劉一鵬 喬永明 朱保玉 王海業(yè) 耿玉東 張月蘭

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是全球常見的高度致死性癌癥，這歸因于其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1]。盡管已觀察到OSCC的治療持續(xù)改善，但患者的存活率并未顯著提高[2]。為了提高口腔癌患者的生存率，重要的是了解口腔腫瘤發(fā)生的分子機制。Manikandan M等[3]通過高通量測序描繪了OSCC的miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)了許多表達異常的miRNA，包括miR-29b,miR-142-3p,miR-144,miR-3122。然而，miR-3122在OSCC中的生物學功能尚不明確?；诖耍狙芯恳钥谇击[癌細胞GNM為研究對象，旨在探討miR-3122靶向CMTM5調(diào)控口腔鱗癌細胞GNM凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

口腔鱗癌細胞GNM購自廣州一科生物科技有限公司(貨號：CL-0086)。GCSAM,PSMC4,SKP1,LIAS,SMAD2,ZNF704,CMTM5,STK17A,YWHAQ的siRNA、CMTM5過表達質(zhì)粒、miR-3122 mimics和miR-3122 inhibitor均由天津擎科合成。CMTM5抗體購自上海群己生物科技有限公司(貨號：H00116173-B01)。GAPDH抗體購自武漢市武昌區(qū)科邁實驗用品經(jīng)營部(貨號：KF703)。Annexin V-PE凋亡檢測試劑盒購自廣州威佳科技有限公司(貨號：C1065L)。TRIzol試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司(貨號：B610409-0100)。pEZX-MT01質(zhì)粒購自BioVector質(zhì)粒載體菌種細胞基因保藏中心(貨號：pEZX-MT01)。熒光素酶標記試劑盒購自廣州一科生物科技有限公司(貨號：A1001-8)。BCA蛋白定量試劑盒購自北京邁瑞達科技有限公司(貨號：M052460-500T)。Lipofectamine?2000購自廣州泰勒生物科技有限公司(貨號：11668-019)。青鏈霉素混合液(100×)購自上海億言生物科技有限公司(貨號：SL6040-100ml)。第一鏈cDNA合成試劑盒購自北京蘭博利德商貿(mào)有限公司(貨號：C1802)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 口腔鱗癌細胞GNM在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加10%胎牛血清，青霉素100 U/ml，鏈霉素0.1 mg/ml，37 ℃，100%空氣。GNM細胞以2×105/孔的密度接種于6孔板，用于轉(zhuǎn)染。使用Lipofectamine?2000進行GCSAM,PSMC4,SKP1,LIAS,SMAD2,ZNF704,CMTM5,STK17A,YWHAQ的siRNA、CMTM5過表達質(zhì)粒、miR-3122 mimics和miR-3122 inhibitor的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h進行下游實驗。

1.2.2 RNA抽取與實時熒光定量PCR 納入2018年6月至2020年6月我院收治的口腔鱗癌患者60例，收集此60例患者的口腔鱗癌組織和癌旁組織。采用qRT-PCR檢測基因表達。使用TRIzol試劑提取組織或細胞的總RNA，并使用第一鏈cDNA合成試劑盒根據(jù)生產(chǎn)協(xié)議進行逆轉(zhuǎn)錄。在ABI 7500系統(tǒng)上進行qRT-PCR，條件為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s(40次循環(huán));60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參對照，計算基因的相對表達量。每個樣本檢測3次。

1.2.3 免疫印跡 收集細胞裂解液后，用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。等數(shù)量的蛋白用10% sds-聚丙烯酰胺凝膠分離電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，以抗GINS2抗體為一抗，抗GAPDH抗體為內(nèi)參，4 ℃孵育過夜。隨后，膜與適當?shù)亩狗跤谑覝叵? h。用化學發(fā)光基質(zhì)試劑盒對信號進行成像，用凝膠成像系統(tǒng)檢測。Western blotting實驗進行了3個重復(fù)。

1.2.4 熒光素酶報告實驗 熒光素酶報告質(zhì)粒pEZX-MT01包含CMTM5的野生型或突變型3'UTR。使用熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析熒光素酶活性前，將miR-3122 mimic或陰性對照(NC)和熒光素酶報告基因共轉(zhuǎn)染至口腔鱗癌細胞GNM。

1.2.5 細胞凋亡水平的檢測 根據(jù)制造商的說明，使用Annexin V-PE凋亡檢測試劑盒對不同處理的細胞進行凋亡分析。簡而言之，經(jīng)過不同處理后，收集在6孔板上生長的漂浮口腔鱗癌細胞GNM和胰蛋白酶分離的細胞，并用冷的1×PBS洗滌。然后將細胞沉淀物用結(jié)合緩沖液重懸，并根據(jù)試劑盒方案用Annexin-V染色。熒光顯微鏡觀察。將實驗組中凋亡細胞的百分比與對照轉(zhuǎn)染組進行比較。所有樣品一式三份測量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 miR-3122在口腔鱗癌組織和癌旁組織中的表達

收集60例口腔鱗癌組織和癌旁組織后，通過RNA抽取和實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，miR-3122在癌旁組織中的表達水平高于口腔鱗癌組織(P<0.05)，見圖1。

圖1 miR-3122在口腔鱗癌組織和癌旁組織中的表達

2.2 miR-3122促進口腔鱗癌細胞GNM的凋亡

使用miR-3122 mimics過表達miR-3122后，口腔鱗癌細胞GNM的凋亡水平上升(P<0.05)，而使用miR-3122 inhibitor敲低miR-3122后，口腔鱗癌細胞GNM的凋亡水平下降(P<0.05)，見圖2。

圖2 miR-3122對口腔鱗癌細胞GNM凋亡的影響

2.3 miR-3122靶向CMTM5的3端非編碼區(qū)

TargetScan、miRcode、miRDB在線分析發(fā)現(xiàn)miR-3122分別潛在靶向69、82、184個基因，通過取三者交集發(fā)現(xiàn)miR-3122共同潛在靶向22個基因，見圖3A。使用miR-3122 mimics過表達miR-3122后，口腔鱗癌細胞GNM中GCSAM,PSMC4,SKP1,LIAS,SMAD2,ZNF704,CMTM5,STK17A,YWHAQ的表達水平下降(P<0.05)，見圖3B。使用siRNA敲低口腔鱗癌細胞GNM中上述基因后，發(fā)現(xiàn)敲低CMTM5后口腔鱗癌細胞GNM的凋亡水平上升(P<0.05)，見圖3C。通過熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)miR-3122靶向CMTM5的3端非編碼區(qū)(P<0.05)，見圖4A。同時，過表達miR-3122后，CMTM5的mRNA水平和蛋白水平均下降(P<0.05)，而敲低miR-3122后，CMTM5的mRNA水平和蛋白水平均上升(P<0.05)，見圖4B,圖4C和圖4D。

2.4 miR-3122靶向CMTM5調(diào)控口腔鱗癌細胞GNM凋亡

同時敲低miR-3122和CMTM5時，口腔鱗癌細胞GNM凋亡水平無顯著變化(P<0.05)，見圖5A；同時過表達miR-3122和CMTM5時，口腔鱗癌細胞GNM凋亡水平無顯著變化(P<0.05)，見圖5B。

3 討論

口腔癌的腫瘤分布廣泛，包括嘴唇、硬腭、上、下牙槽嵴、舌前三分之二、舌下、頰黏膜、臼齒后三角區(qū)和口底[4]。2012年，OSCC在全世界造成14.5萬人死亡[5]。OSCC的發(fā)展阻礙了多模式治療的成功，導(dǎo)致預(yù)后不良和5年生存率低[6]。因此，研究OSCC的發(fā)生發(fā)展的分子機制對治療OSCC是必不可少的。

在本研究中，miR-3122在癌旁組織中的表達水平高于口腔鱗癌組織(P<0.05)。過表達miR-3122后，口腔鱗癌細胞GNM的凋亡水平上升(P<0.05)，而敲低miR-3122后，口腔鱗癌細胞GNM的凋亡水平下降(P<0.05)。提示miR-3122是一個潛在的抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子。

MicroRNAs(miRNAs)是一種短(19-25nt)單鏈非編碼RNA，通常與目標mRNA的3端非編碼區(qū)中的互補序列結(jié)合，并通過隨后招募RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物來抑制其翻譯[7]。由于大于30%的人類基因被預(yù)測受到miRNAs的調(diào)控，這些miRNA控制著所有的細胞的生理和發(fā)育過程[8]。TargetScan,miRcode,miRDB在線分析發(fā)現(xiàn)miR-3122分別潛在靶向69,82,184個基因，三者交集為22個基因。過表達miR-3122后，口腔鱗癌細胞GNM中GCSAM,PSMC4,SKP1,LIAS,SMAD2,ZNF704,CMTM5,STK17A,YWHAQ的表達水平下降(P<0.05)。敲低上述基因后，敲低CMTM5后口腔鱗癌細胞GNM的凋亡水平上升(P<0.05)。盡管敲低除CMTM5外的其他基因并不能引起口腔鱗癌細胞GNM凋亡水平的改變，但是這些基因在OSCC發(fā)生發(fā)展中的生物學功能值得進一步探索。此外，miR-3122靶向CMTM5的3端非編碼區(qū)(P<0.05)。過表達miR-3122后，CMTM5的mRNA水平和蛋白水平均下降(P<0.05)，而敲低miR-3122后，CMTM5的mRNA水平和蛋白水平均上升(P<0.05)。因此miR-3122通過靶向CMTM5的3端非編碼區(qū)來抑制其翻譯。

注：*P<0.05。

注：*P<0.05。

先前的研究表明，CMTM5通過啟動子甲基化作用在許多腫瘤中發(fā)揮抑癌功能，并頻繁發(fā)生表觀遺傳失活[9]。CMTM5位于14q11.2，這是一個包含與多種癌相關(guān)的多個基因的基因座[10]。研究表明，染色體14q11.2上的基因異常會導(dǎo)致各種癌癥的產(chǎn)生或生長，例如鼻咽癌，白血病，膠質(zhì)母細胞瘤，腦膜瘤和口腔鱗癌[11-12]。這些結(jié)果表明CMTM5在致癌作用中具有重要作用。本研究同時敲低miR-3122和CMTM5時，口腔鱗癌細胞GNM凋亡水平無顯著變化(P<0.05)；同時過表達miR-3122和CMTM5時，口腔鱗癌細胞GNM凋亡水平無顯著變化(P<0.05)。因此，可以通過體外合成miR-3122 mimics，再通過合適的呈遞方式將miR-3122 mimics運送到口腔鱗癌組織中可能起到緩解或治療OSCC的效果。

注：*P<0.05。

綜上所述，miR-3122通過靶向CMTM5 mRNA的3端非編碼區(qū)后，降解了CMTM5的mRNA并降低了CMTM5的蛋白水平，隨后促進了口腔鱗癌細胞GNM的凋亡。