合、降解、氧化或其他化學(xué)反應(yīng)，影響目標(biāo)化合物產(chǎn)率。因此，在1.5～2.0 h范圍內(nèi)確定提取時(shí)間，用田口法進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.4 液料比對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響

試驗(yàn)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)0%、提取時(shí)間2 h、提取溫度70 ℃、粒徑0.25 mm、提取次數(shù)1次時(shí)，不同液料比（10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1和60∶1 mL/g）對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響。

結(jié)果如圖2D所示，隨著液料比從10∶1 mL/g增加到40∶1 mL/g，3種化合物提取率均有所提高，而液料比從40∶1 mL/g增加到60∶1 mL/g，提取率不再繼續(xù)增加。

這是因?yàn)殡S著溶劑體積增加，物料與溶劑的接觸面積增大，濃度增加梯度變大，溶質(zhì)轉(zhuǎn)移的動(dòng)力增大，有利于3種酚酸的溶解。酚酸浸出達(dá)到飽和點(diǎn)時(shí)，產(chǎn)量不再增加，直到達(dá)到一定值時(shí)，產(chǎn)量40 mL/g時(shí)達(dá)到最高水平。與此結(jié)果相對應(yīng)，田口法采用液料比30～50 mL/g進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.5 粒徑對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響

試驗(yàn)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)0%、提取時(shí)間2 h、提取溫度70 ℃、液料比40∶1 mL/g、提取次數(shù)1次時(shí)，不同粒徑對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響。

結(jié)果如圖2E所示，粒徑（0.09～2 mm）對提取效果明顯，提取率隨粒徑減小而升高，在0.125 mm時(shí)提取率達(dá)到最大值。

這可能是因?yàn)楫?dāng)粒徑較小時(shí)，目標(biāo)化合物能更好地從石榴皮粉中分離出來。試驗(yàn)結(jié)果與前期研究一致，表明最佳粒徑為0.09～0.15 mm，并采用田口法進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.6 提取次數(shù)對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響

試驗(yàn)考察在最佳提取條件下（乙醇體積分?jǐn)?shù)0%、提取時(shí)間2 h、提取溫度70 ℃、液料比40∶1 mL/g，粒徑0.125 mm）時(shí)，不同提取次數(shù)（1，2，3和4次）對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響。

結(jié)果如圖2F所示，提取次數(shù)從1次增加到2次時(shí)，提取率明顯提高。但3次提取后，提取率變化不明顯。

圖2 不同提取因素對3種酚酸產(chǎn)率的影響

這是因?yàn)殡S著提取次數(shù)增加，溶液體積明顯增大，會(huì)影響后續(xù)的集中度，造成功率損耗，增加許多不必要的成本。因此，選擇提取2次用于田口法優(yōu)化。

2.2 田口法進(jìn)一步優(yōu)化乙醇回流提取工藝

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Minitab 17，將5個(gè)因素——乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、液料比（D）和粒徑（E），以及3水平——安石榴林（Y1）、安石榴苷（Y2）和鞣花酸（Y3），采用L27(35)田口法中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行研究。田口法試驗(yàn)設(shè)計(jì)和安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的提取率如表3所示。

為探究各個(gè)變量對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的顯著影響，對田口法的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析[20]。p值決定工藝因素是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[21]。設(shè)顯著性p＜0.05，如表4所示，對比F值，乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（B）和粒徑（E）是對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率影響最大的3個(gè)變量。3個(gè)因素對提取率的影響依次為B＞A＞E，R2和調(diào)整后的R2值均接近1，說明提取率模型成立。

為使用信噪比S/N分析這些數(shù)據(jù)，確定最佳提取條件如圖3所示。使用Minitab 17軟件不能簡單地統(tǒng)計(jì)優(yōu)化每個(gè)組分的最大產(chǎn)量。對3個(gè)水平的結(jié)果進(jìn)行綜合比較分析：1）乙醇體積分?jǐn)?shù)。安石榴林和安石榴苷的提取率在水平3達(dá)到最大，鞣花酸的提取率在水平1和水平3基本相同，因此最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)是水平3。2）提取溫度。最大產(chǎn)量安石榴林和鞣花酸的最大提取率均在水平3，但安石榴苷的最大提取率為水平2，由于3種成分中安石榴苷的含量最高，因此最佳提取溫度是水平2。3）提取時(shí)間。鞣花酸的最大提取率在水平2，安石榴林和安石榴苷的提取率在水平2和水平3基本相同，因此最佳提取時(shí)間在水平2。4）液料比。安石榴林、安石榴苷和鞣花酸在水平3的提取率最高，因此最佳液料比為水平3。5）粒徑為水平2，安石榴苷和鞣花酸的最高提取率為水平2，最佳液料比為水平2。6）粒子直徑。安石榴苷和鞣花酸在水平2的提取率最高，因此最佳粒子直徑是水平2。

綜上所述，最佳提取條件為A3B2C2D3E2（乙醇體積分?jǐn)?shù)20%、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2 h，液料比50∶1 mL/g、粒徑0.125 mm、提取次數(shù)2次）。在此條件下，安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的預(yù)測提取率分別為17.94，497.44和7.26 mg/g。在最優(yōu)化條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證性試驗(yàn)。結(jié)果見表5，3次試驗(yàn)平均提取率分別為安石榴林17.89±0.27 mg/g，安石榴苷498.66±2.13 mg/g和鞣花酸7.30±0.05 mg/g，與預(yù)測值基本一致，說明工藝優(yōu)化合理可行。

表3 田口試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)的安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率

表4 方差分析（ANOVA）

表5 優(yōu)化條件下的驗(yàn)證性試驗(yàn)

圖3 不同水平田口試驗(yàn)設(shè)計(jì)對3種酚酸提取率的影響信噪比均數(shù)分析圖

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用田口法得到提取石榴皮中安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)20%、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2 h、液料比50∶1 mL/g、粒徑0.125 mm，提取次數(shù)2次。結(jié)果表明，采用田口法建立的提取優(yōu)工藝模型合理，方法可行，可用于批量生產(chǎn)。