其麗木格, 鄂 勇, 烏云達來, 李玉玲

(1.內(nèi)蒙古師范大學 生命科學與技術(shù)學院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022;2.內(nèi)蒙古莫力達瓦達斡爾族自治旗人民醫(yī)院,內(nèi)蒙古 莫力達瓦旗 162850)

體型是人體骨骼、肌肉、體脂、身材等的綜合反應,對青少年的生理機能、運動素質(zhì)、心理情感、社會適應性發(fā)展及職業(yè)選擇意向都有一定影響[1-2]。圍度、身高及體重等測量指標,可從不同角度反映骨骼、脂肪的發(fā)育狀況,而由各原始測量指標衍生的許多指數(shù)還可以綜合反映身體各部位的比例和體型發(fā)育狀況[2]。身高、體重作為我國學生最基礎的指標在相關研究中一直廣受重視,由其衍生的身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)主要反映體型的胖瘦程度,間接反映營養(yǎng)狀況,是目前國際上最廣泛的一種評價肥胖的方法[3]。腰臀比(waist-hip ratio,WHR)是腰圍與臀圍的比值,可反映體內(nèi)多余脂肪的分布特征。研究提示：腰圍、WHR能很好地評價中心性肥胖[2]。近年來,隨著人們生活水平的提高及生活方式的改變,肥胖已成為主要公共衛(wèi)生問題。因此,與之相關的BMI、WHR在肥胖篩查中有著重要意義。

賈娜等[4]對66對7～16歲雙生子研究發(fā)現(xiàn),身高、體重的遺傳度分別為0.84、0.77,提示身高、體重主要受遺傳因素影響。Lise等[5]對加拿大、瑞典、丹麥和澳大利亞地區(qū)的3～19歲雙生子研究發(fā)現(xiàn),身高(0.40～0.95)、體重(0.48～0.94)和BMI(0.45～0.91)等指標的遺傳度受遺傳與環(huán)境的共同影響。張棟等[6]利用MX軟件對11～19歲雙生子的腰圍和腰臀比遺傳度的研究發(fā)現(xiàn),青島市青少年雙生子腰圍遺傳度為0.08,WHR遺傳度為0.53,提示腰圍主要受環(huán)境因素的影響,腰臀比則與遺傳、環(huán)境因素相關。D?ring等[7]研究發(fā)現(xiàn),兒童腰圍發(fā)育以及肥胖程度與家長的飲食習慣密切相關,超重或肥胖的兒童成年后肥胖的風險更大,提示對兒童早期的環(huán)境干預是預防成年期肥胖的關鍵。因此,深入了解兒童體型相關指標的發(fā)育及其影響因素,對體型發(fā)育以及肥胖預防都具有重要意義。

目前,關于體型與肥胖相關基因的研究也日益受到重視。多巴胺是主要的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì),控制著運動、認知、攝食、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等多種功能[8-9]。根據(jù)多巴胺受體基因結(jié)構(gòu)及藥理性將其分為D1類和D2類受體兩個大家族：D1類家族包括D1和D5受體亞型,D2樣家族包括D2、D 3和D4受體亞型。目前國內(nèi)外關于多巴胺D2受體基因(dopamine D2 receptor,DRD2)和多巴胺D4受體基因(dopamine D4 receptor,DRD4)與體型指標相關的研究較多,而多巴胺D 3受體基因(dopamine D 3 receptor,DRD3)的相關研究則相對較少。DRD3位于3q13.3,主要存在于伏隔核和紋狀體[10],其序列變異可能引起受體結(jié)構(gòu)或表達的細微改變,從而導致不同的表型。研究發(fā)現(xiàn),DRD3基因的變異可能會引起多巴胺敏感性改變,進而導致與進食相關的愉悅感降低[11]。Berridge[12]研究發(fā)現(xiàn),投射到腹側(cè)紋狀體伏隔核的中腦多巴胺神經(jīng)元與食物和藥物獎勵密切相關,有可能影響所消耗的能量。此外,也有研究表明DRD3與藥物及酒精成癮有關[13]。一項研究表明,三種DRD3基因型可以預測注意缺陷多動障礙(attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)癥狀,而ADHD與肥胖率和暴飲暴食癥狀密切相關[14]。Avena等[15]研究發(fā)現(xiàn),一些肥胖人群對糖的渴望類似于藥物成癮,而DRD3被認為在心理刺激的獎勵作用中起著直接作用,因此這一類人的攝食量比普通人更大,從而導致體內(nèi)脂肪堆積,一定程度上導致肥胖。目前關于多巴胺與身心發(fā)育有關的研究受到廣泛的關注[16-17],但在國內(nèi)外研究中還未發(fā)現(xiàn)DRD3基因多態(tài)性與體型相關指標的研究,有些機制還需進一步研究。

本文擬以雙生子兒童為研究對象,在分析各指標遺傳度基礎上,以DRD3基因SNP為遺傳標記,初步探討遺傳因素對兒童體型相關指標的影響,提供分子生物學資料,為今后深入分析其影響因素奠定基礎。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

在父母及學生知情同意情況下,以學校為單位,在呼和浩特市和包頭市募集160對4～12歲雙生子。每對雙生子均共同生活,就讀于同一所學校,身體健康。其中同卵雙生子(monozygotic,MZ)68對,男34對,女34對; 異卵雙生子(dizygotic,DZ)92對,均為同性別雙生子,其中男44對,女48對。為了解不同發(fā)育期對各體型相關指標的遺傳效應的影響,本文在分析遺傳度時將4～12歲雙生子兒童分為學齡前期(4～6歲)和學齡期(7～12歲)兩個年齡組。

1.2 研究方法

1.2.1 體型相關測量指標 依據(jù)《人體測量方法》[3]測量各項指標,測量前統(tǒng)一標準,并保證每對雙生子的測量在同一時間段內(nèi)完成,包括身高、體重、腰圍、臀圍4項體型指標。根據(jù)體格原始測量指標計算身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)和腰臀比指數(shù)(WHR),公式分別為IBM=(M/H2)×104和RWH=(W/C)×100。其中,M為體重(kg),H為身高(cm),W為腰圍(cm),C為臀圍(cm)。

1.2.2 全基因組DNA提取 使用一次性口腔拭子刮取雙生子口腔上皮細胞,利用TIANamp Swab DNA Kit(TIANGEN BIOTECH,Beijing,China)試劑盒提取全基因組DNA。

1.2.3 卵型鑒定 利用Amp FISTR Sino filerPlus試劑盒(PE Applied Biosystems Inc,Perkin Elmer,Foster City,CA,USA)對16個STR位點(D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D 3S1358、D12S391、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、D6S1043、D5S818、D18S51、FGA、性別鑒定Amelogenin)的一致性進行鑒定。

1.2.4DRD3基因單核苷酸多態(tài)性檢測 采用SNaPshot技術(shù)測定4個SNPs位點基因型。利用Pre-mier 3.0 設計SNP位點的上下游引物; 應用PTC-100PCR儀對每個SNP位點進行擴增; 采用SNaPshot SNP分型技術(shù)進行SNP分型; 在1個含有測序酶、4種熒光標記的ddNTP、在鄰近SNP位點5’端的不同長度延伸引物和PCR產(chǎn)物模板的反應體系中,引物延伸一個堿基即終止,經(jīng)3730xl型測序儀測序,根據(jù)峰的顏色可知摻入堿基的種類,從而確定樣本的基因型,根據(jù)峰的移動位置可確定該延伸引物對應的SNP位點。

1.2.5 統(tǒng)計分析方法 采用Epidata 3.0錄入數(shù)據(jù),雙核查邏輯檢錯。使用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0進行統(tǒng)計處理; 兩類雙生子各指標性別間差異性由獨立樣本t檢驗完成。對各指標進行正態(tài)性檢驗,對不符合正態(tài)分布的體重、腰圍、臀圍、WHR、BMI進行對數(shù)(lgx)轉(zhuǎn)換。根據(jù)最大似然法原理,采用MX軟件擬合最佳結(jié)構(gòu)方程模型,估算遺傳度。用GEE模型分析DRD3基因單核苷酸多態(tài)性與雙生子兒童體型指標的相關性。使用Haploview 4.2進行連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)檢驗。同卵雙生子、同性別異卵雙生子對內(nèi)方差和對間方差齊性檢驗用F檢驗,組內(nèi)相關系數(shù)檢驗用Z檢驗。相關公式如下:

2 結(jié)果

2.1 各指標對內(nèi)方差、對間方差及組內(nèi)相關系數(shù)比較

矯正年齡后,同性別雙生子各指標對內(nèi)方差、對間方差以及組內(nèi)相關系數(shù)比較發(fā)現(xiàn),男、女各指標的對內(nèi)方差均為MZ>DZ,男、女各指標均存在顯著差異(P<0.05),如表1所示。男、女各指標的組內(nèi)相關系數(shù)均為rMZ<2rDZ,提示結(jié)構(gòu)方程模型分析時可擬合ACE模型[2]。

表1 4～12歲男、女生雙生子兒童各指標對內(nèi)、對間方差及組內(nèi)相關系數(shù)比較

2.2 不同發(fā)育期雙生子兒童體格指標遺傳度分析

運用MX軟件進行模型擬合,結(jié)果如表2所示。4～12歲男、女兩類雙生子各指標最佳模型均為ACE模型,擬合優(yōu)度(P>0.05)均較好,表明學齡雙生子兒童體型相關指標受遺傳與環(huán)境的共同影響。其中,身高、學齡前期BMI、學齡前期腰圍、學齡期臀圍、學齡期WHR擬合的最佳模型為模型VI,男、女遺傳度相等,但男性共同環(huán)境效應為女性的k倍(cm=kcf); 體重、學齡期腰圍、學齡前期WHR最佳模型為模型IV,男、女共同環(huán)境效應相等(cf=cm); 學齡期BMI、學齡前臀圍的最佳模型為模型II,不存在男孩特異的加性遺傳方差(a’m=0)。

結(jié)果顯示(表2),女生除臀圍(學齡前0.22,學齡期0.72)外,其余各指標遺傳度均為學齡前期高于學齡期; 男生各指標遺傳度均為學齡前期高于學齡期。學齡前期男生臀圍(0.86)、WHR(0.71)遺傳度分別高于女生學齡前期臀圍(0.22)、WHR(0.51),學齡期男生體重(0.70)、腰圍(0.54)等指標遺傳度高于女生學齡期體重(0.47)、腰圍(0.27); 其余指標在同發(fā)育階段遺傳度男女相等。

表2 兩個發(fā)育期體格指標及衍生指標的最佳模型

2.3 DRD 3基因SNP與雙生子兒童體型指標相關性分析

采用廣義估計方程模型分析DRD3基因SNP與體型相關指標的相關性。為避免樣本流失,將一對雙生子設為重復測量數(shù)據(jù),其中主體變量為編號,主體內(nèi)變量為出生順序,選擇Unstructured工作相關矩陣,分別以雙生子體格指標為因變量,以基因型為自變量,選擇Linear分析方法進行分析,結(jié)果見表3。

結(jié)果顯示,DRD3基因4個SNP與BMI無相關性(P>0.05)。體重分別與rs167771、rs226082存在相關(P<0.05),rs167771攜帶G等位基因個體的體重值高于AA基因型的個體,rs226082攜帶C等位基因個體的體重值高于TT基因型的個體; 身高與rs324029存在相關(P<0.05),rs324029攜帶G等位基因個體的身高值低于AA基因型的個體; 腰圍與rs167771存在相關(P<0.05),rs167771攜帶GG基因型個體的腰圍值低于攜帶A等位基因的個體; 臀圍與rs226082存在相關(P<0.05),CT基因型個體的臀圍值高于CC基因型和TT基因型等純合子個體; WHR分別與rs324029、rs167771、rs226082存在相關(P<0.05),rs324029的AA基因型個體WHR值高于攜帶G等位基因的個體,rs167771攜帶A等位基因個體的WHR值高于GG基因型的個體,rs226082的CC基因型個體的WHR值低于攜帶T等位基因的個體。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)rs2134655與六個指標均無相關關系。

2.4 DRD 3基因4個SNPs位點連鎖不平衡分析

根據(jù)DRD3基因多態(tài)性4個SNP位點的位置分布情況,使用Haploview分析軟件計算等位基因的連鎖不平衡系數(shù)D′、r2,檢驗基因的連鎖強度。當D′和r2的取值為0時,表示位點間連鎖達到完全平衡; 當D′和r2的值越接近于1,表示越趨于連鎖不平衡; 當D′和r2的值等于1時,表示位點間連鎖完全不平衡。連鎖不平衡系數(shù)D′以描述LD水平,相關程度系數(shù)(r2)值以反映兩位點關聯(lián)的顯著性水平,根據(jù)文獻分別將其定為r2>0.8且D′>0.7進行連鎖不平衡分析[18-19]。

表3 DRD 3基因多態(tài)性與雙生子兒童體型相關指標的相關性分析

續(xù)表3 DRD 3基因多態(tài)性與雙生子兒童體型相關指標的相關性分析

圖1 4～12歲雙生子兒童DRD 3受體基因SNPs不平衡圖

結(jié)果顯示(圖1),rs2134655與rs167771之間為(D′=1.0,r2=0.045),rs167771與rs226082之間為(D′=0.097,r2=0.001),rs226082與rs324029之間為(D′=0.578,r2=0.286),rs2134655與rs226082之間為(D′=0.436,r2=0.022),rs2134655與rs324029之間為(D′=0.741,r2=0.061),rs167771與rs324029之間為(D′=0.146,r2=0.009),表明本研究中4個SNP間連鎖強度較弱。

3 討論

雙生子研究是闡明遺傳與環(huán)境因素對人類表型相對效應的最佳方法,用MX軟件擬合最佳模型估算遺傳度,能更加充分利用雙生子資料,使結(jié)果更加精確[2]。有研究發(fā)現(xiàn),體格指標的遺傳效應存在一定的性別、年齡或發(fā)育期及族群差異[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn),男、女生體重、腰圍、臀圍、WHR等指標的遺傳度存在一定性別差異,且男生的遺傳度多數(shù)高于女生,女生更易受環(huán)境因素的影響; 除女生臀圍外,其余各指標男女遺傳度均為學齡前期高于學齡期,提示兒童不同發(fā)育期體型相關指標受遺傳與環(huán)境因素影響程度不同。

李小燕等[22]采用Holzinger的改良遺傳度計算法(h2)對合肥市60對4～14歲兒童的研究發(fā)現(xiàn),身高遺傳度0.71,體重遺傳度0.54,與本次研究中學齡期兒童身高遺傳度一致,而體重遺傳度與本研究中女生遺傳度較接近,而與男生差異較大。張棟等[23]利用MX軟件對青島11～19歲雙生子兒童少年遺傳度計算發(fā)現(xiàn),BMI遺傳度男女均為0.75,略高于本研究中學齡期兒童的BMI遺傳度,造成該結(jié)果可能與本研究分性別計算遺傳度有關。欒天抒等[24]采用MX軟件對內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市和包頭市3～6歲雙生子兒童的研究發(fā)現(xiàn),腰圍遺傳度(男生0.77、女生0.72)略低于本文學齡前兒童的研究結(jié)果,臀圍遺傳度(男生0.49、女生0.62)與本研究略有差異,這可能與樣本構(gòu)成有關,本研究中不包含異性別異卵雙生子。Lee等[25]對青島、麗水成年雙生子的研究發(fā)現(xiàn),腰圍的遺傳度(0.75)和WHR的遺傳度(0.61)與本研究結(jié)果均有不同,可能與兩個樣本的年齡構(gòu)成不同有關。金佰明等[26]采用Holzinger改良遺傳度計算法對齊齊哈爾市25周歲及以上雙生子的研究發(fā)現(xiàn),WHR遺傳度為0.42,與本研究中學齡期兒童WHR的遺傳度一致。季成葉[27]指出,遺傳度只是一個描述性統(tǒng)計量,不同群體有不同遺傳度,同一群體在不同生長發(fā)育期遺傳度也不同,遺傳度還受種族、族群、地區(qū)影響?？傮w而言,本研究中多數(shù)體型相關指標的遺傳度與國內(nèi)外同年齡段的相關研究結(jié)果接近,但與成年人的研究結(jié)果差異較大,提示年齡或發(fā)育期可能是影響遺傳度的因素之一。

本研究初步發(fā)現(xiàn),體重分別與rs167771、rs226082存在相關,身高與rs324029存在相關,腰圍與rs167771存在相關,臀圍與rs226082存在相關,WHR分別與rs324029、rs167771、rs226082存在相關; 而BMI與本研究探討的DRD3基因各SNP均無相關性。多巴胺是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要神經(jīng)遞質(zhì),可以通過中腦邊緣獎勵機制調(diào)節(jié)食物攝取量。DRD3在伏隔核與紋狀體內(nèi)大量表達,這個區(qū)域與獎勵、成癮與行為密切相關,有研究表明DRD3與暴飲暴食癥有關聯(lián)。這一類人對食物有著沖動行為[28],一些肥胖人群特別是暴食癥患者,可能會對影響健康的美味食物產(chǎn)生不健康的依賴,從而產(chǎn)生食物成癮[14]。有研究表明,某些人感覺尋求的改變與DRD3基因rs167771的變異有關[29]。關于DRD3基因與食物攝入的報道較多,但與體型相關指標直接相關的研究尚未發(fā)現(xiàn)。

本研究以學齡前及學齡雙生子為研究對象,報道了4～12歲兒童體型相關指標的遺傳度,初步探討了DRD3基因4個SNP對各指標的影響,研究結(jié)果對于深入了解雙生子兒童體型發(fā)育特點,以及遺傳與環(huán)境因素的相對效應具有一定的理論意義,也可為兒童制定肥胖預防措施、改善兒童飲食行為等研究提供一定科學依據(jù)。