張娟 岳衛(wèi)華

0 引言

銀是一種古老的抑菌劑，具有廣譜、抗菌性強、耐藥性低、使用安全等優(yōu)點，屬于非藥物類物理抑菌劑[1]。銀離子的抑菌機制主要有以下兩種理論：

(1)接觸反應(yīng)機制。銀離子到達(dá)病原菌表面時，依靠庫侖引力穿透細(xì)胞壁進(jìn)入胞內(nèi)，干擾電子傳輸系統(tǒng)，破壞細(xì)胞內(nèi)酶活性，凝固細(xì)胞蛋白質(zhì)，破壞DNA分子等，導(dǎo)致病原菌細(xì)胞功能障礙而死亡[2]。

(2)催化反應(yīng)機制。銀離子具有催化活性中心的作用，能通過激活水或空氣中的氧元素，產(chǎn)生羥基自由基及活性氧離子，活性氧離子能在短時間內(nèi)破壞微生物的增殖能力，致使微生物細(xì)胞死亡[3]。目前，含銀離子抑菌醫(yī)療器械產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于臨床，在口腔護(hù)理、皮膚護(hù)理、預(yù)防導(dǎo)管相關(guān)感染等方面都具有良好的效果[4]。

隨著我國老齡化的加劇，導(dǎo)尿管使用量急劇增多，尿路感染發(fā)生率也呈逐年上升趨勢，如何減少尿路感染已成亟待解決的嚴(yán)峻問題。在預(yù)防留置尿管相關(guān)感染方面，研究發(fā)現(xiàn)銀離子涂層導(dǎo)尿管對預(yù)防尿路感染具有很好的臨床效果。田朝霞等[5]采用銀離子親水涂層的導(dǎo)尿管對實驗組患者進(jìn)行留置導(dǎo)尿，對照組采用普通導(dǎo)尿管，結(jié)果顯示實驗組患者泌尿道感染的發(fā)生率明顯降低。黃慧敏[6]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用活性銀離子抗菌凝膠外涂潤滑導(dǎo)尿管后預(yù)防留置尿管相關(guān)尿路感染是簡單有效的方法。

銀離子水凝膠涂層導(dǎo)尿管是一種具有抗菌功能的改良導(dǎo)尿管，其設(shè)計原理是在普通導(dǎo)尿管基礎(chǔ)上實施抑菌涂層處理，涂層的主要成分是具有高度活性的含銀化合物，在人體內(nèi)留置于尿道后可持續(xù)釋放出具有抗菌活性的銀離子，以期延緩致病菌生物膜形成或加速其分解，旨在減少尿路感染的發(fā)生率。按照我國《醫(yī)療器械分類及管理辦法》，對于具有抗菌作用的功能性導(dǎo)尿管，歸為三類醫(yī)療器械管理，對其臨床試驗、生物安全性能以及抑菌性能評價提出了更高的要求。

目前對于銀離子涂層導(dǎo)尿管體外抑菌效力的研究主要有以下兩種方法：采用抑菌環(huán)法進(jìn)行抑菌效果的定性表征[7-8]，采用表面抑菌試驗對抑菌效力進(jìn)行定量分析[8-9]。鑒于銀離子的抑菌作用，在對其抑菌效力進(jìn)行定量測定時，應(yīng)采用適宜的方法消除或中和其抑菌活性，并對其微生物計數(shù)方法進(jìn)行方法適用性試驗，以保證計數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確和有效。由于目前尚無對銀離子涂層導(dǎo)尿管抑菌效力定量檢查中的微生物計數(shù)方法進(jìn)行適用性驗證的相關(guān)文獻(xiàn)報道，本文擬依據(jù)《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版(四部通則1105)，通過方法適用性試驗，針對銀離子水凝膠涂層導(dǎo)尿管抑菌效力檢查建立一種科學(xué)可行的微生物計數(shù)方法。

據(jù)文獻(xiàn)報道，臨床尿路感染的病原菌種類主要為大腸埃希菌，此外也存在由葡萄球菌、假單胞菌、念珠菌等病原菌導(dǎo)致的感染[10-11]。本文選取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌等臨床常見感染菌株，采用經(jīng)適用性驗證的微生物計數(shù)方法，依據(jù)《中國藥典》2015年版(四部通則1121)對銀離子水凝膠涂層導(dǎo)尿管進(jìn)行抑菌效力的定量檢查，可為該類產(chǎn)品的抑菌效力定量檢查提供方法參考。

1 檢測方法

根據(jù)《中國藥典》2015年版“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”(四部通則1105)的規(guī)定，在對產(chǎn)品進(jìn)行微生物計數(shù)時應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗，向供試液中加入特定試驗菌并對各試驗菌逐一進(jìn)行微生物回收試驗并計算回收率。對于具有抑菌活性的產(chǎn)品，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾等多種方式處理以消除產(chǎn)品的抑菌作用。根據(jù)《中國藥典》2015年版抑菌效力檢查法(四部通則1121)的規(guī)定，微生物計數(shù)方法適用性試驗中當(dāng)微生物回收率不低于70%時，可認(rèn)為通過該計數(shù)方法得到的計數(shù)結(jié)果是準(zhǔn)確有效的，本文采用中和劑和薄膜過濾法聯(lián)合使用的方式對供試液進(jìn)行處理并進(jìn)行微生物回收試驗，建立適用于銀離子水凝膠涂層導(dǎo)尿管的微生物計數(shù)方法，并照此建立的方法進(jìn)行抑菌效力定量檢查中存活菌數(shù)的測定。

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；生化培養(yǎng)箱(33℃，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；生化低溫培養(yǎng)箱(23℃，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；立式滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)；微生物過濾系統(tǒng)(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司)；渦旋振蕩器(德國WIGGENS公司)。

1.1.2 測試樣本

銀離子水凝膠涂層導(dǎo)尿管(型號：三腔氣囊；規(guī)格：22Fr 30 mL；批號：1903201、1903202、1903203，由企業(yè)提供)。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基TSA、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基SDA(北京陸橋技術(shù)股份有限公司，規(guī)格250 g/瓶，培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果均符合中國藥典2015年版的要求)；磷酸鹽緩沖液PBS(北京三藥科技開發(fā)公司，規(guī)格100 mL/瓶)；D/E中和肉湯(美國BD公司，規(guī)格500 g/瓶)；0.9%無菌氯化鈉溶液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格100 mL/瓶)。

1.2 試驗菌株

金黃色葡萄球菌[ATCC6538]、銅綠假單胞菌[ATCC9027]、大腸埃希菌[ATCC8739]、表皮葡萄球菌[ATCC12228]、白色念珠菌[ATCC19404]，均由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供，工作菌株均為第3代。

1.3 檢測內(nèi)容及測試方法

1.3.1 微生物計數(shù)方法適用性試驗

(1)菌液制備：接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24 h；接種白色念珠菌至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，23℃培養(yǎng)48 h；用0.9%無菌氯化鈉注射液制成每0.1 mL含菌數(shù)小于100 cfu的菌懸液。

(2)供試液制備：采用無菌操作的方法截取銀離子水凝膠涂層導(dǎo)尿管，剪成小段置無菌三角瓶中，按照每1 cm2涂層加入0.2 mL PBS緩沖液的比例，加入無菌PBS緩沖液，充分渦旋振蕩后作為供試液，置20～25℃避光貯存。

留置導(dǎo)尿管的臨床使用時間通常較長，本文擬選取1 d、2 d、3 d、7 d、14 d共計5個時間節(jié)點分別對導(dǎo)尿管的抑菌效力進(jìn)行定量分析。由于導(dǎo)尿管涂層被洗脫后銀離子是累積釋放的，因此在微生物計數(shù)方法適用性試驗中，需對避光貯存1 d、2 d、3 d、7 d和14 d的供試液分別進(jìn)行微生物計數(shù)方法的適用性試驗。

(3)試驗各組設(shè)置如下。

試驗組：取 “1.3.1(2)”項下供試液1 mL，加入D/E中和肉湯9 mL，然后加入“1.3.1(1)”項下制備的金黃色葡萄球菌菌液0.1 mL，充分渦旋混合，采用孔徑0.45 μm濾膜全量過濾，用D/E中和肉湯沖洗濾膜，每膜沖洗量為300 mL，每次沖洗量不超過100 mL，取出濾膜貼于相應(yīng)培養(yǎng)基平板上，置規(guī)定溫度培養(yǎng)。銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和表皮葡萄球菌同法操作。每種試驗菌每種培養(yǎng)基平行試驗2次。

供試品對照組：以無菌PBS緩沖液代替試驗菌液同試驗組操作。每種培養(yǎng)基平行試驗2次。

菌液對照組：取無菌PBS緩沖液10 mL，加入“1.3.1(1)”項下制備好的試驗菌液各0.1 mL，同試驗組操作。每種試驗菌每種培養(yǎng)基平行試驗2次。

中和劑對照組：以無菌PBS緩沖液代替供試液同試驗組操作。每種試驗菌每種培養(yǎng)基平行試驗2次。

測定金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和表皮葡萄球菌用TSA培養(yǎng)基，置33℃培養(yǎng)3 d；測定白色念珠菌用SDA培養(yǎng)基，置23℃培養(yǎng)5 d，分別菌落計數(shù)。

(4)回收率計算：試驗組回收率(%)=(試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù))/菌液對照組菌落數(shù)×100%；中和劑對照組回收率(%)=中和劑對照組菌落數(shù)/菌液對照組菌落數(shù)×100%。

1.3.2 抑菌效力檢查

(1)菌液制備：接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和表皮葡萄球菌至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24 h；接種白色念珠菌至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，23℃培養(yǎng)48 h；分別用0.9%無菌氯化鈉注射液制成每0.1 mL含菌數(shù)約5×106～5×107cfu的菌懸液。

(2)供試液接種：采用無菌操作的方法截取銀離子水凝膠涂層導(dǎo)尿管，剪成小段置無菌三角瓶中，加入無菌PBS緩沖液，每1 cm2涂層加入0.2 mL PBS緩沖液，充分振蕩后作為供試液。

取按上述方法制備的供試液10 mL，接種“1.3.2(1)”項下制備的金黃色葡萄球菌試驗菌液0.1 mL，使每1 cm2銀離子水凝膠涂層上的初始接菌量為105～106cfu，每種試驗菌平行接種5份供試液，充分渦旋混合，使供試液中的試驗菌分布均勻，置20～25℃避光貯存。銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌同法操作。

取3個批次供試品平行試驗。

(3)初始接菌量計算：取無菌PBS緩沖液10 mL，接種“1.3.2(1)”項下制備的金黃色葡萄球菌試驗菌液0.1 mL，充分渦旋混合，梯度稀釋后菌落計數(shù)，計算出相當(dāng)于每1 cm2銀離子水凝膠涂層中金黃色葡萄球菌的初始接菌量。銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌同法操作。

(4)存活菌數(shù)測定：在供試液接種試驗菌1d時，分別取“1.3.2(2)”項下接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌的供試液各1份，取適量用無菌PBS緩沖液梯度稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4四個梯度，分別取上述各梯度供試液各1 mL，加入D/E中和肉湯9 mL，采用薄膜過濾法全量過濾，用D/E中和肉湯沖洗濾膜，每膜沖洗量為300 mL，每次沖洗量不超過100 mL，取出濾膜貼于相應(yīng)培養(yǎng)基平板上，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結(jié)果，計算1 mL供試液中各時間點的存活菌數(shù)，并換算成每1 cm2銀離子水凝膠涂層中各時間點的存活菌數(shù)，同時計算抑菌效力(各時間點存活菌數(shù)與初始接菌量lg值的差值)。

供試液接種試驗菌2 d、3 d、7 d、14 d時，分別另取“1.3.2(2)”項下接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌的供試液各1份，存活菌數(shù)測定同法操作。

2 檢測結(jié)果

2.1 微生物計數(shù)方法適用性

微生物計數(shù)方法適用性試驗中試驗菌回收率測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明，對20～25℃避光貯存1 d、2 d、3 d、7 d和14 d的供試液分別進(jìn)行方法適用性試驗并測定試驗菌回收率，在3次平行試驗中，試驗組的試驗菌回收率均大于70%，中和劑對照組的試驗菌回收率均大于70%，說明銀離子的抑菌活性已被有效中和，銀離子抑菌性對微生物計數(shù)結(jié)果的影響已被有效消除，表明該試驗條件下D/E中和肉湯的有效性和對微生物無毒性，由此得出的計數(shù)結(jié)果是準(zhǔn)確有效的。因此，該計數(shù)方法經(jīng)驗證適用于銀離子水凝膠涂層導(dǎo)尿管的微生物計數(shù)，可照此微生物計數(shù)方法進(jìn)行銀離子水凝膠涂層導(dǎo)尿管抑菌效力檢查中存活菌數(shù)的測定。

表1 試驗菌回收率測定結(jié)果(單位：%)

2.2 抑菌效力

抑菌效力試驗中各試驗菌存活菌數(shù)測定結(jié)果見表2，抑菌效力計算結(jié)果見表3。由結(jié)果可知，與初始接菌量相比，作用1 d時，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和表皮葡萄球菌的存活菌數(shù)減少的lg值均可達(dá)到2，相當(dāng)于抑菌率達(dá)到98%；3 d時金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和表皮葡萄球菌的存活菌數(shù)均小于1 cfu/cm2，7 d時銅綠假單胞菌存活菌數(shù)小于1 cfu/cm2，減少的lg值均大于5，相當(dāng)于抑菌率達(dá)到99.9%以上，14 d時存活菌數(shù)均未增加。

表2 存活菌數(shù)測定結(jié)果

表3 抑菌效力計算結(jié)果(lg值)

作用1 d時，白色念珠菌減少的lg值可達(dá)到1，相當(dāng)于抑菌率可達(dá)到90%；2 d時減少的lg值達(dá)到1.5，相當(dāng)于抑菌率可達(dá)到96%；3 d時減少的lg值達(dá)到2.5，相當(dāng)于抑菌率可達(dá)到99.7%；7 d時減少的lg值可達(dá)到2.8，相當(dāng)于抑菌率可達(dá)到99.8%；14 d時減少的lg值相較7 d時變化不明顯。雖然對白色念珠菌的抑菌作用稍差于其余4種菌，但抑菌率仍然能達(dá)到99%以上。

由此可見，導(dǎo)尿管水凝膠涂層中釋放的銀離子對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌均具有較好的抑制作用，而且抑菌作用持續(xù)時間可達(dá)到14 d。

3 討論

微生物計數(shù)法是用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計數(shù)。根據(jù)《中國藥典》微生物計數(shù)法(四部通則1105)的規(guī)定，當(dāng)供試品具有抑菌活性時，在對其進(jìn)行微生物計數(shù)時應(yīng)盡可能去除或中和，通常采用的方法有培養(yǎng)基體積、加入適宜的中和劑或滅活劑、采用薄膜過濾法或上述幾種方法的聯(lián)合使用。銀離子具有較強的抑菌性，因此對于含銀離子的供試品進(jìn)行計數(shù)時，應(yīng)首先進(jìn)行微生物計數(shù)方法適用性試驗。

本文選取中和劑和薄膜過濾法聯(lián)合使用的方法。D/E中和肉湯是一種特別的中和培養(yǎng)基，含有多種中和劑成分，例如硫乙醇酸鈉、硫代硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、卵磷脂、吐溫80等，可以有效中和多種抑菌物質(zhì)對微生物的抑制和殺滅作用。將供試液與D/E中和肉湯按照一定比例混合后，采用薄膜過濾法過濾，再用適量D/E中和肉湯作為沖洗液對濾膜進(jìn)行沖洗。結(jié)果表明，當(dāng)供試液與D/E中和肉湯按照1∶9比例充分混合并且薄膜過濾，沖洗量為每膜300 mL、每次沖洗量不超過100mL時，銀離子的抑菌活性可被有效中和，由此建立了適用于銀離子水凝膠涂層導(dǎo)尿管的微生物計數(shù)方法，并照此方法進(jìn)行該產(chǎn)品抑菌效力檢查中存活菌數(shù)的測定，從而保證了抑菌效力結(jié)果的準(zhǔn)確有效。

銀離子水凝膠涂層導(dǎo)尿管對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌均具有較好的抑菌作用，抑菌率均可達(dá)到99%以上。但是從表2 和表3 的結(jié)果可知，與其余4種細(xì)菌相比，銀離子對白色念珠菌的抑制作用稍差，推測與真菌和細(xì)菌的細(xì)胞組成結(jié)構(gòu)不同有關(guān)，在今后的研究工作中可重點關(guān)注。

4 結(jié)論

采用D/E中和肉湯與薄膜過濾法聯(lián)合使用的方式,建立適用于銀離子水凝膠涂層導(dǎo)尿管的微生物計數(shù)方法，可照此方法進(jìn)行抑菌效力檢查中存活菌數(shù)的測定。本文建立的方法可用于銀離子水凝膠涂層導(dǎo)尿管抑菌效力的定量檢查，并可為具有抑菌作用的功能性導(dǎo)尿管產(chǎn)品的研發(fā)與性能改進(jìn)提供技術(shù)支持，為臨床使用提供數(shù)據(jù)支持，也為其他含銀離子類醫(yī)療器械產(chǎn)品的性能評價提供方法參考。