馬英輝 李利軍 盧美歡 仝澤方 吳文朋

(1.陜西省微生物研究所,陜西 西安 710043；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北植物營養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊陵 712100)

木質(zhì)素是由愈創(chuàng)木基、紫丁香基和對(duì)羥基苯丙烷3種單體通過醚鍵和碳碳鍵構(gòu)成的有機(jī)聚合物，是構(gòu)成木質(zhì)纖維素的主要組分之一，在植物抵御外界入侵的過程中起到重要作用。由于木質(zhì)素的難降解性，造成了木質(zhì)纖維素資源不能得到充分利用[1]、造紙過程中形成大量的黑液[2]等問題。微生物對(duì)木質(zhì)素的降解一直是國內(nèi)外研究人員持續(xù)研究的熱點(diǎn)，以往對(duì)木質(zhì)素降解的研究主要集中在白腐真菌上[3]，而由于細(xì)菌生長快速、易于大規(guī)模培養(yǎng)以及多底物利用等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)菌對(duì)木質(zhì)素的降解也被廣泛關(guān)注[4]。目前，已有很多文獻(xiàn)研究了細(xì)菌對(duì)木質(zhì)素的降解，主要涉及鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)[5]、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)[6]、嗜熱菌(Bacillusthermophilus)[7]、叢毛單胞菌(Comamonassp.)[8]、根瘤菌(Rhizobiumsp.)[9]等。

伯克霍爾德菌(Burkholderiasp.)是一種廣泛存在于水、土壤、植物和人體中的革蘭氏陰性細(xì)菌，其在環(huán)境污染物處理中的作用已有報(bào)道[10]。先前的研究已證實(shí)伯克霍爾德菌存在胞內(nèi)類漆酶基因[11]751，但其對(duì)木質(zhì)素的降解特性研究仍相對(duì)較少。本研究通過苯胺藍(lán)和堿性木質(zhì)素平板從陜西省某造紙廠污水底泥中篩選一株伯克霍爾德菌(記為菌株BNS)，利用Biolog和16S rRNA對(duì)菌株BNS進(jìn)行鑒定，并對(duì)其木質(zhì)素降解特性進(jìn)行研究，結(jié)果對(duì)于闡明伯克霍爾德菌降解木質(zhì)素的代謝途徑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種來源

從陜西省某造紙廠污水中過濾提取一定底泥用冰盒冷藏，通過苯胺藍(lán)、堿性木質(zhì)素平板法從底泥中富集篩選獲得一株木質(zhì)素降解菌，記為菌株BNS。

1.1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽(MM)培養(yǎng)基：NH4NO32 g，KH2PO40.5 g，Na2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，微量元素液2 mL，制霉菌素(純度≥98%)0.1 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.0。微量元素液：FeSO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·H2O 0.15 g，ZnSO40.14 g，CoCl20.2 g，去離子水定容至1 000 mL。

種子培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基。

無特殊說明，所用試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器

DHP-300型恒溫培養(yǎng)箱，DHZ-DA型恒溫?fù)u床，ABI 2720型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀，UV9001型紫外分光光度計(jì)，6700F型電子掃描顯微鏡(SEM)，ALPHA型紅外光譜(IR)儀，TGL-18MS冷凍離心機(jī)，7890B-7010B型氣相色譜(GC)/質(zhì)譜(MS)聯(lián)用儀，全自動(dòng)微生物鑒定儀(美國Biolog)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株BNS的生理生化及分子鑒定

將提取的菌株BNS接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min下?lián)u瓶活化12 h，得到菌株BNS種子液。取10 mL種子液，在12 000 r/min離心5 min，用無菌去離子水沖洗3次，根據(jù)全自動(dòng)微生物鑒定儀的要求制備IF-A菌懸液。IF-A菌懸液濁度控制在90%～98%，利用8排自動(dòng)移液器加入到GenⅢ96孔板中，每孔加入120 μL，30 ℃下靜置培養(yǎng)24 h，用于菌株BNS碳源與化學(xué)因子代謝的讀板分析。

利用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒對(duì)菌株BNS進(jìn)行DNA提取，采用16S rRNA通用引物(5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min；4 ℃終止反應(yīng))，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)中進(jìn)行Blast序列比對(duì)后，利用MAGE 5.0軟件采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 菌株BNS降解堿性木質(zhì)素的影響因素分析

將菌株BNS種子液按0.5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)接入含1 000 mg/L堿性木質(zhì)素的MM培養(yǎng)基中，160 r/min、35 ℃搖床培養(yǎng)60 h。培養(yǎng)過程中，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度(20、25、30、35、40、45 ℃)、pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)及添加金屬離子(Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+，添加量均為0.5 mmol/L)，測定堿性木質(zhì)素降解率變化，分析各因素對(duì)菌株BNS降解堿性木質(zhì)素的影響。

1.2.3 菌株BNS降解堿性木質(zhì)素的動(dòng)力學(xué)研究

向MM培養(yǎng)基中分別加入堿性木質(zhì)素100、500、1 000、2 000 mg/L，接入0.5%菌株BNS種子液，在pH 9.0、30 ℃、160 r/min下?lián)u床培養(yǎng)84 h，每隔6 h進(jìn)行堿性木質(zhì)素降解率的測定。

采用一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)對(duì)降解數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合[12]，計(jì)算見式(1)：

lnSt=-Ks×t+lnS0

(1)

式中：St為t時(shí)刻堿性木質(zhì)素的質(zhì)量濃度，mg/L；Ks為一級(jí)降解速率常數(shù)，h-1；t為降解時(shí)間，h；S0為堿性木質(zhì)素的初始質(zhì)量濃度，mg/L。

1.2.4 菌株BNS降解堿性木質(zhì)素的產(chǎn)物分析

對(duì)于堿性木質(zhì)素為1 000 mg/L的降解體系，分別在培養(yǎng)24、48、72 h取10 mL培養(yǎng)液，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清液用6 mol/L的鹽酸調(diào)pH為2.0，用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，加入無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至0.5 mL，加入0.1 mL的N,O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺，60 ℃水浴30 min后用于GC/MS檢測分析。GC參數(shù)：DB-5氣相色譜柱，載氣為高純氮?dú)?，恒?.0 mL/min，進(jìn)樣體積為1.0 μL，升溫程序?yàn)?0 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至160 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，以15 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。MS參數(shù)：電子轟擊(EI)電離源，電子能量為70 eV，離子源溫度230 ℃，連接桿溫度150 ℃，掃描方式為全掃描。

1.3 檢測方法

生物量采用烘干法測定，以每升培養(yǎng)液中生物干質(zhì)量計(jì)。采用SEM及IR對(duì)菌株BNS降解前后堿性木質(zhì)素的表面結(jié)構(gòu)及官能團(tuán)變化進(jìn)行檢測分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株BNS的遺傳鑒定

以菌株BNS總DNA為模板，采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測序后獲得1 394個(gè)堿基，并在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，該菌株16S rRNA序列與洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)相似性達(dá)到98%，并根據(jù)菌株同源性，選擇了部分模式菌株進(jìn)行基于16S rRNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。由圖1可見，菌株BNS與洋蔥伯克霍爾德菌ATCC 25416進(jìn)化距離接近，并將該菌株提交GenBank，登錄號(hào)為KY681449.1。根據(jù)全自動(dòng)微生物鑒定儀的讀板分析結(jié)果，菌株BNS底物廣泛，能夠利用多種常規(guī)碳源和有機(jī)酸進(jìn)行生長，且對(duì)潔霉素、四環(huán)素、利福霉素、萬古霉素以及NaCl等表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐受性，在惡劣環(huán)境下具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

2.2 菌株BNS降解堿性木質(zhì)素的影響因素

溫度、pH、金屬離子對(duì)菌株BNS降解堿性木質(zhì)素的影響見圖2。從圖2可以看出，溫度、pH對(duì)菌株BNS降解堿性木質(zhì)素的影響較大，而添加金屬離子對(duì)菌株BNS降解堿性木質(zhì)素的影響相對(duì)較小，這是因?yàn)闇囟?、pH主要影響菌株自身的生長情況，而金屬離子影響的是菌株相關(guān)代謝產(chǎn)物的形成及活性[13-14]。由圖2(a)可知，在溫度為30～40 ℃時(shí)，堿性木質(zhì)素的降解率基本保持穩(wěn)定，30 ℃時(shí)降解率最高，為52.30%。由圖2(b)可知，在pH為6.0～10.0時(shí)，堿性木質(zhì)素降解率差異不明顯，說明該pH環(huán)境適宜菌株BNS生長，其中pH為9.0時(shí)堿性木質(zhì)素降解率最高，為53.88%。在微生物降解體系中加入適量金屬離子能夠顯著增加相關(guān)酶的活力[15-16]，由圖2(c)可知，本次研究中0.5 mmol/L的Cu2+、Fe2+都能提高菌株BNS對(duì)堿性木質(zhì)素的降解率，其中Cu2+可使堿性木質(zhì)素降解率提高近7.0百分點(diǎn)，這是因?yàn)镃u2+能夠提高菌株BNS中的漆酶活性[11]752，同理Fe2+也可能增強(qiáng)某種木質(zhì)素降解酶活性從而提高了菌株BNS對(duì)堿性木質(zhì)素的降解。

2.3 菌株BNS降解堿性木質(zhì)素的動(dòng)力學(xué)

堿性木質(zhì)素初始質(zhì)量濃度分別為100、500、1 000、2 000 mg/L時(shí)，菌株BNS連續(xù)培養(yǎng)84 h的堿性木質(zhì)素降解率變化見圖3。由圖3可知，堿性木質(zhì)素的降解率隨著底物初始濃度的增大而降低，且初始濃度越低，菌株生長的適應(yīng)期越短，降解率達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間越短，這與汪旭暉等[17]采用Logistic模型擬合的氨氮降解動(dòng)力學(xué)相同。初始質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)，堿性木質(zhì)素在48 h降解率趨于穩(wěn)定，達(dá)到78.7%；初始質(zhì)量濃度為500、1 000 mg/L時(shí)，堿性木質(zhì)素在60 h降解率趨于穩(wěn)定，分別為63.1%、47.2%；初始質(zhì)量濃度為2 000 mg/L時(shí)，堿性木質(zhì)素降解率一直處于緩慢上升的趨勢，84 h時(shí)降解率為39.26%。

對(duì)堿性木質(zhì)素的降解過程進(jìn)行一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合，結(jié)果見表1。堿性木質(zhì)素初始質(zhì)量濃度為100、500、1 000、2 000 mg/L時(shí)，擬合模型的相關(guān)性系數(shù)分別0.937 2、0.939 0、0.915 2、0.975 9，擬合程度較好，說明菌株BNS對(duì)100～2 000 mg/L堿性木質(zhì)素的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，降解速率常數(shù)分別為0.027 3、0.016 6、0.010 6、0.006 5 h-1，菌株BNS對(duì)堿性木質(zhì)素的降解速率隨著底物初始濃度的增大而減小。

2.4 堿性木質(zhì)素的SEM和IR分析

菌株BNS降解前后堿性木質(zhì)素的微觀形貌見圖4。可以看出，降解前堿性木質(zhì)素結(jié)構(gòu)比較致密，表面呈聚合狀態(tài)，而經(jīng)過菌株BNS降解后，堿性木質(zhì)素表面結(jié)構(gòu)崩解斷裂，呈疏松的顆粒狀。對(duì)比可知，菌株BNS能夠?qū)A性木質(zhì)素進(jìn)行解聚，破壞其結(jié)構(gòu)，裂解成顆粒狀，這與張佩佩等[18]采用ComamonasserinivoransC35菌株降解木質(zhì)素獲得了類似的外觀效果。

圖1 菌株BNS 16S rRNA序列進(jìn)化關(guān)系Fig.1 16S rRNA sequence evolution of strain

圖2 溫度、pH、金屬離子對(duì)菌株BNS降解木質(zhì)素的影響Fig.2 Effect of temperature,pH and metal ions on the degradation of lignin by strain BNS

圖3 菌株BNS對(duì)不同初始質(zhì)量濃度堿性木質(zhì)素的降解效果Fig.3 Degradation rates of alkaline lignin with different initial mass concentration by strain BNS

表1 菌株BNS對(duì)堿性木質(zhì)素降解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

圖4 堿性木質(zhì)素樣品SEM圖(×700倍)Fig.4 SEM photos of alkaline lignin samples

由圖5可知，堿性木質(zhì)素經(jīng)過菌株BNS降解后，1 750、850 cm-1附近處有基團(tuán)增加，1 560、1 400、1 340、1 100、1 050 cm-1處的基團(tuán)明顯減少，說明在菌株BNS的作用下，堿性木質(zhì)素苯環(huán)骨架間的C=O、C—H、C—O—C鍵明顯減少，苯環(huán)骨架的特征振動(dòng)區(qū)域(1 400～1 600 cm-1)也明顯減弱，苯環(huán)結(jié)構(gòu)和以及一些側(cè)鏈基團(tuán)在降解過程中產(chǎn)生了一些變化和修飾[19]。另外，由于苯環(huán)骨架的開環(huán)，產(chǎn)物中增加了非共軛的羰基、酮基以及苯環(huán)之外的C—H基團(tuán)，也使得產(chǎn)物的反應(yīng)活性進(jìn)一步提高，有利于產(chǎn)物進(jìn)一步降解。

圖5 降解前后堿性木質(zhì)素的IR對(duì)比Fig.5 The IR spectrum of sodium lignosulfonate before and after degradation

2.5 堿性木質(zhì)素降解中間產(chǎn)物分析

利用GC/MS對(duì)堿性木質(zhì)素降解產(chǎn)物進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。在菌株BNS的作用下，堿性木質(zhì)素由于解聚降解產(chǎn)生多種特征中間產(chǎn)物，隨著降解的進(jìn)行，中間產(chǎn)物逐漸被進(jìn)一步降解產(chǎn)生了更小分子的物質(zhì)。低分子量的醛和有機(jī)酸(香草醛、松伯醛、阿魏酸、香草酸等)等中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，表明木質(zhì)素β-芳基醚鍵和苯環(huán)間碳碳鍵的斷裂[20]，乙氧基的產(chǎn)生表明堿性木質(zhì)素受到菌株過氧化物酶系的作用[21]。

表2 堿性木質(zhì)素降解過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物1)

3 結(jié) 論

(1) 菌株BNS屬于伯克霍爾德氏菌屬，與洋蔥伯克霍爾德菌16S rRNA序列高度相似，屬于洋蔥伯克霍爾德菌或其亞種。

(2) 菌株BNS對(duì)堿性木質(zhì)素的最佳降解溫度為30 ℃、最佳pH為9.0，堿性木質(zhì)素降解率最高可達(dá)53.88%，0.5 mmol/L的Cu2+、Fe2+能夠提高菌株BNS對(duì)堿性木質(zhì)素的降解；菌株BNS對(duì)100～2 000 mg/L堿性木質(zhì)素的降解過程符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，降解常數(shù)在0.006 5～0.027 3 h-1。

(3) 菌株BNS通過自身的過氧化物酶系將堿性木質(zhì)素的聚合結(jié)構(gòu)裂解，降解主要發(fā)生在苯環(huán)間的C—C、C—O—C等部位，最終降解產(chǎn)物主要為醛類和有機(jī)酸類。