董彩文 ，王浩瑾，駱怡萍，蔣雅楠，楊曉磊 ，胡曉龍 *

1. 鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（鄭州 450002）；2. 河南省食品生產(chǎn)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心（鄭州 450002）；3. 鄭州輕工業(yè)學(xué)院校醫(yī)院（鄭州 450002）；4. 長(zhǎng)葛市頤恒健蜂業(yè)有限公司（長(zhǎng)葛 461502）；5. 許昌市蜂蜜發(fā)酵工程技術(shù)研究中心（長(zhǎng)葛 461502）

高級(jí)醇主要包括異戊醇、異丁醇等[1]，在釀酒過(guò)程中產(chǎn)生。適量的高級(jí)醇在酒中能夠產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味，如果量很低則酒的風(fēng)味單薄。在存放過(guò)程中，高級(jí)醇能夠轉(zhuǎn)化變成酯類(lèi)，從而使酒體呈現(xiàn)特殊的陳香。如果高級(jí)醇含量過(guò)高時(shí)則會(huì)危害人體健康。因此，對(duì)于酒中的高級(jí)醇含量應(yīng)該采取一定的措施進(jìn)行控制。除了篩選低產(chǎn)高級(jí)醇的酵母品種以外[2]，改變發(fā)酵條件也會(huì)影響高級(jí)醇的產(chǎn)生[3-7]。

試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定發(fā)酵溫度、發(fā)酵液pH、酵母添加量、發(fā)酵時(shí)間、磷酸氫二銨添加量、發(fā)酵液初始糖度等因素對(duì)高級(jí)醇生成的影響，然后經(jīng)過(guò)響應(yīng)面分析得到高級(jí)醇最低生成值，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，進(jìn)而達(dá)到通過(guò)控制發(fā)酵工藝降低高級(jí)醇生成的目的。

1 材料與方法

1.1 主要材料

棗花蜜（河南省長(zhǎng)葛市）；蘇-16麥曲（江蘇?。?；高活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）。

HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫(yī)療機(jī)械廠；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LX-C35L型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV9100全自動(dòng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)Lab Tech公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 測(cè)定方法

1.2.2.1 高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

參照文獻(xiàn)[8]方法，分別取不同量的高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)使用液，與0.5%對(duì)二甲氨基苯甲醛濃硫酸溶液反應(yīng)，產(chǎn)物于520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.2.2 樣品中高級(jí)醇的測(cè)定

參考標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的步驟，餾出液取0.5 mL。然后由回歸方程計(jì)算出樣品的高級(jí)醇含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 發(fā)酵溫度對(duì)高級(jí)醇生成的影響

取適量蜂蜜和蒸餾水配制2 500 mL糖度為16%的蜜液，調(diào)節(jié)pH至4.0。80 ℃水浴20 min，取出冷卻。在超凈工作臺(tái)中將蜜液依次倒入10個(gè)錐形瓶中，每瓶250 mL。然后依次加入麥曲10 g，高活性干酵母0.5 g，搖勻。分別在24，26，28，30和32 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。每個(gè)溫度做2瓶樣品，作為平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后離心，取上清液蒸餾，進(jìn)行高級(jí)醇的測(cè)定。

1.2.3.2 酵母添加量對(duì)高級(jí)醇生成的影響

取適量蜂蜜和蒸餾水配制2 500 mL糖度為16%的蜜液，調(diào)節(jié)pH至4.5。80 ℃水浴鍋中20 min，取出冷卻。在超凈工作臺(tái)中將蜜液依次倒入10個(gè)錐形瓶中，每瓶250 mL。然后加入麥曲10 g，依次加入高活性干酵母0.25，0.50，0.75，1.00和1.25 g，放入30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。每種酵母添加量做2瓶樣品，作為平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后離心，取上清液蒸餾，進(jìn)行高級(jí)醇的測(cè)定。

1.2.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)高級(jí)醇生成的影響

取適量蜂蜜和蒸餾水配制2 500 mL糖度為22%的蜜液，調(diào)節(jié)pH至4.5。80 ℃水浴20 min，取出冷卻。在超凈工作臺(tái)中將蜜液依次倒入10個(gè)錐形瓶中，每瓶250 mL。然后依次加入麥曲10 g，高活性干酵母0.5 g，放入30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間依次為3，4，5，6和7 d。每個(gè)發(fā)酵時(shí)間做2瓶樣品，作為平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后離心，取上清液蒸餾，進(jìn)行高級(jí)醇的測(cè)定。

1.2.3.4 磷酸氫二銨添加量對(duì)高級(jí)醇生成的影響

取適量蜂蜜和蒸餾水配制2 500 mL糖度為22%的蜂蜜液，調(diào)節(jié)pH至4.5。80 ℃水浴20 min，取出冷卻。在超凈工作臺(tái)中將蜜液依次倒入10個(gè)錐形瓶中，每瓶250 mL。磷酸氫二銨加入量分別為300，600，900，1 200和1 500 mg/L，麥曲10 g，高活性干酵母0.5 g，放入30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。每個(gè)磷酸氫二銨添加量做2瓶樣品，作為平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后離心，取上清液蒸餾，進(jìn)行高級(jí)醇的測(cè)定。

1.2.3.5 發(fā)酵液糖度對(duì)高級(jí)醇生成的影響

取適量蜂蜜和蒸餾水配制糖度分別為16%，20%，24%，28%和32%的蜜液，每瓶250 mL，調(diào)節(jié)pH至4.5。80 ℃水浴20 min，取出冷卻。然后依次加入磷酸氫二銨900 mg/L（225 mg），麥曲10 g，高活性干酵母0.5 g，放入30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。每個(gè)糖度做2瓶樣品，作為平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后離心，取上清液蒸餾，進(jìn)行高級(jí)醇的測(cè)定。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在分別考察了單個(gè)因素對(duì)蜂蜜發(fā)酵過(guò)程中高級(jí)醇的影響后，選取3個(gè)對(duì)高級(jí)醇生成影響較大的因素，然后在每個(gè)因素方向選取3個(gè)數(shù)值進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，如表1所示。

表1 試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

以上試驗(yàn)均平行重復(fù)2次，用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性檢驗(yàn)，用不同的小寫(xiě)字母表示2個(gè)變量之間的顯著關(guān)系，相同的小寫(xiě)字母表示2個(gè)變量之間的關(guān)系不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

按照高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的步驟得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。得到方程為y=0.003 7x+0.009，R2=0.989 3，線(xiàn)性較好，符合要求。

圖1 高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)高級(jí)醇生成的影響結(jié)果

溫度是發(fā)酵過(guò)程中的重要因素。因此溫度對(duì)發(fā)酵有一定影響[9]。由圖2可知，隨著溫度升高，高級(jí)醇的生成量隨溫度升高而上升，在28 ℃達(dá)到最大，然后開(kāi)始下降?？紤]到溫度低時(shí)發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，溫度高時(shí)易引起雜菌生長(zhǎng)，初步選擇發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)高級(jí)醇的影響

2.1.3 酵母添加量對(duì)高級(jí)醇生成的影響結(jié)果

發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌的數(shù)量與發(fā)酵力的大小相對(duì)應(yīng)。圖3表明，隨著酵母添加量的增加，高級(jí)醇的生成量隨著升高，然后趨于緩慢變化。初步選定酵母添加量為0.5 g。

圖3 酵母添加量對(duì)高級(jí)醇的影響

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)高級(jí)醇生成的影響的結(jié)果

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間增長(zhǎng)，高級(jí)醇的量剛開(kāi)始變化不大，第5天以后隨發(fā)酵時(shí)間增長(zhǎng)高級(jí)醇的生成量開(kāi)始上升。發(fā)酵時(shí)間初步選為5 d。

2.1.5 磷酸氫二銨添加量對(duì)高級(jí)醇生成的影響的結(jié)果

發(fā)酵液中氮源過(guò)多容易造成酵母菌的生長(zhǎng)太快，反而不利于產(chǎn)物的積累。當(dāng)?shù)床蛔銜r(shí)，菌體的生長(zhǎng)緩慢，在穩(wěn)定期會(huì)引起菌體自溶。因此控制適宜的氮源，既能促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，又有利于產(chǎn)物的積累。圖5表明，磷酸氫二銨濃度的變化對(duì)高級(jí)醇的生成影響不明顯。所以磷酸氫二銨質(zhì)量濃度初步選為900 mg/L。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)高級(jí)醇的影響

圖5 磷酸氫二銨添加量對(duì)高級(jí)醇的影響

2.1.6 糖度對(duì)高級(jí)醇生成的影響的結(jié)果

當(dāng)發(fā)酵液中糖度過(guò)高時(shí)，不僅會(huì)抑制乙醇產(chǎn)生途徑中乙醇脫氫酶的活性而影響發(fā)酵，不利于酒精產(chǎn)物的積累；而且會(huì)造成高滲透壓環(huán)境而抑制酵母的生長(zhǎng)。發(fā)酵液糖度過(guò)低又會(huì)減緩酵母生長(zhǎng)，導(dǎo)致發(fā)酵不能正常進(jìn)行[10]。由圖6可知，剛開(kāi)始高級(jí)醇的生成量隨著發(fā)酵液糖度的升高逐漸上升，發(fā)酵液糖度為24%時(shí)，高級(jí)醇的生成量最高；之后隨發(fā)酵液糖度升高而降低?？紤]到低糖度下產(chǎn)生酒精度較低，發(fā)酵液糖度的可選28%～30%。

圖6 發(fā)酵液糖度對(duì)高級(jí)醇的影響

2.2 高級(jí)醇響應(yīng)面優(yōu)化的結(jié)果

2.2.1 高級(jí)醇回歸模型的建立和顯著性檢驗(yàn)

由響應(yīng)面分析得到17組優(yōu)化試驗(yàn)的方案，每組做2次平行試驗(yàn)后得到試驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

經(jīng)響應(yīng)面軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到回歸方程：高級(jí)醇=+78.69-10.51A-13.01B+2.53C-5.24AB+4.61AC+ 5.84BC-7.45A2-7.19B2-3.22C2。方程中每項(xiàng)前系數(shù)的正負(fù)性可以表明其多Y值的影響是正相關(guān)還是負(fù)相關(guān)。

由表3可知，回歸方程方程相關(guān)系數(shù)R2=0.809 4，表明約有80.94%的高級(jí)醇變化可由此模型解釋。對(duì)糖度、溫度、時(shí)間分別進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)糖度p＜0.05，溫度p＜0.01，說(shuō)明糖度和溫度對(duì)酒精度的影響分別是顯著和高度顯著的。而時(shí)間p=0.533 6＞0.05，說(shuō)明時(shí)間對(duì)酒精度影響不顯著。綜上所述，回歸方程給酒精度提供了一個(gè)合適的模型。

表3 回歸方程方差分析結(jié)果

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

響應(yīng)面優(yōu)化分析結(jié)果顯示，當(dāng)發(fā)酵液初始糖度為32.0%，發(fā)酵溫度為34.0 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為4.0 d的時(shí)候能夠得到高級(jí)醇的理論最低值為44.24 mg/L。為了驗(yàn)證該模型給出的方案是否與實(shí)際情況相符合，課題進(jìn)行兩次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。發(fā)酵條件為發(fā)酵液初始糖度為32.0%，發(fā)酵溫度為34 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為4 d，由此得高級(jí)醇含量為44.19 mg/L，實(shí)際測(cè)定值與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.11%，說(shuō)明響應(yīng)面模型能較好的反應(yīng)實(shí)際情況。在響應(yīng)面試驗(yàn)15中，當(dāng)發(fā)酵液糖度為30.0%，發(fā)酵溫度為34 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為4 d時(shí)，得到的發(fā)酵液高級(jí)醇含量為43.72 mg/L。所以最適發(fā)酵條件為發(fā)酵液糖度為30.0%，發(fā)酵溫度為34 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為4 d時(shí)，能得到高級(jí)醇的最低值。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面對(duì)蜂蜜發(fā)酵中高級(jí)醇的生成條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，高級(jí)醇的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為麥曲添加量4%（10 g），酵母添加量0.2%（0.5 g），磷酸氫二銨添加量600 mg/L（150 mg），發(fā)酵液初始糖度為30.0%，pH為4.5，發(fā)酵溫度為34 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為4 d時(shí)，能得到高級(jí)醇的最低值43.72 mg/L。此條件下，發(fā)酵液的酒精度為10.1%。